吳紫雯，張磊，杜佳倫，林愷，李沭巖，金熙

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是發(fā)病率僅次于糖尿病視網(wǎng)膜病變的常見視網(wǎng)膜血管性疾病，以阻塞靜脈遠(yuǎn)端迂曲擴(kuò)張、阻塞點(diǎn)附近視網(wǎng)膜出血、水腫、滲出為臨床特征[1-2]，可分為視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞和視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞（brach retinal vein occlusion，BRVO）。RVO 的病理過程在于視網(wǎng)膜微血管異常，缺血缺氧致視網(wǎng)膜新生血管（retinal neovascularization，RNV）形成。既往研究[3-5]表明，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）與炎癥因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，特別是腫瘤新生血管的形成中起到了重要作用。RVO 屬于中醫(yī)學(xué)“絡(luò)瘀暴盲”的范疇，為血瘀之證[6]，而通竅活血湯（Tongqiao HuoxueDecoction，TQHX）具有活血化瘀通竅的功效。故本研究通過建立兔BRVO 模型，進(jìn)一步探討TQHX 對(duì)視網(wǎng)膜組織中OPN 和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）以及玻璃體中IL-6、IL-8表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康成年清潔級(jí)新西蘭白兔30 只，雄性，體重2.5～3.0 kg，兔齡12～16 個(gè)月，由上海市海軍特色醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物房提供[許可證號(hào)SYXK（滬）2019-0019]。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)條件符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：PZSHUTCM201030011）。

1.2 試劑、藥品和儀器

重組OPN、IL-6、IL-8 蛋白（上海雅酶生物科技有限公司，QY-H10080、ERB0068、ERB0069），組織蛋白裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（美國(guó)Sigma 公司，PM12046），5%脫脂奶粉（美國(guó)BD 公司，SCQC0008S），OPN、IL-6、IL-8、β-Actin兔抗單克隆抗體一抗（上海雅酶生物科技有限公司，WB0221、WB0124、WB6002、CTS2118S），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（碧云天生物技術(shù)公 司，A0209），兔抗IL-6、IL-8 酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，RB0068F121、RB0069F121），注射用鹽酸替來他明與鹽酸唑拉西泮混合液（法國(guó)維克公司，7T78A）。眼底532 nm 激光治療儀、眼底數(shù)碼相機(jī)和眼底血管造影儀（德國(guó)蔡司公司，532S、VISUCAM）。

TQHX 水煎劑的組成：麝香0.15 g、桃仁3 g、紅花9 g、赤芍3 g、川芎3 g、老蔥5 g、大棗10 g、生姜9 g、黃酒250 mL。取上述飲片，按總體積4 倍量水浸泡30 min，加熱煎煮40 min，濾取煎液；藥渣再加總體積2倍量水煎煮40 min，收集濾液，將2次煎液合并，煎制成濃縮液，標(biāo)記后放置在4℃冰箱冷藏保存。

1.3 兔BRVO模型建立

雙眼散瞳，稱取兔體重，確定麻醉劑量，采用鹽酸替來他明與鹽酸唑拉西泮混合液按照1 mL/kg 進(jìn)行臀部肌肉注射，待兔全麻成功后于兔耳緣靜脈留置頭皮針。將麻醉好的實(shí)驗(yàn)兔置于激光機(jī)前，放置三面鏡觀察眼底情況，找出與視網(wǎng)膜動(dòng)脈相伴行的靜脈，采用激光（波長(zhǎng)532 nm，能量100～200 mw，光斑直徑100～200 μm，曝光時(shí)間0.1～0.2 s）在距離視盤0.5 視盤直徑（papillary diameter，PD）的分支靜脈處光凝。每支血管平均光凝約30點(diǎn)，避開伴行的動(dòng)脈，每只眼選擇視乳頭一側(cè)分支靜脈激光封閉。激光光凝結(jié)束后，立即行眼底熒光血管造影（fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA）檢查，可觀察到視網(wǎng)膜分支靜脈完全阻塞。造模后送回動(dòng)物房飼養(yǎng)，禁水禁食12 h。建模后14 d再行FFA，未見血管再通可視為造模成功。正常對(duì)照兔實(shí)行相同造模的假手術(shù)，但無需進(jìn)行激光封閉，飼養(yǎng)過程完全同造模動(dòng)物一致。

1.4 動(dòng)物分組與喂養(yǎng)

將造模成功的20 只BRVO 兔隨機(jī)分為模型組（model group，MG）和TQHX 組，另將進(jìn)行假手術(shù)的兔設(shè)為對(duì)照組（control group，CG），每組10 只。按照人與兔的等效計(jì)算[7]，得出兔的生藥劑量為2.3 g/kg，給藥劑量則為5.75 g/kg，CG、MG 組灌胃等體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)給藥21 d。

1.5 標(biāo)本采集

給藥21 d 后，過量麻醉處死。立即摘除眼球，顯微鏡下抽取玻璃體，分離視網(wǎng)膜組織，放入EP 管中移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Western Blot檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中OPN、IL-6、IL-8表達(dá)

從視網(wǎng)膜組織中提取蛋白，用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)凝膠、電泳和轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜后分別加入OPN、IL-6、IL-8一抗（兔抗，稀釋比例1∶100）以及內(nèi)參蛋白β-Actin 一抗（兔抗，稀釋比例1∶1,000），4℃孵育過夜。洗滌3 次再加入二抗（山羊抗兔，稀釋比例1∶10,000），室溫孵育40 min，洗滌3 次后化學(xué)發(fā)光顯影并拍照。Alpha View SA 軟件分析目標(biāo)條帶灰度值，目標(biāo)條帶蛋白水平=目標(biāo)條帶灰度值/β-Actin灰度值。

1.7 ELISA檢測(cè)兔玻璃體中IL-6、IL-8表達(dá)

將玻璃體以1,000 rpm 離心20 min，收集上清液。采用ELISA 法檢測(cè)兔玻璃體液中IL-6、IL-8 水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，方差分析進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TQHX對(duì)BRVO兔視網(wǎng)膜OPN、IL-6、IL-8表達(dá)的影響

3 組間BRVO 兔視網(wǎng)膜OPN、IL-6、IL-8 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FOPN=13.170，F(xiàn)IL-6=50.920，F(xiàn)IL-8=48.780，均P=0.000）。兩兩比較，（1）OPN：與CG 組比較，MG 組兔視網(wǎng)膜OPN 表達(dá)升高（t=-6.903，P=0.000）；與MG 組比較，TQHX 組兔視網(wǎng)膜OPN 表達(dá)降低（t=3.479，P=0.003），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）IL-6：與CG 組比較，MG 組兔視網(wǎng)膜IL-6表達(dá)升高（t=-8.006，P=0.000）；與MG組比較，TQHX組兔視網(wǎng)膜IL-6 表達(dá)降低（t=6.971，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）IL-8：與CG 組比較，MG 組兔視網(wǎng)膜IL-8 表達(dá)升高（t=-8.908，P=0.000）；與MG組比較，TQHX 組兔視網(wǎng)膜IL-8 表達(dá)降低（t=5.097，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1、表1）。

2.2 TQHX 對(duì)BRVO 兔玻璃體IL-6、IL-8表達(dá)的影響

3 組間BRVO 兔玻璃體IL-6、IL-8 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FIL-6=12.640，P=0.000；FIL-8=8.816，P=0.001）。兩兩比較，（1）IL-6：與CG 組比較，MG 組兔玻璃體IL-6 表達(dá)升高（t=-4.725，P=0.000）；與MG 組比較，TQHX 組兔玻璃體IL-6 表達(dá)降低（t=3.380，P=0.003），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）IL-8：與CG 組比較，MG 組兔玻璃體IL-6表達(dá)升高（t=-3.899，P=0.001）；與MG 組比較，TQHX 組兔玻璃體IL-8 表達(dá)降低（t=2.328，P=0.032），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 TQHX對(duì)BRVO兔視網(wǎng)膜OPN、IL-6、IL-8表達(dá)的影響（，n=10）

表1 TQHX對(duì)BRVO兔視網(wǎng)膜OPN、IL-6、IL-8表達(dá)的影響（，n=10）

注：*與CG組比較，P＜0.05；#與MG組比較，P＜0.05；CG 對(duì)照組；MG 模型組；BRVO 視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞；TQHX 通竅活血湯；OPN 骨橋蛋白；IL-6 白細(xì)胞介素-6；IL-8 白細(xì)胞介素-8

3 討論

RVO 是一類由于各種原因?qū)е卵軆?nèi)皮受損，血液流變學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)改變的視網(wǎng)膜血管疾病。目前根據(jù)國(guó)內(nèi)研究[8]報(bào)道，RVO的患病率為0.77%～1.6%。關(guān)于RVO的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其中BRVO多與高脂血癥、視網(wǎng)膜動(dòng)脈硬化有關(guān)，上述因素均會(huì)引起靜脈血流變緩，發(fā)生瘀滯或阻塞，使血液回流受阻，導(dǎo)致靜脈高壓，破壞血管通透性，造成缺血缺氧的狀態(tài)[9]。有研究[10-11]報(bào)道，增殖性視網(wǎng)膜病變患者玻璃體內(nèi)OPN 的含量高于非增殖性視網(wǎng)膜病變患者。還有研究[12-13]顯示，在缺氧條件下培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，隨著缺氧時(shí)間的增長(zhǎng)，IL-6 mRNA 的表達(dá)水平增高，推測(cè)長(zhǎng)時(shí)間的缺氧可能刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6；而缺血型RVO 眼內(nèi)房水中IL-8的表達(dá)水平高于非缺血型，推測(cè)在RVO發(fā)生過程中，炎癥因子與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子之間的平衡破壞，新生血管增多，導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血缺氧加重[14-15]。OPN 作為一種可溶性促炎因子，能促進(jìn)炎癥、組織重塑、纖維化及新生血管的形成[16-17]。但是OPN、IL-6、IL-8是否參與RVO的發(fā)生發(fā)展尚不明確。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RVO 的基本病機(jī)為脈絡(luò)瘀阻，血不循經(jīng)，溢于目?jī)?nèi)，其中血瘀是RVO 最突出的病機(jī)。RVO 的致病因素或?yàn)榍橹緝?nèi)傷、肝氣郁結(jié)；或?yàn)楦文I陰虧、肝陽上亢；或?yàn)檫^食肥甘厚味、痰濕內(nèi)生[18]。氣血同源，精血同源，氣為血之帥，血為氣之母，氣滯則津血運(yùn)行受阻，氣不行津，津液凝聚而生痰，阻遏氣機(jī)，使血液無法正常運(yùn)行而形成瘀血，痰瘀互結(jié)，導(dǎo)致眼部功能受損[19]。TQHX 中川芎、桃仁、紅花、赤芍用于活血化瘀，瘀散則血行通暢，并且具有抗凝、抗炎、擴(kuò)血管以及改善微循環(huán)的功能；麝香為君藥，氣味芳香走竄，開通諸竅，活血通絡(luò)；老蔥辛散，通陽入絡(luò)；麝香與大蔥二藥借酒性之行走，散瘀通竅；生姜、大棗調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，以助生化之源。諸藥合用，共奏祛瘀生新，活血通竅之功效，可全面調(diào)理臟腑及陰陽升降功能，以改善視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙[20-21]。因此，本研究從“瘀血”入手，治法以“活血化瘀通絡(luò)”為主，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來探討TQHX 對(duì)兔BRVO 模型中OPN與炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與CG組比較，MG組兔視網(wǎng)膜組織中OPN、IL-6、IL-8的表達(dá)升高，玻璃體中IL-6、IL-8 的表達(dá)也升高，推測(cè)OPN 和IL-6、IL-8 可能參與了BRVO的發(fā)生發(fā)展，并且OPN與IL-6、IL-8之間可能具有相關(guān)性。視網(wǎng)膜在缺血缺氧狀態(tài)下，局部微循環(huán)的改變可能誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生OPN 和IL-6、IL-8，導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)增加。對(duì)BRVO 兔采用TQHX 干預(yù)，TQHX 組與MG 組比較，視網(wǎng)膜組織中OPN、IL-6、IL-8的表達(dá)下降，玻璃體中IL-6、IL-8的表達(dá)水平也下降，推測(cè)TQHX 可以改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，缺血缺氧狀態(tài)緩解后OPN 以及炎癥相關(guān)因子的表達(dá)水平下降。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TQHX 對(duì)BRVO 兔視網(wǎng)膜OPN、IL-6、IL-8 以及玻璃體IL-6、IL-8 的表達(dá)具有抑制作用，能夠改善炎癥反應(yīng)，可為臨床早期防治BRVO提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。