藍淞耀，龔 晗，韋成江，唐 琪，馮 雁，林 源

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科結(jié)直腸肛門病區(qū)，廣西 南寧 530021)

腫瘤是一類以細胞異常增殖為特點的全身性疾病，惡性腫瘤細胞會侵入健康組織，并通過淋巴或循環(huán)系統(tǒng)擴散到身體的其他部位，同時腫瘤細胞可以通過釋放細胞外旁分泌信號來影響微環(huán)境[1]。在目前結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療指南中，手術(shù)治療均有不同程度的肝組織保留[2,3]。為手術(shù)切緣及遠離腫瘤的組織在常規(guī)病理檢測中檢測不到腫瘤細胞，因此被認為是正常組織，但這些細胞是否受到腫瘤組織作用還未有研究進行探討。通過亞細胞層面或基因表達的改變可能揭示其中的變化。因此本研究通過電鏡觀察人肝轉(zhuǎn)移灶標本及小鼠肝轉(zhuǎn)移模型中腫瘤、癌旁、遠癌組織細胞亞結(jié)構(gòu)改變。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序比較小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤的癌旁、遠癌和健康對照小鼠正常肝組織的基因表達差異，評價在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶中，腫瘤細胞對遠癌肝細胞組織的影響及機制。

1 資料與方法

1.1研究對象

1.1.1樣品來源:選擇2019年9月至2020年10月，廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科結(jié)直腸肛門病區(qū)收治的5例結(jié)直腸癌合并肝轉(zhuǎn)移患者的肝轉(zhuǎn)移瘤手術(shù)標本進行研究。入組患者均滿足以下入組標準：①通過纖維腸鏡行結(jié)直腸腫物活檢，活檢病理確診為結(jié)直腸癌并通過術(shù)中病理確診合并肝轉(zhuǎn)移；②術(shù)前通過血清學、影像學檢查排除其他惡性腫瘤、精神疾病、免疫相關(guān)疾?。虎坌g(shù)前未經(jīng)過任何抗腫瘤治療；④術(shù)前術(shù)后均未使用免疫相關(guān)治療藥物；⑤臨床資料完整，依從性良好，簽署知情同意書。手術(shù)后樣本按如下標注進行取材，將距離腫瘤≤1cm的組織定義為癌旁組織，距離腫瘤≥2cm的組織定義為遠癌組織，手術(shù)切緣處為正常組織。取材后樣本用無菌PBS清洗，并立刻用樣本使用3%戊二醛固定后用于電鏡分析。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.2動物模型建立與分組:C57BL/6N小鼠，雌性，6～8周齡(賽業(yè)蘇州生物科技有限公司)。小鼠護理和處理程序委托賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司進行，處理程序經(jīng)廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院動物倫理委員會批準。肝轉(zhuǎn)移模型組小鼠使用脾注射方式接種MC38細胞[4]。正常組小鼠均脾臟注射等劑量PBS。術(shù)后繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)，觀察并記錄小鼠生存狀態(tài)。術(shù)后12～14d后用1.25%三溴乙醇腹腔麻醉，開腹經(jīng)下腔靜脈取血處死，對新鮮肝臟組織進行不同分區(qū)的取材。選取距離可見腫瘤邊緣小于5mm的組織為癌旁組織，大于5mm部位為遠癌組織。同時取正常組小鼠肝臟為正常肝組織對照。將組織分成3份，其中1份用福爾馬林溶液浸泡，用于組織病理學分析；1份用3%戊二醛固定，用于透射電鏡觀察；1份采用液氮冷凍，-80℃低溫冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2電鏡樣本制備與觀察:樣本使用3%戊二醛固定。PBS沖洗3次后，1%鋨酸固定，乙醇-丙酮逐級脫水，丙酮：包埋劑=1∶1浸透組織過夜，純包埋劑包埋，樹脂固定。切片后行鉛鈾染色，在廣西醫(yī)科大學電鏡中心觀察，電鏡型號為日本HITACHI公司H-7650型透射電鏡。

1.3蘇木素-伊紅染色(HE染色)烤片、在二甲苯中脫蠟、依次在100%、95%、85%、75%濃度梯度的酒精中水化，浸入蒸餾水中1min。蘇木素染色30s～1min，TBST返藍；伊紅染色，根據(jù)切片的著色情況滴加蒸餾水沖洗，終止染色。中性樹脂封片。

1.4轉(zhuǎn)錄組測序:取組織50mg，液氮冷凍研磨，溶解蛋白，提取RNA。使用Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA完整性和總量。建庫起始RNA為total RNA，總量≥1μg。采用AMPure XP beads進行建庫。測序采用Illumina NovaSeq 6000進行。以參考基因組(Database version 104.39)和基因模型進行注釋。使用HISAT2 v2.0.5 構(gòu)建參考基因組的索引，并使用HISAT2 v2.0.5 將配對末端clean reads與參照基因組比對。

1.5生信分析:使用DESeq2軟件包(1.20.0)進行組間差異表達基因分析，每組2個樣本重復。使用Benjamini&Hochberg方法校正P值。以|FC|>2且校正adj值<0.05作為顯著差異表達的閾值。使用clusterProfiler(v3.4.4)軟件分析差異表達基因的KEGG通路富集。

2 結(jié) 果

2.1肝轉(zhuǎn)移癌患者的肝內(nèi)遠癌組織細胞亞結(jié)構(gòu)改變:正常肝細胞在電鏡下細胞核呈圓形，胞質(zhì)豐富，有成堆糖原及眾多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[5]。在本研究結(jié)果中，5例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶的肝內(nèi)遠癌組織大部分細胞均出現(xiàn)核渙散的現(xiàn)象，少部分形態(tài)較圓。部分細胞異染色質(zhì)呈斑點狀散在核漿(圖1a1)。腫瘤組織的細胞核仁不明顯，核溶解增多，核質(zhì)邊際濃縮，核周隙變大。部分細胞核膜破裂，核呈碎裂形態(tài)，呈現(xiàn)更不穩(wěn)定狀態(tài)(圖1b1)。遠癌肝細胞中大量線粒體出現(xiàn)形態(tài)改變。線粒體形態(tài)不均一，部分線粒體膨大腫脹，甚至呈空泡狀，線粒體嵴變短變少甚至消失(圖1a2)。與正常細胞相比，遠癌肝細胞內(nèi)大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達、腫脹，并可見大量核糖體分布在腫脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之上(圖1a3)。腫瘤組織的線粒體形態(tài)不規(guī)則，數(shù)目不恒定，多數(shù)線粒體嵴減少或者消失呈空泡狀。細胞內(nèi)少見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖1b2、3)。綜上所述，遠癌組織亞細胞結(jié)構(gòu)中均出現(xiàn)顯著改變，但與癌細胞相比，結(jié)構(gòu)異常程度不同。

圖1 人肝轉(zhuǎn)移病灶電鏡結(jié)果

2.2小鼠肝臟遠癌組織出現(xiàn)與正常肝組織不同的改變:本研究采用小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型進一步驗證遠癌組織中的變化。對比健康對照組小鼠，建模組小鼠的肝臟出現(xiàn)大量的轉(zhuǎn)移病灶，直徑1-2mm為主(圖2a)。HE染色顯示，健康對照組小鼠肝臟與模型組小鼠癌旁>1mm的細胞病理形態(tài)無明顯差異(圖2b)。電鏡分析顯示正常小鼠肝臟細胞亞細胞結(jié)構(gòu)相對完整，細胞膜形態(tài)正常。細胞核圓。細胞內(nèi)可見大量線粒體形態(tài)完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達。細胞內(nèi)容豐富，視野內(nèi)可見大量含脂滴或蛋白質(zhì)空泡樣結(jié)構(gòu)(圖2c)。小鼠遠癌組織中肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相對完整，出現(xiàn)呈異型性的核，異染色質(zhì)向核膜邊緣聚集，邊緣呈鋸齒狀。部分視野中細胞溶解狀態(tài)明顯，可見核溶解、核固縮等凋亡狀態(tài)(圖2d1)。線粒體出現(xiàn)空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相對對照組更為腫脹(圖2d2)。腫瘤組織視野下細胞與細胞之間邊界不清。大部分細胞核仁不明顯，核異型性數(shù)量較多。有些細胞核膜破裂，異染色質(zhì)凝聚在核膜下，核呈碎裂形態(tài)(圖2e1)，線粒體出現(xiàn)空泡化，數(shù)量增多；腫瘤組織中部分線粒體脫髓鞘，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糅合(圖2e2)。小鼠肝轉(zhuǎn)移模型遠癌組織的肝組織細胞亞結(jié)構(gòu)變化與人結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移癌遠癌組織具有一定程度的相似。

2.3遠癌組織中表達譜發(fā)生改變:為探索遠癌組織中基因表達的改變，將小鼠模型肝臟中的遠癌組織、癌旁組織及癌組織、對照組正常肝組織進行了轉(zhuǎn)錄組分分析，以|FC|>2且校正adj值<0.05為標準，分別得到癌組織與正常組織組上調(diào)基因922個、下調(diào)基因546個、癌旁組織與正常組織組上調(diào)基因336個、下調(diào)基因199個、遠癌組織與正常組織組上調(diào)基因2891個、下調(diào)基因826個(圖3a)。對以上各組的上、下調(diào)基因進行KEGG通路富集。癌組織與正常組織比較組、癌旁組織與正常組織比較組中上調(diào)基因有阿米巴遷移、PI3K-Akt信號通路等共同富集通路(圖3b1、2)。遠癌組織與正常組織組相比上調(diào)基因在細胞凋亡、TNF信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等通路上富集(圖3c1)。其中下調(diào)基因主要為：DNA加合物的化學致癌作用、甾類激素生物合成、視黃醇代謝等(圖3c2)。

2.4遠癌、癌旁與癌組織中共同上調(diào)的信號通路:將癌組織與正常組織組、癌旁組織與正常組織組、遠癌組織與正常組織組的上調(diào)基因取交集(圖4a)，將共同的上調(diào)基因進行KEGG通路富集，發(fā)現(xiàn)基因在化學致癌作用、ECM受體相互作用等通路上富集(圖4b、表1)。從共同上調(diào)的基因中選取連接度最大的基因進行互作網(wǎng)絡(luò)分析(圖4c)，可以觀察到連接度較大的基因分布在Col家族(如Col膠原蛋白Col2A)、Bub家族、Kif家族、Jun基因等。

表1 共同富集基因KEGG通路及基因列表

圖2 小鼠轉(zhuǎn)移瘤模型

圖3 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

圖4 遠癌組織、癌旁與癌組織中共同上調(diào)的信號通路

3 討 論

腫瘤可以包括細胞外旁分泌信號等多種不同形式作用與腫瘤微環(huán)境中的不同細胞[1]。過往研究集中在癌對癌旁組織的作用，而對于遠癌組織中的影響研究很少。本研究通過對結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移癌患者及小鼠肝轉(zhuǎn)移動物模型的遠癌組織進行細胞亞結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移癌的遠癌組織病理組織形態(tài)正常的細胞內(nèi)，同樣出現(xiàn)亞細胞結(jié)構(gòu)的改變。而通過表達譜分析，發(fā)現(xiàn)遠癌細胞出現(xiàn)部分與癌細胞相同的細胞通路上調(diào)。

在遠癌肝組織中，呈現(xiàn)出與正常肝組織不一樣的改變，這些改變中的一部分與腫瘤細胞的改變一致，這很有可能是惡性腫瘤在浸潤轉(zhuǎn)移過程中對正常機體的影響和對鄰近細胞的活性誘導所致。對于腫瘤細胞的研究認為，腫瘤細胞非典型的核形態(tài)，與基因組完整性和細胞核亞結(jié)構(gòu)及其功能的變化有關(guān)。遠癌組織中的細胞核異型性明顯，呈正常細胞核形態(tài)的較少。而異型細胞核的增多恰是遠癌組織被腫瘤影響的證據(jù)之一。在許多相關(guān)研究中均發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞基因組和核亞結(jié)構(gòu)及其功能的變化進而導致其表現(xiàn)出非典型的核形態(tài)[6]。腫瘤細胞的核仁增大，染色質(zhì)亦可呈不同的形態(tài)[7]。其次，通過本研究的電鏡觀察可以看到遠癌組織中表現(xiàn)出與腫瘤組織類似的線粒體數(shù)量增多的現(xiàn)象。線粒體可以控制活性氧、癌蛋白和腫瘤代謝物的產(chǎn)生和釋放，調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)、自噬和執(zhí)行細胞死亡，并通過癌細胞內(nèi)部和癌細胞外部機制影響機體新陳代謝[8]。此外，腫瘤細胞在內(nèi)部壓力(如致癌基因的激活)和外部不利環(huán)境信號(如缺氧和營養(yǎng)缺乏)的刺激下，能使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)[9]。腫瘤細胞通過增加蛋白質(zhì)的合成以滿足腫瘤發(fā)生過程中代謝增加的需求。為此增殖的癌細胞需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的快速擴張以分裂并合成足夠的蛋白質(zhì)分配給子細胞[10]。這些相關(guān)報道和本研究中觀察到遠癌組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變的現(xiàn)象相一致。Azizidoost S等通過回顧分析認為，當癌細胞滲入肝臟后會改變肝正常生態(tài)位細胞，肝生態(tài)位中的正常肝細胞會受到異常肝再生和炎癥和纖維化等病理生理因素的影響，進而獲得腫瘤易感性[11]。在本研究中觀察到以上遠癌組織的細胞形態(tài)改變，推測為惡性腫瘤在局部浸潤過程中的活性誘導所致。腫瘤細胞的誘導改變了遠癌組織細胞的亞結(jié)構(gòu)，為新腫瘤形成或原腫瘤在器官內(nèi)的微轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移提供遺傳物質(zhì)、能量和蛋白質(zhì)等先決條件。

腫瘤在局部浸潤和蔓延的過程中大致分為四個步驟：腫瘤細胞間的表面黏著分子減少、與基底膜的黏著增加、正常細胞的細胞外基質(zhì)降解和腫瘤細胞借助阿米巴樣運動移動完成局部浸潤蔓延等生物活動。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因在黏著斑、ECM受體相互作用等通路富集，這一結(jié)果提示了遠癌組織中出現(xiàn)了細胞外基質(zhì)結(jié)果的重塑。同時，在基因互作網(wǎng)絡(luò)中，連接度較高的基因大多參與腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的調(diào)控，如Adamts、Bub1、Col4a1/2、Col5a1、Col6a1等基因在不同的腫瘤研究中被證實分別參與不同的腫瘤相關(guān)信號通路軸的調(diào)節(jié)，促進腫瘤轉(zhuǎn)移并增加了罹患腫瘤的易感性。于此同時，腫瘤細胞在浸潤轉(zhuǎn)移的過程中會產(chǎn)生膠原酶以溶解細胞外基質(zhì)的膠原成分使基底膜形成缺損有利于腫瘤細胞的通過。在本研究中Col3a1基因在遠癌組織中表達上調(diào)。Col3a1可參與編碼Ⅲ型膠原蛋白，該蛋白的過表達能導致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，膠原纖維直徑改變。體現(xiàn)了腫瘤作為一類影響全身的疾病，其對機體的影響遠不止于腫瘤區(qū)域，鄰近組織也常常受到波及[12]。通過本研究結(jié)果可以推測腫瘤組織調(diào)控遠癌組織出現(xiàn)了適應(yīng)性的改變，為腫瘤細胞向周圍的浸潤提供了更好的條件。

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的遠癌組織盡管仍然維持正常的細胞組織形態(tài)，但亞細胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)及細胞表達譜均與正常細胞存在顯著差異。這一現(xiàn)象對于肝轉(zhuǎn)移的形成、復發(fā)及患者預后的影響還有待更多研究進行證實。