張 影, 姚曼曼, 劉珊珊, 劉鐵軍, 劉 昕, 仇永樂

(1.河北省石家莊市第三醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050000 2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是全國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤疾病，是全球第六大常見及發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率排列第三的惡性腫瘤[1]。OSCC發(fā)生率占據(jù)口腔癌90%以上，局部侵襲性較強(qiáng)，可加快頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促血管生成因子[3]。有研究表明，上調(diào)VEGF可促進(jìn)口腔癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及侵襲[4]。OSCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，受基因水平調(diào)控。因此分析參與OSCC發(fā)病機(jī)制的相關(guān)基因，對(duì)于了解疾病發(fā)生機(jī)制及提高治療效果意義重大。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄及DNA復(fù)制等作用。NKILA作為其家族成員之一，2015年首次在乳腺癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其長(zhǎng)度為2570nt，具有抑制乳腺癌細(xì)胞活性的作用[5]。微小RNA(miRNA)是由多個(gè)核苷酸組成小分子RNA，可調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)，參與機(jī)體的多種疾病的發(fā)生及發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，成熟的miR-3195與造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及口頸部惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在喉癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-3195表達(dá)降低而通過上調(diào)水平能夠抑制腫瘤細(xì)胞活性[6]。但是關(guān)于LncRNA-NKILA及miR-3195在口腔癌中的研究較少。本文探討LncRNA-NKILA靶向miR-3195對(duì)口腔癌細(xì)胞活性及血管生成的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源:人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞HOEC、人口腔鱗癌細(xì)胞SCC25、人口腔癌細(xì)胞株HSQ-89、人口腔癌細(xì)胞株KB細(xì)胞、人口腔癌細(xì)胞株CAL-27、人口腔癌細(xì)胞株HSC-3均購自美國(guó)菌種保存中心(ATCC)。

1.2主要試劑與儀器:LncRNA-NKILA、miR-3195慢病毒(上海吉?jiǎng)P制藥公司)；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(上海微科生物有限公司)；牛血清、0.25%胰蛋白酶均(上海素爾生物科技有限公司)；鼠抗人VEGF/VEGF-C單克隆抗體(上海圻明生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG(武漢純度生物科技有限公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(弗元(上海)生物科技有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫爾特公司)；熒光素酶基因質(zhì)粒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒(江西江藍(lán)純生物有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)及Western blot電泳系統(tǒng)(中國(guó)北京賽百奧科技有限公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng):人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞及口腔癌細(xì)胞采用10%的胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素，的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃5%的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種于細(xì)6孔板中，生長(zhǎng)至80%時(shí)取對(duì)數(shù)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4QRT-PCR檢測(cè)正?？谇簧掀ぜ?xì)胞及口腔癌細(xì)胞中LncRNA-NKILA、miR-3195 mRNA表達(dá):將人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞及口腔癌細(xì)胞按照1×106細(xì)胞/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，采用Trizol法檢測(cè)提取總RNA，無核酸酶溶解。將提取的RNA進(jìn)行送轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，采用SYBR Green試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)LncRNA-NKILA、miR-3195 mRNA表達(dá)。LncRNA-NKILA引物序列：F：5'-CAGCAGGCAAAAATAACCAG-3，R：5'-GACAGAATCAACTTCGGAAC-3'；miR-3195引物序列：F：5'-GCGCCGGGCCCGGGTT-3'，R：5'-ACTCCCATGCCAAGAACTCC-3'；β-actin引物序列：F：5'-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'，R：5'-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5min ； 95℃ 10s ，60℃30s， 72℃ 10s共40個(gè)循環(huán)；72℃10min。采用2-△△Ct法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組:PBS緩沖液將人SCC25細(xì)胞株洗凈，重復(fù)3次，胰蛋白酶消化2min，離心15min后，將數(shù)目為5×106細(xì)胞平鋪到6孔板中，融合率達(dá)到70%，采用無血清培養(yǎng)基按照3μL稀釋，在37℃下孵育20min，轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000說明書操作，分別將pcDNA-NKILA、pcDNA、miR-3195-mimics及miR-3195-NC-mimics轉(zhuǎn)染到細(xì)胞株中，37.5℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。12h后將無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，提取細(xì)胞RNA，采用qRT-PCR法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。分組：空質(zhì)粒組(SCC25細(xì)胞株+pcDNA)、NEAT1組(SCC25細(xì)胞株+pcDNA-NKILA)、NC-組(SCC25細(xì)胞株+miR-3195-NC-mimics)；miR-3195組(SCC25細(xì)胞株+miR-3195-mimics)、聯(lián)合1組(SCC25細(xì)胞株+pcDNA-NKILA+miR-3195-NC-mimics)及聯(lián)合2組(SCC25細(xì)胞株+pcDNA-NKILA+miR-3195-mimics)。

1.6CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCC25細(xì)胞按照8×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染后，分別培養(yǎng)24h、48h、72h及96h，后在細(xì)胞每個(gè)培養(yǎng)孔中加入加入20μL的CCK-8試劑(5g/L)，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(A值)。細(xì)胞存活率(%)=[A(加藥)-A(凋零)]/[A(對(duì)照)-A(凋零)]×100%。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:收集各組細(xì)胞，漂洗后，加入500μL結(jié)合緩沖液重懸，后加入10μL的IFITC AnnexinⅤ與5μL PI 混合后染色，混勻，避光孵育10min，予以洗滌，次數(shù)3次，后采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.8免疫印跡檢測(cè)VEGF及VEGF-C蛋白的水平:SCC25細(xì)胞培養(yǎng)48h，加入100μL的細(xì)胞裂解液，在冰上提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定濃度。制備SDS-PAGE，取等質(zhì)量等體積的變性蛋白樣品上樣，電泳分離蛋白，以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉液封閉1h，用VEGF(1∶500)、VEGF-C(1∶1000)及和GAPDH(1∶2000)抗體一抗過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶IgG二抗(1∶2000)，室溫孵育2h，TBST洗膜，加入ECL發(fā)光液，顯影，在計(jì)算機(jī)凝膠成像系統(tǒng)中獲取圖像。

1.9雙熒光素酶:從人類基因組DNA產(chǎn)生全長(zhǎng)miR-3195′UTR，退火合成的信號(hào)寡核苷酸產(chǎn)生突變體miR-3195′UTR。DNA片段克隆到ph-TK載體，miR-3195′UTR WT為野生型，miR-3195′UTR MUT為突變型，均轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)使用pGL-3.0(熒光素酶)作為內(nèi)參照。檢測(cè)細(xì)胞中miR-3195的熒光活性相對(duì)值。使用 Lipofectamine 2000 TM檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率在孢菌素酶活性的基礎(chǔ)上正?；０凑照f明書，使用雙熒光素酶系統(tǒng)試劑盒測(cè)LncRNA-NKILA對(duì)miR-3195的靶向能力。

2 結(jié) 果

2.1正?？谇簧掀ぜ?xì)胞與口腔癌細(xì)胞中LncRNA-NKILA、miR-3195 mRNA表達(dá):與正?？谇簧掀ぜ?xì)胞相比，人口腔鱗癌SCC25細(xì)胞、HSQ-89細(xì)胞、KB細(xì)胞、CAL-27細(xì)胞及HSC-3細(xì)胞中LncRNA-NKILA、miR-3195表達(dá)均降低，其中以SCC25細(xì)胞中LncRNA-NKILA及miR-3195表達(dá)最低，故選擇此細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。見圖1、2。

圖1 正?？谇簧掀ぜ?xì)胞與口腔癌細(xì)胞中LncRNA-NKILA mRNA表達(dá)

圖2 正常口腔上皮細(xì)胞與口腔癌細(xì)胞中miR-3195 mRNA表達(dá)

2.2上調(diào)LncRNA-NKILA對(duì)口腔癌SCC25細(xì)胞增殖、凋亡的影響:NKILA組細(xì)胞中LncRNA-NKILA表達(dá)升高，與空質(zhì)粒組存在差異(P<0.05)，與空質(zhì)粒組相比，NKILA組24h、48h及72h的細(xì)胞活性均降低，存在差異(P<0.05)。組內(nèi)相比，兩組SCC25細(xì)胞活性均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，與24h相比，48h SCC25細(xì)胞活性升高，與48h相比，72hSCC25細(xì)胞活性升高，存在差異(P<0.05)，NKILA組SCC25細(xì)胞凋亡率高于空質(zhì)粒組存在差異(P<0.05)，見表1、圖3。

2.3上調(diào)miR-3195對(duì)SCC25細(xì)胞活性增殖、凋亡的影響:與NC組相比，miR-3195組細(xì)胞miR-3195表達(dá)升高(P<0.05)，與NC組相比，miR-3195組SCC25細(xì)胞24h、48h及72h增殖率降低，組內(nèi)相比，兩組SCC25細(xì)胞活性均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，與24h相比，48hSCC25細(xì)胞活性升高，與48h相比，72hSCC25細(xì)胞活性升高，存在差異(P<0.05)；miR-3195組SCC25細(xì)胞凋亡率高于NC組，存在差異(P<0.05)，見表2、圖4。

表2 miR-3195表達(dá)及對(duì)SCC25細(xì)胞活性的研究

圖3 上調(diào)LncRNA-NKILA對(duì)SCC25細(xì)胞增殖、凋亡的影響(A：細(xì)胞增殖；B：細(xì)胞凋亡率)

圖4 上調(diào)miR-3195對(duì)SCC25細(xì)胞活性增殖、凋亡的影響(A：細(xì)胞增殖；B：細(xì)胞凋亡率)

2.4LncRNA-NKILA及miR-3195對(duì)SCC25細(xì)胞活性增殖、凋亡的影響:與聯(lián)合1組相比，聯(lián)合2組SCC25細(xì)胞24h、48h及72h增殖率降低，組內(nèi)相比，兩組SCC25細(xì)胞活性均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，與24h相比，48hSCC25細(xì)胞活性升高，與48h相比，72hSCC25細(xì)胞活性升高，存在差異(P<0.05)；聯(lián)合2組SCC25細(xì)胞凋亡率高于聯(lián)合1組，存在差異(P<0.05)見表3、圖5。

表3 LncRNA-NKILA及miR-3195對(duì)SCC25細(xì)胞活性的影響

圖5 LncRNA-NKILA及miR-3195對(duì)SCC25細(xì)胞活性的影響(A：細(xì)胞增殖；B：細(xì)胞凋亡率)

2.5免疫印跡檢測(cè)各組SCC25細(xì)胞VEGF、VEGF-C蛋白水平:與空質(zhì)粒組相比，NKILA組SCC25細(xì)胞中VEGF、VEGF-C表達(dá)降低(P<0.05)，與NC組相比，miR-3195組SCC25細(xì)胞中VEGF、VEGF-C表達(dá)降低(P<0.05)，與聯(lián)合1組相比，聯(lián)合2組SCC25細(xì)胞VEGF、VEGF-C表達(dá)降低(P<0.05)，見表4、圖6。

圖6 各組SCC25細(xì)胞VEGF、VEGF-C蛋白水平比較

表4 各組SCC25細(xì)胞VEGF VEGF-C蛋白水平

2.6熒光素酶證實(shí)LncRNA-NKILA對(duì)miR-3195調(diào)控作用:生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)LncRNA-NKILA與miR-3195相互結(jié)合的序列，兩者之間存在調(diào)控關(guān)系。為了驗(yàn)證LncRNA-NKILA與miR-3195的3′UTR結(jié)合，我們將兩者均轉(zhuǎn)染到SCC25細(xì)胞中，通過上調(diào)LncRNA-NKILA觀察對(duì)miR-3195的熒光活性變化，證實(shí)：上調(diào)LncRNA-NKILA能夠增加miR-3195活性，LncRNA-NKILA能與miR-3195-3′UTR特異性結(jié)合，見表5。

表5 LncRNA-NKILA對(duì)miR-3195調(diào)控作用

3 討 論

在口腔癌中存在大量RNA表達(dá)異常，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞活性而發(fā)揮抑癌和促癌作用。NKILA(nuclear factor-κB interacting long noncoding RNA)是近幾年被發(fā)現(xiàn)新型的長(zhǎng)鏈編碼RNA，在乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)可通過激活免疫T細(xì)胞靶向抑制NF-kB而增加腫瘤細(xì)胞死亡敏感性[7]。近些年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，miR-3195是其中之一，定位于20號(hào)染色體q13.33，認(rèn)為該染色體中miRNA表達(dá)于胃癌、大腸癌及肝癌等腫瘤相關(guān)[8]。本文研究表示，在人口腔癌細(xì)胞株中存在LncRNA-NKILA及miR-3195低表達(dá)，并通過增加其活性對(duì)于減少腫瘤細(xì)胞增殖增加凋亡，但是其在口腔癌中現(xiàn)暫無研究。有學(xué)者證實(shí)在喉癌大鼠中通過將NKILA質(zhì)粒注射大鼠體內(nèi)可顯著抑制腫瘤免疫，這與抑制NF-kB表達(dá)相關(guān)[9]。喉癌細(xì)胞中miR-3195表達(dá)降低有利于癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)染模擬物后則可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)存活加快凋亡。NF-kB在口腔癌中表達(dá)升高，其激活可參與腫瘤細(xì)胞活性，并通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)水平而加快腫瘤發(fā)生發(fā)展[10]。本文推測(cè)在口腔癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NKILA慢病毒載體NKILA可以通過抑制NF-kB水平而抑制口腔癌細(xì)胞增殖。利用靶基因軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-3195可控制的靶基因中有4個(gè)與腫瘤相關(guān)。其中之一為TBX 1具有維持細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化作用，在喉癌細(xì)胞中通過上調(diào)miR-3195可削弱TBX 1表達(dá)進(jìn)一步抑制癌細(xì)胞增殖，但是在口腔癌是否也通過抑制TBX1發(fā)揮作用還不得而知需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

口腔癌細(xì)胞中VEGF及VEGF-C表達(dá)升高可增加腫瘤細(xì)胞血管生成而惡化病情。VEGF-C具有調(diào)節(jié)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞功能，在機(jī)體不同腫瘤組織均可發(fā)現(xiàn)表達(dá)升高表示與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[11]。本文研究表示，通過上調(diào)LncRNA-NKILA及miR-3195表達(dá)后VEGF及VEGF-C表達(dá)降低，說明上調(diào)LncRNA-NKILA及miR-3195均可抑制VEGF及VEGF-C而控制腫瘤血管生長(zhǎng)。在前列腺癌細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)升高，通過表達(dá)miR-3195和miRNA374b抑制，證實(shí)其抗血管生成作用[12]。故本文推測(cè)在口腔癌細(xì)胞中通過上調(diào)LncRNA-NKILA及miR-3195均發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用，機(jī)制與抑制VEGF及VEGF-C表達(dá)相關(guān)。

綜上所述,LncRNA-NKILA可通過調(diào)控miR-3195表達(dá)抑制口腔癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，研究機(jī)制可能與抑制VEGF水平相關(guān)。