儲(chǔ)俐，曹文富，馬素紅

干眼（dry eye）是指任何原因引起的淚液質(zhì)或量異常，或動(dòng)力學(xué)異常導(dǎo)致的淚膜穩(wěn)定性下降，并伴有眼部不適和（或）眼表組織損害為特征的多種疾病的總稱[1]。嚴(yán)重干眼者可引起視力明顯下降從而影響其正常的工作和生活，甚至導(dǎo)致失明。我國(guó)社區(qū)人群流行病學(xué)資料[2]顯示，北京市4,439名40歲及以上人群干眼的患病率為21%，隨著電腦、智能手機(jī)等電子產(chǎn)品的普及，干眼的發(fā)病趨勢(shì)逐年增加。研究[3-5]表明，眼表黏蛋白與干眼的發(fā)病密切相關(guān)。因此，改善眼表黏蛋白的表達(dá)成為治療干眼的又一研究熱點(diǎn)。根據(jù)中醫(yī)取類比象法推測(cè)，以黏蛋白1（mucin 1，MUC1）為代表的眼表黏蛋白，其固攝、防疫等生物學(xué)功能類似中醫(yī)“衛(wèi)氣”生理功能。本研究采用黏蛋白缺乏家兔干眼模型[6]，應(yīng)用黃芪免煎顆粒對(duì)兔干眼模型進(jìn)行干預(yù)，觀察益衛(wèi)固表藥物黃芪對(duì)其淚液及角膜、結(jié)膜MUC1 蛋白表達(dá)的影響情況，為干眼的中醫(yī)藥治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年家兔30只，購(gòu)買于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（渝）2019-0001]，雌雄各半，體重（2.1～2.5 kg），實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)14 d后稱重，按雌雄及體重大小編號(hào)。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定，由重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理審查委員會(huì)獲批（倫理審批號(hào)：JLZYLL201832）。

1.2 藥品、試劑與儀器

黃芪免煎顆粒（一方顆粒醫(yī)藥股份有限公司，1093173），抗兔MUC1單抗（美國(guó)Abcam公司，ab104978），酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（廈門科順生物公司，KS16918），中強(qiáng)度裂解液（杭州弗德生物公司，F(xiàn)D008），苯扎氯胺（美國(guó)Sigma 公司，63449），第一鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）合成試劑盒、染料法熒光定量試劑盒（日本Takara 公司，D6210A、RR820A），自發(fā)熒光淬滅劑（武漢賽維爾生物科技有限公司，s8030）。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司，CFX96、GelDoc2000），高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma 公司，3K15），分光光度計(jì)（日本Shimadzu 公司，UV-2450），酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek 公司，EON），正置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司，Eclipse C1）。

1.3 建立黏蛋白缺乏兔干眼模型

實(shí)驗(yàn)者為同一人在同一環(huán)境中進(jìn)行。隨機(jī)選取20 只動(dòng)物，按文獻(xiàn)方法[6]建立黏蛋白缺乏兔干眼模型，于每天上午9:00 和晚上9:00，各1 次右眼滴0.1%苯扎氯銨2 滴，余下10 只動(dòng)物于同一時(shí)間右眼以0.9%氯化鈉注射液滴眼2 滴，連續(xù)28 d。28 d 后對(duì)造模動(dòng)物進(jìn)行淚液分泌試驗(yàn)（schirmerⅠtest，SⅠT），淚膜破裂時(shí)間（tear film break-up time，BUT）檢測(cè)，及Elisa法檢測(cè)淚液MUC1表達(dá)情況。當(dāng)SⅠT＜10 mm/5 min、BUT＜10 s、淚液MUC1表達(dá)較對(duì)照組動(dòng)物減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則視為造模成功。

1.4 分組與給藥

造模成功的動(dòng)物根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組（model group，MG）和黃芪組（Astragalus membranaceus，AM），另將以0.9%氯化鈉注射液滴眼的10 只動(dòng)物設(shè)為對(duì)照組（control group，CG）。黃芪免煎顆粒1 g相當(dāng)于黃芪飲片5 g，將6 g黃芪免煎顆粒溶于150 mL 的0.9%氯化鈉注射液中，制成濃度為40 mg/mL 口服溶液。根據(jù)兔與人等效劑量換算后，AM 組以黃芪免煎顆?？诜芤? mL/kg 每日灌胃1 次，CG、MG 組灌胃同體積0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)28 d。

1.5 標(biāo)本取材

于實(shí)驗(yàn)第0、28、56 d 在每組家兔右眼結(jié)膜囊內(nèi)滴注0.9%氯化鈉注射液20.0 μL 后，輕拉下瞼結(jié)膜并微壓，用毛細(xì)玻璃管吸取淚液20.0 μL，轉(zhuǎn)移至0.5 mL 離心管，-20℃保存，用于Elisa 檢測(cè)。于實(shí)驗(yàn)第56 d 處死動(dòng)物，剪取右眼角膜，以及12 點(diǎn)鐘處距角膜緣2.0 mm 的球結(jié)膜，大小約為8.0 mm×6.0 mm。角膜和結(jié)膜均于縱行中央一分為二，-80℃保存，用于RT-qPCR及免疫熒光檢測(cè)。

1.6 Elisa檢測(cè)兔淚液MUC1表達(dá)

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，取分裝于0.5 mL 離心管中的淚液，用標(biāo)本稀釋液1∶5稀釋后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作剩余步驟。完成后用酶標(biāo)儀在450 nm 測(cè)定光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為濃度。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)兔角膜、結(jié)膜MUC1基因表達(dá)

剪取組織樣品置于離心管內(nèi)，研磨充分后進(jìn)行震蕩和離心，把離心后的水相層轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入乙醇后混勻，反復(fù)離心，提取RNA。測(cè)定RNA 濃度和純度，然后配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后進(jìn)行RT-qPCR，以β-肌動(dòng)蛋白（β-Actin）為內(nèi)參，引物信息如表所示（表1）。

表1 引物序列

1.8 免疫熒光法檢測(cè)角膜、結(jié)膜MUC1表達(dá)

依次將組織切片經(jīng)過(guò)脫蠟、梯度脫水、抗原修復(fù)、洗滌、血清封閉，然后分別以MUC1 一抗（兔抗，稀釋比例1∶500）和二抗（山羊抗兔，稀釋比例1∶300）孵育，抗熒光淬滅后封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image-Pro plus 6.0 軟件進(jìn)行圖像分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，方差分析進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)淚液MUC1表達(dá)的影響

3 組間干眼兔淚液MUC1 含量，在第0 d 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而在第28、56 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F28d=596.459，F(xiàn)56d=103.269，均P=0.000）。兩兩比較，與CG 組相比，MG 組兔第28 d 和56 d 淚液MUC1 表達(dá)降低（t28d=26.739，t56d=15.268，均P=0.000）；與MG組比較，AM 組兔第56 d淚液MUC1表達(dá)升高（t=8.031，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 3組淚液中MUC1表達(dá)的比較（，ng/mL，n=10）

表2 3組淚液中MUC1表達(dá)的比較（，ng/mL，n=10）

注：* 與CG 組比較，P＜0.05；# 與MG 組比較，P＜0.05；CG 對(duì)照組；MG 模型組；AM 黃芪組；MUC1 黏蛋白1

2.2 對(duì)角膜、結(jié)膜MUC1基因表達(dá)的影響

CG 組MUC1 基因相對(duì)表達(dá)量為（0.99±0.10），MG 組為（0.21±0.08），AM 組為（0.40±0.06），3 組間MUC1 基因表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=254.774，P=0.000）。兩兩比較，與CG 組比較，MG 組MUC1 基因表達(dá)降低（t=19.261，P=0.000）；與MG組比較，AM組MUC1基因表達(dá)升高（t=6.008，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 對(duì)角膜、結(jié)膜MUCI蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，MG 組角膜上皮細(xì)胞周圍和角膜表面可見少量MUC1表達(dá)，AM組角膜上皮細(xì)胞周圍和角膜表面可見密集MUC1 表達(dá)，角膜基質(zhì)層也出現(xiàn)密集表達(dá)（圖1A、1B）。MG 組杯細(xì)胞周圍可見少量MUC1表達(dá)，AM組結(jié)膜表面和杯細(xì)胞周圍可見密集MUC1 表達(dá)，并在結(jié)膜表面集聚（圖1C、1D）。MG 組兔角膜、結(jié)膜MUC1 表達(dá)分別為6.60±2.65、23.35±5.48，AM 組角膜、結(jié)膜MUC1 表達(dá)分別為14.28±4.59、36.47±3.55，與MG 組比較，AM組角膜、結(jié)膜MUC1 表達(dá)均升高（t角膜=4.582，t結(jié)膜=6.354，均P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

眼表黏蛋白與干眼的發(fā)病密切相關(guān)[3-5]。黏蛋白是一個(gè)高分子量的糖蛋白家族，是淚膜的重要組成成分[7]。目前存在于眼表的黏蛋白主要有7種，分別為MUC1、MUC2、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7和MUC16。其中MUC1 是角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞表達(dá)的主要跨膜黏蛋[8-9]。眼表黏蛋白的主要生理功能有：（1）對(duì)淚液的固攝作用，MUC1 的親水端可以吸附淚膜中的水分，在眼表形成一個(gè)厚約500 nm 的細(xì)胞表面多糖與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，對(duì)眼表淚膜形成固攝作用[10]；（2）防御作用，早期的實(shí)驗(yàn)[11]已經(jīng)證實(shí)黏蛋白作為受體能捕捉過(guò)敏原和病原微生物，通過(guò)淚道引流系統(tǒng)把它們從粘膜表面清除掉，人角膜上皮細(xì)胞中的跨膜型黏蛋白的屏障保護(hù)作用阻止了熒光素鈉向眼內(nèi)的滲透[12-13]，在其他粘膜表面黏蛋白也具有同樣的細(xì)胞表面屏障保護(hù)作用[14-15]；（3）細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)作用。MUC1 與細(xì)胞漿內(nèi)肽鏈的酪氨酸殘基磷酸化后，通過(guò)與包含Src同源2片段的蛋白相互作用而發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)作用[16]；同時(shí)其類似表皮生長(zhǎng)因子的片段可以作為配體，調(diào)節(jié)酪氨酸激酶受體2的活性，從而調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)[17]。

《黃帝內(nèi)經(jīng)·靈樞經(jīng)》[18]云：“衛(wèi)氣者，所以溫分肉，充皮膚，肥腠理，司開闔者也?！边\(yùn)用取類比象法，以MUC1為主的眼表跨膜黏蛋白的生物學(xué)功能，如防御、固攝等，類似中醫(yī)“衛(wèi)氣”的生理功能。其通過(guò)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用也類似于氣的基本生理功能（推動(dòng)和氣化作用）。臨床上，筆者的導(dǎo)師在干眼的治療中發(fā)現(xiàn)在經(jīng)驗(yàn)方中加大黃芪的用量能更快改善患者的眼部癥狀。黃芪，甘、微溫，是中藥中主要的益衛(wèi)固表藥，在各種中醫(yī)理論著作和本草著作中均有黃芪益衛(wèi)固表的功效論述。例如《藥鑒》[19]云：“黃芪……其用有四：溫分肉而實(shí)腠理，益元?dú)舛a(bǔ)三焦，內(nèi)托陰證之瘡瘍，外固表虛之盜汗?！薄稖罕静荨穂20]述：“東垣云，黃芪、人參、甘草三味，退熱之圣藥也……黃芪補(bǔ)三焦、實(shí)衛(wèi)氣”。《本草匯言》[21]云：“黃芪，補(bǔ)肺健脾，實(shí)衛(wèi)斂汗……”等。歷代醫(yī)家皆認(rèn)為黃芪補(bǔ)益衛(wèi)氣，為益衛(wèi)固表要藥。近代藥理學(xué)研究[22-23]也發(fā)現(xiàn)，黃芪具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗癌、降血脂、降血糖、保肝等作用，在各種氧化應(yīng)激相關(guān)疾病模型中對(duì)心、腦、腎、腸、肝和肺損傷具有一定的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，與CG 組比較，MG 組的角膜、結(jié)膜MUC1 基因和蛋白及淚液MUC1 表達(dá)均降低，表明成功建立兔黏蛋白缺乏型干眼模型。與MG 組比較，AM 組兔角膜、結(jié)膜MUC1 基因、MUC1 蛋白和56 d 淚液MUC1 蛋白表達(dá)均升高，表明黃芪在一定程度上能修復(fù)干眼兔眼表MUC1 基因和蛋白的表達(dá)，同時(shí)改善淚液中黏蛋白的缺乏狀態(tài)，對(duì)干眼起到一定治療作用。這一結(jié)論也在本研究的角膜、結(jié)膜免疫熒光染色定位分析中得到證實(shí)。因此，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪能夠?qū)Ω裳鄣难郾眇さ鞍讚p傷起到一定修復(fù)作用。由前述文獻(xiàn)可以初步推測(cè)，中藥黃芪通過(guò)其補(bǔ)益衛(wèi)氣作用，促進(jìn)了眼表類似“衛(wèi)氣”生物學(xué)功能樣蛋白MUC1 的表達(dá)。其次，多項(xiàng)研究[24-25]已經(jīng)證實(shí)，自身免疫性疾病、眼表過(guò)敏性疾病、眼表感染性疾病等都會(huì)導(dǎo)致眼表黏蛋白表達(dá)的異常而產(chǎn)生干眼。中藥黃芪的藥理研究[22-23]也表明，其具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多靶點(diǎn)作用，能夠改善多種炎癥及免疫損傷。因此，黃芪免煎顆粒對(duì)眼表MUC1的促進(jìn)作用也可能是通過(guò)免疫調(diào)節(jié)及抗炎途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪免煎顆粒能提高家兔干眼模型淚液和角膜、結(jié)膜MUC1的表達(dá)，并促進(jìn)MUC1 蛋白在眼表集聚，從一定程度上修復(fù)干眼眼表黏蛋白損傷，為黃芪在干眼治療中的運(yùn)用提供參考。