孫光蕊，楊 陽(yáng)，鄭競(jìng)雄，趙寶山, 侯繼申，梁宗英

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，河北 承 德 067000 2.河北省胸科醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050000)

食管癌是世界范圍內(nèi)男性癌癥相關(guān)死亡的第六大原因之一，其5年總體生存率約15%～25%[1]。食管癌治療技術(shù)的提高在一定程度上改善了部分食管癌患者的預(yù)后，但其術(shù)后生存質(zhì)量不盡人意[2]。食管癌細(xì)胞的無限制增殖和高侵襲性是術(shù)后患者復(fù)發(fā)及影響預(yù)后的主要原因，也是食管癌的臨床治療最大的挑戰(zhàn)。Survivin是一種具有抗凋亡作用的小蛋白，其表達(dá)缺失可以引發(fā)多種疾病。與正常組織相比，它在腫瘤中大量表達(dá)，與許多人類腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。研究顯示，Survivin可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期及血管的生成，在促進(jìn)癌細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞死亡方面具有重要作用[3,4]。既往研究證實(shí)食管癌的增殖、凋亡、遷移和侵襲與Survivin高表達(dá)密切相關(guān)[5]。但在食管癌中Survivin通過何種分子機(jī)制參與食管癌的發(fā)生尚未可知。本研究旨探討在Survivin在食管癌中的表達(dá)及其促癌的潛在機(jī)制。

1 資料與方法

1.1臨床資料：選取同一患者食管癌組織及癌旁組織55例，術(shù)前無任何治療病史。男性：51例，女性：4例；≥60歲：48例，<60歲：7例；I+Ⅱ期：18例，Ⅲ期：37例；高分化：13例，中低分化：42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：44例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：11例。

1.2主要試劑和細(xì)胞:Survivin、wnt3α、β-catenin、CyclinD1和c-myc抗體抗體購(gòu)于購(gòu)于美國(guó)Abeam公司；相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)于西寶生物科技(上海)股份有限公司；食管癌EC109細(xì)胞和正常食管黏膜上皮細(xì)胞HEEC購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

1.3方 法

1.3.1免疫組化學(xué)(SP法):組織切片二甲苯脫蠟，3%甲醇-H2O2溶液及枸櫞酸鈉緩沖液加熱處理組織切片。山羊血清封閉，一抗孵育后加入二抗。PBS處理后滴加鏈親和素-過氧化物酶工作液。DBA顯色后復(fù)染、封片。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:實(shí)驗(yàn)分組：轉(zhuǎn)染Survivin小干擾RNA食管癌EC109細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組(si-S)；未轉(zhuǎn)染RNA食管癌EC109細(xì)胞為陰性對(duì)照組(si-N)；正常EC109細(xì)胞為空白對(duì)照組(NC)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)細(xì)胞后，接種到6孔培養(yǎng)板中，每孔約1×105個(gè)，加入含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液，細(xì)胞孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)每孔細(xì)胞密度達(dá)到80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染當(dāng)日用無血清F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次后，每孔加入1.5mL無血清的F12培養(yǎng)基，放入細(xì)胞孵育箱內(nèi)繼續(xù)饑餓培養(yǎng)4h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用30μL 1×riboFECTTMCP Buffer(V1)稀釋1.25μL 20μM siRNA 儲(chǔ)存液(V2)，輕輕混勻，室溫孵育5min；加入3μL riboFECTTMCP Reagent(V3)，輕輕吹打混勻，室溫孵育15min；將riboFECTTMCP混合液加入到465.75μL細(xì)胞培養(yǎng)基(V4)中，使總體積達(dá)到500μL，輕輕混勻；將培養(yǎng)板置于37℃的CO2孵箱中培養(yǎng)48h后以熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn):提取RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR試劑盒檢測(cè)mRNA；PCR的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s；58℃退火60s(40個(gè)循環(huán))。循環(huán)完畢后68℃延伸7min。溶解曲線參照儀器自動(dòng)程序。

1.3.4Western blot：提取蛋白并測(cè)濃度；制備電泳蛋白上樣液，行凝膠電泳。電泳后，轉(zhuǎn)膜。加一抗4℃過夜。次日孵育二抗，重復(fù)洗膜后顯影。

1.3.5MTT實(shí)驗(yàn):單細(xì)胞懸液100μL接種于96孔板。常規(guī)培養(yǎng)至每孔細(xì)胞密度達(dá)到80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。12、24、48、72h后，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)拿出一塊板，每孔加入5mg/mL MTT液30μL，繼續(xù)常規(guī)孵育4h。離心，棄上清。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，80r/min水平搖床搖勻5～10min。

1.3.6劃痕愈合實(shí)驗(yàn):用1mL無菌移液槍頭在細(xì)胞鋪滿板底的12孔板板面垂直劃痕；棄培養(yǎng)液后洗去細(xì)胞碎片；加入無血清培養(yǎng)基，定時(shí)拍照。

1.3.7Transwell小室實(shí)驗(yàn):取轉(zhuǎn)染后鋪滿孔底的三組細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞。Matrigel膠提前融化為液態(tài)狀態(tài)備用。50mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部8μm孔徑的聚碳酸脂微孔濾膜，37℃過夜聚合成膠。Transwell小室按順序放入24孔板，無菌鑷子取出小室，室外加入含15%血清F12培養(yǎng)基600μL。小室內(nèi)加入200μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)液為不含血清的F12培養(yǎng)基，每組細(xì)胞重復(fù)6個(gè)樣本。24孔板放入CO2孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48h。取出小室，PBS淋洗，擦去微孔膜內(nèi)層細(xì)胞。多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色。PBS涮洗3次，每次更換液體；棉簽擦干液體，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)；每個(gè)小室隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:研究數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS21.0分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比形式表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；單因素方差分析組間資料比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Survivin在組織中的表達(dá)及臨床意義:免疫組化結(jié)果顯示，食管癌組織中Survivin呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其陽(yáng)性表達(dá)率為78.18%(43/55)，顯著高于癌旁組織的25.45%(14/55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，食管癌組織中Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與性別和年齡無相關(guān)性(P>0.05)。詳見表1。

圖1 食管癌和癌旁組織中Survivin蛋白表達(dá)量

表1 食管癌組織中Survivin陽(yáng)性表達(dá)與臨床

2.2Survivin在食管細(xì)胞系中的表達(dá):Survivin在食管癌EC109細(xì)胞中呈高表達(dá)，而在正常食管黏膜上皮HEEC細(xì)胞中呈低表達(dá)，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖2。

圖2 Survivin在人食管癌和正常食管黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.3Survivin小干擾RNA轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞效果驗(yàn)證:合成的Survivin-siRNA含有cy3紅色熒光標(biāo)記標(biāo)簽，轉(zhuǎn)染成功后熒光顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)熒光染色。見圖3。Survivin mRNA和蛋白表達(dá)量結(jié)果顯示，si-S組 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯低于si-N組及NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖4。說明設(shè)計(jì)合成下調(diào)Survivin的RNA干擾序列有效。

圖3 Survivin小干擾RNA轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞熒光轉(zhuǎn)染效果

圖4 RNA干擾后Survivin mRNA和蛋白表達(dá)量變化

2.4下調(diào)Survivn對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響:采用蛋白印跡法(Western Blot)研究參與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，下調(diào)EC109細(xì)胞中的Survivin可以顯著抑制c-myc、cyclinD1、β-catenin和wnt3α蛋白的表達(dá)。見圖5。

圖5 下調(diào)Survivin對(duì)Wnt/β-catenin通路中wnt3α、β-catenin、CyclinD1和c-myc蛋白表達(dá)水平的影響

2.5下調(diào)Survivn可抑制食管癌細(xì)胞的存活:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-S組在72h時(shí)對(duì)EC109的細(xì)胞抑制率可達(dá)(26.47±1.68)%，說明下調(diào)EC109細(xì)胞中的Survivin可以顯著抑制EC109細(xì)胞的存活。見圖6。

圖6 下調(diào)Survivin對(duì)食管癌EC109細(xì)胞的抑制率

2.6下調(diào)Survivin抑制食管癌細(xì)胞遷移能力:劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示，與si-N和NC組相比，si-S組中EC109細(xì)胞劃痕愈合緩慢，遷移能力顯著下降。見圖7。

圖7 下調(diào)Survivin對(duì)EC109細(xì)胞的遷移能力的影響

2.7下調(diào)Survivin抑制食管癌細(xì)胞侵襲能力:侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，食管癌EC109細(xì)胞中Survivin表達(dá)下調(diào)后，si-S組中EC109細(xì)胞穿膜數(shù)顯著減少，侵襲能力顯著下降。見圖8。

圖8 下調(diào)Survivin對(duì)食管癌EC109細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討 論

食管癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病較隱匿，大部分患者確診時(shí)已屬中晚期，總體預(yù)后不佳[6]。目前食管癌的臨床治療主要以手術(shù)、放化療為主，但這些治療會(huì)出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥、貧血和多器官功能障礙綜合征等副作用，尤其對(duì)晚期食管癌患者的治療效果有限[7]?，F(xiàn)代精準(zhǔn)的分子及免疫靶向治療為食管癌患者提供了新的希望，因此，識(shí)別和篩查相關(guān)因子為臨床分子治療提供靶點(diǎn)成為食管癌研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

Survivin蛋白是一種凋亡抑制基因產(chǎn)物,在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，可以促進(jìn)腫瘤血管生成、抗凋亡及參與腫瘤細(xì)胞周期,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖[8,9]。課題組前期研究表明，Survivin蛋白在食管癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其與食管癌TNM分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10,11]。本研究再次通過免疫組化證實(shí)Survivin在人食管癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，人食管癌組織中Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)與食管癌病理分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且癌組織的TNM分期越低、分化程度越差，Survivin蛋白的陽(yáng)性率也越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的Survivin蛋白的陽(yáng)性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，其結(jié)果與國(guó)內(nèi)其他研究者研究發(fā)現(xiàn)一致[5]。這也說明，Survivin與人食管癌的發(fā)生和發(fā)展具有密切的相關(guān)性，其高表達(dá)可能是促進(jìn)食管癌惡性轉(zhuǎn)化的重要因素。進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Survivin蛋白在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果顯示食管癌EC109細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)量顯著高于正常食管黏膜上皮HEEC細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)一步提示Survivin的高表達(dá)可能是促進(jìn)食管癌的發(fā)展的重要因素之一。

醫(yī)學(xué)研究表明，在人體內(nèi)的正常細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被阻斷后可以罹患多種疾病，其中包括多種惡性腫瘤。這些障礙可能會(huì)造成基因的變異，從而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。既往研究證實(shí)，Survivin可以參與PI3K/AKT、ERK、Wnt/β-catenin及mTOR等與腫瘤發(fā)生相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變是導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)基礎(chǔ)，而在多種信號(hào)通路中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的異常表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系最為密切。當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活時(shí)，多種因子可與β-catenin相互作用，使得β-catenin由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞癌變[12]。秦燕子等研究顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的β-catenin基因沉默可以導(dǎo)致整個(gè)通路的信號(hào)傳導(dǎo)障礙，進(jìn)而抑制食管癌細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變，同時(shí)可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡，增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力顯著下降[13]。在Wnt/β-catenin通路過程中起到關(guān)鍵作用的基因分子主要包括wnt3α、cyclin D1、β-catenin和c-myc，也是預(yù)測(cè)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要分子標(biāo)志。wnt3α、cyclin D1、β-catenin和c-myc在組織中的異常表達(dá)均可以影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路的傳導(dǎo)，進(jìn)一步調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲和遷移。既往研究證實(shí)，Survivin 基因的高表達(dá)可以通過調(diào)控Wnt/ β-catenin信號(hào)通路而影響胃癌的增殖[14]，但在食管癌中Survivin是否可以影響Wnt/ β-catenin信號(hào)通路尚不可知。本研究設(shè)計(jì)合成Survivin的siRNA干擾序列并轉(zhuǎn)染食管癌EC109細(xì)胞，RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)Survivin mRNA和蛋白水平顯著下降，達(dá)到下調(diào)預(yù)期效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，食管癌EC109細(xì)胞中下調(diào)Survivin可以顯著降低Wnt/β-catenin通路中wnt3α、β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表達(dá)量。這說明在食管癌中Survivin可以影響Wnt/ β-catenin信號(hào)通路的傳導(dǎo)，且沉默Survivin可以通過影響通路中的wnt3α、β-catenin等關(guān)鍵因子的表達(dá)進(jìn)而抑制整個(gè)信號(hào)通路的傳導(dǎo)。進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的生物學(xué)功能，結(jié)果顯示，下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路后，食管癌細(xì)胞的存活能力下降，遷移和侵襲能力受到顯著抑制。以上研究結(jié)果說明在食管癌細(xì)胞中抑制Survivin基因的表達(dá)可以通過阻斷Wnt /β-catenin信號(hào)通路的傳導(dǎo)而抑制細(xì)胞的存活、增殖和侵襲能力。

綜上所述，在食管癌中Survivin可以阻斷Wnt /β-catenin信號(hào)通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制食管癌細(xì)胞功能，但其促進(jìn)食管癌發(fā)生發(fā)展的更深入的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。