白 冰，孫銘霞

(河北省承德市中心醫(yī)院骨科，河北 承德 067000)

傳統(tǒng)上，骨關(guān)節(jié)炎(OA)被認(rèn)為是作為關(guān)節(jié)軟骨的逐漸磨損和撕裂。然而，最近的證據(jù)表明它是整個滑膜關(guān)節(jié)的炎癥性疾病，不僅包括機械退化關(guān)節(jié)軟骨，但也伴隨結(jié)構(gòu)和整個關(guān)節(jié)的功能變化，包括滑膜、半月板(膝部)、關(guān)節(jié)周圍韌帶和軟骨下骨[1]。膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是導(dǎo)致老年人殘疾的最常見的退行性疾病之一。流行病學(xué)研究表明，大約30%的成年人有OA的放射學(xué)跡象；8.9%的成年人有臨床意義的膝關(guān)節(jié)OA。另一項研究還表明，OA的可能性隨著年齡的增長而增加。中國的一項全國人口研究顯示，癥狀性KOA的總發(fā)病率為8.1%，并且KOA的患病率隨著年齡的增長而增加。KOA的治療可分為非手術(shù)治療或手術(shù)治療。非手術(shù)治療包括非藥物治療和藥物治療，非藥物治療包括所有OA患者的核心一線治療，包括教育、自我管理、運動和減肥。KOA的其他主要非藥物治療包括手杖和生物力學(xué)干預(yù)措施。藥物治療可能包括使用撲熱息痛、局部或口服非甾體抗炎藥(NSAID)或關(guān)節(jié)內(nèi)皮質(zhì)類固醇。外科手術(shù)是終末期KOA的最后手段，其中最有效的類型是全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)和康復(fù)治療。由于OA病理過程得到了很好的描述，其中包括功能性軟骨細(xì)胞的喪失，幾種基于細(xì)胞的治療方法已經(jīng)成功開發(fā)包括骨髓刺激、自體骨軟骨移植物或同種異體移植物的植入(ACI)，和移植擴增的自體軟骨細(xì)胞或擴增的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，均有助于恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨?；褐嘘P(guān)節(jié)內(nèi)注射MSC一直是主要的基于細(xì)胞的方法，已經(jīng)證明了臨床有效性，并探索了再生和免疫抑制活性[2]。由于其非凡的治療能力，它仍然是研究和臨床開發(fā)的重要途徑。然而，多能MSC直接分化為軟骨細(xì)胞譜系的細(xì)胞導(dǎo)致了多種實驗策略來研究組織特異性MSC是否優(yōu)先用于關(guān)節(jié)軟骨的再生和維持。長期耐久性、增加的組織整合和比活性首先取決于更好的移植存活率和對惡劣環(huán)境的更好適應(yīng)，這仍然是一個挑戰(zhàn)。迄今為止，尚缺乏供體樣本用于治療和修復(fù)退行性關(guān)節(jié)的MSC方面更有效。皮下脂肪組織是最容易獲得的來源。然而，在關(guān)節(jié)置換假體實施后，通常切除髕上和髕下脂肪墊，構(gòu)成合適的自體脂肪組織來源的MSC，稱之為脂肪源性干細(xì)胞(ASC)。髕下脂肪墊或Hoffa脂肪墊是一種囊內(nèi)但位于滑膜外的結(jié)構(gòu)，位于膝關(guān)節(jié)髕骨下方、髕腱、股骨髁和脛骨平臺之間。髕上脂肪墊或股四頭肌脂肪墊位于關(guān)節(jié)囊和滑膜之間，排列在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，呈三角形并延伸穿過髕骨底部。研究已經(jīng)表明，源自O(shè)A模型中髕下墊的ASC的潛在再生能力[3]，與從皮下脂肪組織中獲得的細(xì)胞相比，免疫表型陽性基質(zhì)細(xì)胞的百分比更高。然而，尚缺乏關(guān)于髕上組織再生能力的數(shù)據(jù)報道。此外，最近的報道還關(guān)注了Hoffa衍生細(xì)胞的作用，如炎癥細(xì)胞釋放或誘導(dǎo)釋放炎癥介質(zhì)，表明髕下脂肪墊在KOA的發(fā)生和發(fā)展屬于活躍的連接組織[4～6]。脂肪源性干細(xì)胞(ASC)移植已被證明可以恢復(fù)退化的軟骨。本研究旨在探討髕上源性ASC自體移植對小鼠KOA模型中膝關(guān)節(jié)炎癥和軟骨退行性等級的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1ASC的分離及培養(yǎng):該研究納入了24名年齡在50至80歲之間且需要完全關(guān)節(jié)置換的患者。本試驗已得到承德市中心醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，且患者均知情同意。留取外周血并分離血清。分離髕上或髕下區(qū)域的脂肪組織并存放至4℃無菌溶液中的密封容器中。脂肪組織在PBS和抗生素中多次洗滌以清潔組織并去除殘留的血液，每10g脂肪組織放置于含有溶液的培養(yǎng)皿中，溶液中含有PBS、100U/mL青霉素和100ug/mL鏈霉素、IA型膠原酶(0.07%，Sigma C9891 CA，美國)和中性蛋白酶I(0.2mM，Sigma)。使用無菌手術(shù)剪將組織切成小塊，移至密閉細(xì)胞燒瓶中并在37℃、20% O2、5% CO2的振蕩器中消化過夜。第2天，收集消化的脂肪組織，并用PBS和抗生素洗滌多次。細(xì)胞分為兩組，在含10%人血清的培養(yǎng)基或10%胎牛血清中生長(DMEM中含有2mM L-谷氨酰胺、30% Lglucose、100U/mL的青霉素和100ug/mL的鏈霉素)，孵育過夜。第2天，除去培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基替換，使附著的細(xì)胞生長至接近融合，然后進行細(xì)胞分化測定。

1.2ASC增殖分析:在每個樣品(髕上和髕下)的第3代，在10%人血清或10%胎牛血清培養(yǎng)基存在下，將104個細(xì)胞接種在24孔板中。

1.3ASC定向分化:第4代或之后的ASC進行定向分化、誘導(dǎo)脂肪生成、成骨和軟骨生成。所有定向分化培養(yǎng)基均來自Lonza(Lonza Co.，Switzerland)。

1.3.1脂肪細(xì)胞生成ASC:以10,000個細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度接種，當(dāng)ASC融合>90%時，將生長培養(yǎng)基替換為含有胰島素、地塞米松、IBMX(3-異丁基-甲基-黃嘌呤)和吲哚美辛的分化培養(yǎng)基(脂肪干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；Lonza Co.)。然后將細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下孵育12d。經(jīng)油紅O染色法鑒定脂肪形成。

1.3.2成骨ASC:以10,000個細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度接種在含有0.1uM地塞米松、50uM Asc2P和10mMμ-甘油磷酸(成骨基礎(chǔ)培養(yǎng)基；Lonza Co.)及10%人血清。ASC培養(yǎng)物在該培養(yǎng)基中維持4周(每3天更換一次培養(yǎng)基)。經(jīng)茜素紅染色法鑒定成骨形成。

1.3.3軟骨形成在存在:TGF-β1和3(10ng/mL)、ASC的情況下，從最小體積(1×105個細(xì)胞/100μL)的高濃度細(xì)胞開始，從細(xì)胞“Micromass”進行ASC培養(yǎng)2P(50uM)和胰島素(6.25ug/mL)(Chondro BulletKit;Lonza Co.)4周，培養(yǎng)基每3天更改一次。經(jīng)阿爾辛藍染色法鑒定成軟骨形成。

1.4OA小鼠模型和細(xì)胞移植:12周齡的成年雄性C57BL6小鼠，單次注射含13U膠原酶II的5mM CaCl2溶液6μL，誘導(dǎo)雙膝出現(xiàn)嚴(yán)重OA。5d后，當(dāng)誘發(fā)嚴(yán)重軟骨損傷的OA時，將所有動物分為4組(每組n=6)。對照組注射生長細(xì)胞培養(yǎng)液6μL;含105個細(xì)胞的6μL SVF或hASC(來自髕上脂肪墊)分別注射到SVF或hASC組。在PRP組中注射6μL混合富人血小板血漿(PRP)。所有關(guān)節(jié)內(nèi)注射均通過使用連接至遠(yuǎn)程輸注/撤回泵11 Elite nanomite可編程注射泵(Harvard Apparatus)的30G Hamilton注射器以6μL/min輸注速率進行。PRP是從所有患者的檸檬酸鹽管中收集的血液中分離出來的，并按照標(biāo)準(zhǔn)化方法制備。1個月處死所有動物，并收集膝關(guān)節(jié)。所有動物實驗均得到承德市中心醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。小鼠腿在股骨干中部和脛腓骨中部分離并截骨以獲得整個關(guān)節(jié)。大多數(shù)附著在膝蓋周圍的結(jié)締組織，包括肌肉、韌帶和肌腱，都被移除，以防止對軟骨造成任何損傷。膝蓋組織用于組織學(xué)分析和定量糖胺聚糖(GAG)。上述過程未發(fā)現(xiàn)種屬排異反應(yīng)。為了評估髕上來源的MSC在體外顯示的增加的細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化特性是否在軟骨再生中具有功能上的有效性，在嚴(yán)重的OA小鼠模型中進行了體內(nèi)細(xì)胞移植試驗。對于髕上衍生的人類ASC(hASC)的治療功效測試，通過在12周齡成年雄性C57BL6小鼠的雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)單次注射膠原酶II (13U)誘發(fā)嚴(yán)重OA。小鼠分為對照組、SVF、PRP和hASC組，注射5d后，發(fā)生軟骨破壞，將105 hASC或SVF或生長培養(yǎng)基(對照)注射到關(guān)節(jié)內(nèi)腔內(nèi)。已經(jīng)表明，越來越多地在常規(guī)臨床實踐中實施的PRP浸潤可以減輕疼痛并改善關(guān)節(jié)功能，顯著改善患者的生活質(zhì)量[7,8]。因此，還向另一組動物注射PRP，以比較細(xì)胞移植與生長因子浸潤的再生效果。OA小鼠治療1周后，膝蓋的體積使用自動卡尺測量。

1.5GAG分析:稱重膝蓋組織，放置于2.5%木瓜蛋白酶溶液，65℃孵育過夜進行消解。將上清液與10% Alcian blue工作溶液孵育，該溶液中包含0.25% Triton X-100的18mM H2SO4，然后與解離溶液(包含4M鹽酸胍，0.375 Triton X-100的0.027M H2SO4溶液)孵育30min。將沉淀的GAG懸浮在8M鹽酸胍中，并在570nm處定量。平行制作硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS16.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差(one way ANOVA)分析，兩組間比較采用SNK-p檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1髕上ASC成骨和軟骨形成體外實驗:為了進一步評估來自兩種脂肪組織來源(髕上脂肪墊和髕下脂肪墊)的干細(xì)胞特征，我們比較了兩種樣品之間的分化多能性。兩者都經(jīng)歷了誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞生成(圖1a)、成骨(圖1b)和軟骨(圖1c)生成。然而，分化的程度并不相同。與髕下衍生和髕下分化細(xì)胞相比，髕上衍生的ASC顯示出更高的成骨和軟骨形成潛力(圖1)。

圖1 髕上和髕下衍生的ASC的脂肪生成、成骨和軟骨

2.2髕上源性ASC顯著改善KOA小鼠的軟骨再生體內(nèi)實驗:如圖2(a)所示，OA干預(yù)后所有四組的膝關(guān)節(jié)體積均顯著增加。然而，與對照組相比，hASC、SVF和PRP干預(yù)組在OA誘導(dǎo)后1個月均顯示出這種增加的體積顯著減少[圖2(a)]。該結(jié)果表明治療具有顯著的抗炎作用。然而，當(dāng)我們通過量化GAG[圖2(b)]和OA損傷評分[圖2(c)]來檢查結(jié)構(gòu)再生效果時，與對照組比較，當(dāng)動物接受hASC治療時軟骨結(jié)構(gòu)破壞后可再生，OA損傷評分降低。因此，PRP或SVF作為一種有效的抗炎劑，但干細(xì)胞的再生作用似乎不受PRP或SVF的影響。

圖2 功能性和結(jié)構(gòu)性軟骨再生

3 討 論

基于ASC的療法已經(jīng)進行了安全性和有效性階段的測試[9]。然而，組織特異性干細(xì)胞將保證ASC修復(fù)能力的提高，例如提高軟骨修復(fù)的軟骨形成效率。在膝關(guān)節(jié)中，有兩個主要的ASC來源，即髕上脂肪墊和髕下脂肪墊。兩個脂肪墊通常在急性O(shè)A患者的膝關(guān)節(jié)置換術(shù)期間切除，并且是ASC的合適來源，用于其他受影響關(guān)節(jié)的自體治療。我們首次展示了OA小鼠模型中髕上源性ASC群體的再生能力。髕下墊衍生細(xì)胞被認(rèn)為是膝關(guān)節(jié)OA發(fā)生和發(fā)展過程中的活躍關(guān)節(jié)組織，通過產(chǎn)生影響軟骨和滑膜代謝的炎癥介質(zhì)來激活炎癥細(xì)胞。當(dāng)我們在體外比較兩種衍生ASC的分化特性時，本研究顯示髕上衍生ASC的軟骨形成和成骨率有所提高，可有效解決關(guān)節(jié)退化的細(xì)胞治療[10]。這種差異的多能性使髕上脂肪墊成為軟骨組織修復(fù)的有希望的細(xì)胞來源。

本研究比較SVF和PRP治療動物的軟骨再生效率。有趣的是，治療組均表現(xiàn)出膝關(guān)節(jié)體積顯著減小。PRP含有多種生長因子，包括TGF-β、PDGF、IGF、bFGF、VEGF和EGF，具有合成代謝軟骨促進和軟骨保護特性[11]。大量的臨床前和臨床研究結(jié)果支持PRP是一種很有前途的軟骨修復(fù)和緩解癥狀的輔助治療方法，因為它對駐留細(xì)胞有合成代謝作用，并且具有抑制炎癥和緩解OA癥狀的潛力，并且具有臨床可接受的安全性[12]。PRP治療在骨缺損等其他相關(guān)組織的再生中顯示出額外的優(yōu)勢，表明PRP通過影響局部組織微環(huán)境，增強祖細(xì)胞募集和適當(dāng)?shù)幕|(zhì)沉積而發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。小鼠模型中，化學(xué)誘導(dǎo)的OA導(dǎo)致侵襲性關(guān)節(jié)退化。然而，即使在如此嚴(yán)重的情況下，ASC移植也降低了OA損傷評分并增加了軟骨樣組織，改變并挽救了關(guān)節(jié)內(nèi)空間的功能解剖結(jié)構(gòu)，為KOA的臨床研究提供了新的理論依據(jù)。