趙鑫，楊化強(qiáng)

大動(dòng)物精原干細(xì)胞研究進(jìn)展

趙鑫，楊化強(qiáng)

華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642

精原干細(xì)胞是存在于雄性動(dòng)物睪丸內(nèi)曲細(xì)精管基底膜上的生殖系干細(xì)胞。精原干細(xì)胞一方面通過自我更新來維持其在整個(gè)生命周期中自身群體的數(shù)量穩(wěn)定，另一方面可以在精子發(fā)生過程中不斷地分化成為各個(gè)階段的生殖細(xì)胞并最終形成精子，從而將親代攜帶的遺傳信息傳遞給子代。目前在體外條件下可以進(jìn)行精原干細(xì)胞的長期培養(yǎng)，并將其誘導(dǎo)分化為各級(jí)生精細(xì)胞。雖然對(duì)嚙齒類動(dòng)物精原干細(xì)胞的研究較為成熟，但是對(duì)大動(dòng)物精原干細(xì)胞的研究進(jìn)展較為緩慢。大動(dòng)物精原干細(xì)胞的研究對(duì)了解人類相關(guān)生理機(jī)制和疾病至關(guān)重要，并且豬、牛和羊等農(nóng)業(yè)動(dòng)物的精原干細(xì)胞的研究為優(yōu)良種畜擴(kuò)繁和制備具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因修飾家畜提供新的手段。本文在介紹精原干細(xì)胞的特征基礎(chǔ)上，重點(diǎn)綜述了大動(dòng)物精原干細(xì)胞的研究進(jìn)展，探討了目前研究中面臨的主要問題和其未來應(yīng)用前景，以期為動(dòng)物新型替代繁殖技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備、治療雄性不育以及服務(wù)于再生醫(yī)學(xué)提供新思路、新方法。

精原干細(xì)胞；大動(dòng)物；細(xì)胞移植；精子發(fā)生

精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是雄性哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一可以將遺傳信息傳遞給下一代的成體干細(xì)胞。SSCs在生物體的整個(gè)生命過程中不斷地自我更新，并且在成年雄性睪丸中持續(xù)進(jìn)行的精子發(fā)生過程中逐級(jí)分化成為精子，從而將親代的遺傳信息傳遞給子代[1]。SSCs奠定了雄性動(dòng)物精子發(fā)生和生殖的基礎(chǔ)。盡管SSCs對(duì)于精子的發(fā)生至關(guān)重要，但由于睪丸中這些細(xì)胞的數(shù)量很少以及難以識(shí)別，其體外培養(yǎng)、分化以及相關(guān)機(jī)制和功能研究依然存在諸多尚未解決的問題，因此對(duì)SSCs的研究一直都進(jìn)展的較為緩慢。SSCs自我更新和分化的機(jī)制及其應(yīng)用于細(xì)胞移植的研究，不僅對(duì)了解哺乳動(dòng)物生殖相關(guān)的生理和病理機(jī)制至關(guān)重要，而且可以為輔助生殖和細(xì)胞治療提供替代方案。通過SSCs的體外培養(yǎng)和移植，為繁育優(yōu)良動(dòng)物個(gè)體、生產(chǎn)基因修飾動(dòng)物、治療雄性不育和人類某些遺傳疾病提供新的思路和方法。

1 精原干細(xì)胞的特征

1.1 精原干細(xì)胞與精子發(fā)生

精子的持續(xù)產(chǎn)生，即精子發(fā)生(spermatogenesis)，是一種基于干細(xì)胞的高效系統(tǒng)。精子發(fā)生的過程起始于SSCs的分化，終止于成熟精子的形成，該過程同時(shí)也依賴于激素的調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)。從自我更新的SSCs轉(zhuǎn)化為成熟精子的精子發(fā)生過程在不同物種間是完全不同的，這取決于生精上皮周期的長度，如該過程在牛()[2]中需要63天，在豬()、山羊()、狗()中分別需要大約39天、48天、56~62天[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，小鼠()每天每克睪丸組織通過有絲分裂和減數(shù)分裂產(chǎn)生約4000萬精子[4]，而豬和牛分別產(chǎn)生2300萬和1200萬精子[5]。小鼠在妊娠7.0~7.5天后，生殖系干細(xì)胞首次被確定為胚胎外胚層中約100個(gè)原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells, PGCs)，隨后遷移至泌尿生殖嵴時(shí)會(huì)增殖到約25 000個(gè)細(xì)胞[6]。PGCs在胚胎發(fā)育過程中由尿囊基沿著后腸遷移到生殖嵴并轉(zhuǎn)變?yōu)樯衬讣?xì)胞(gonocytes)，進(jìn)而在個(gè)體出生后發(fā)育成為包含SSCs在內(nèi)的未分化的精原細(xì)胞(spermatogonia)[1]。在精子發(fā)生過程中，不同的生精細(xì)胞在曲細(xì)精管中按照特殊的細(xì)胞聯(lián)系排列[7]。A型精原細(xì)胞是由生殖母細(xì)胞分化形成的橢圓形的未分化的精原細(xì)胞。根據(jù)局部排列將A型精原細(xì)胞分為As型(A-single, As)、Apr型(A-paired, Apr)及Aal型(A-aligned, Aal)。As型精原細(xì)胞分裂成為由兩個(gè)As 型精原細(xì)胞通過胞質(zhì)橋相連的Apr型精原細(xì)胞，繼續(xù)分裂可以形成4個(gè)、8個(gè)、16個(gè)的Aal型精原細(xì)胞，進(jìn)一步分裂形成A1、A2、A3、A4、中間型(intermediate, In)和B型精原細(xì)胞。雄性個(gè)體出生后，睪丸中A型精原細(xì)胞通過數(shù)次有絲分裂成為B型精原細(xì)胞，B型精原細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂進(jìn)一步分裂增大后成為精母細(xì)胞(sper-matocytes)，隨后進(jìn)入減數(shù)分裂產(chǎn)生圓形精子細(xì)胞(round sperma-tids)，然后經(jīng)過變形成為長形精子細(xì)胞(elongated spermatids)并進(jìn)入曲細(xì)精管管腔[8](圖1A)。雄性動(dòng)物性成熟后，精子細(xì)胞沿著曲細(xì)精管匯入睪丸網(wǎng)，隨后通過輸出小管進(jìn)入附睪停留并發(fā)育成熟，最后進(jìn)入輸精管。目前普遍認(rèn)為只有As 型精原細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性，既可以自我更新又可以分化形成Apr型、Aal型精原細(xì)胞，進(jìn)而啟動(dòng)精子發(fā)生以產(chǎn)生精 子。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，SSC群體不僅僅限于 As精原細(xì)胞群，一些Apr型和Aal 型精原細(xì)胞也 表現(xiàn)出干細(xì)胞特性[2]。與小鼠精子發(fā)生過程不同，非人靈長類動(dòng)物猴()精子發(fā)生從兩 種不同形態(tài)類型的未分化的精原細(xì)胞起始，根據(jù) 核形態(tài)和蘇木精染色亮度的差異被分為A dark和 A pale精原細(xì)胞[9]。隨后經(jīng)歷分裂產(chǎn)生B1、B2、 B3和B4型精原細(xì)胞，進(jìn)一步產(chǎn)生初級(jí)精母細(xì)胞(primary spermatocytes)、次級(jí)精母細(xì)胞(secondary spermatocytes)和精子細(xì)胞(spermatids)，它們經(jīng)歷精子發(fā)生以產(chǎn)生成熟精子[4](圖1C)。

圖1 部分動(dòng)物典型精子發(fā)生過程以及相應(yīng)的分子標(biāo)記物

A：小鼠精原干細(xì)胞的體內(nèi)發(fā)育譜系；B：小鼠體內(nèi)精原干細(xì)胞不同發(fā)育階段相對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記；C：猴精原干細(xì)胞的體內(nèi)發(fā)育譜系；D：猴體內(nèi)精原干細(xì)胞不同發(fā)育階段相對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記。PGCs在胚胎的發(fā)育過程中遷移至生殖嵴后分化為生殖母細(xì)胞，生殖母細(xì)胞增殖一段時(shí)間后進(jìn)入靜息狀態(tài)，在出生后第1周作為SSCs恢復(fù)生理活動(dòng)。隨著生長發(fā)育的進(jìn)行，SSCs不斷地增殖與分化以維持精子發(fā)生的穩(wěn)態(tài)。根據(jù)參考文獻(xiàn)[2, 4, 8, 10, 11]修改繪制。

1.2 精原干細(xì)胞的標(biāo)記

由于對(duì)SSCs的特征和分子標(biāo)記的認(rèn)識(shí)并不全面，不同物種SSCs的鑒別工作一直困擾著研究者們。小鼠中已報(bào)道的未分化精原細(xì)胞表達(dá)的分子標(biāo)記包括ITGA6、GFRα1PAX7ID4、EOMES、THY1、PLZF(ZBTB16)、UTF1、SALL4、LIN28、POU5F1(OCT4)和NANOS2等[1,4,12,13]，其中PAX7、ID4和EOMES只在As型精原細(xì)胞中表達(dá)。GFRα1、NANOS2和UTF1在As、Apr和Aal4精原細(xì)胞群中表達(dá)，而PLZF、SALL4和LIN28則在大部分As、Apr和Aal精原細(xì)胞群中表達(dá)[4]。SOHLH1、SOHLH2、NANOS3、NGN3以及C-KIT一般在已分化的精原細(xì)胞中表達(dá)，不過在未分化細(xì)胞群也有少量表達(dá)[4,10]。猴中已報(bào)道的未分化精原細(xì)胞的標(biāo)記包括GFRα1、PLZF、SALL4和LIN28。SOHLH1、NGN3和C-KIT則通常作為已分化精原細(xì)胞的分子標(biāo)記，但也在一些Apale精原細(xì)胞群中表達(dá)[4,9]。雖然小鼠以及猴的精原干細(xì)胞不同發(fā)育階段的分子標(biāo)記已研究的較為深入，并取得了較多的成果(圖1，B和D)，但是一些家畜類大動(dòng)物的SSCs分子標(biāo)記依然不夠明確。

最初在小鼠中發(fā)現(xiàn)未分化的精原細(xì)胞表達(dá)的早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白(promyelocytic leukaemia zinc finger protein, PLZF) (也稱為ZBTB16)是SSCs維持和自我更新所必需的轉(zhuǎn)錄因子[14]，隨后其在豬[15]、牛[16]、綿羊()[17]、山羊[18]和馬科()[19]動(dòng)物的生殖細(xì)胞和SSCs細(xì)胞亞群中的表達(dá)得到了驗(yàn)證。泛素羧基末端水解酶-1 (ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 1, UCHL1) (也稱為PGP 9.5)被鑒定為豬未分化精原細(xì)胞的分子標(biāo)記可能與SSCs的不對(duì)稱分裂有關(guān)，因?yàn)槲捶只?xì)胞中UCHL1的不對(duì)稱分離伴隨著自我更新和分化標(biāo)記的共定位[20]。磷脂酶D6 (phospholipase D6, PLD6)是位于細(xì)胞和線粒體表面的磷脂酶超家族成員之一，Zhou等[21]在進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸和培養(yǎng)的SSCs中特異性地高表達(dá)PLD6，細(xì)胞定位結(jié)果表明它主要在小鼠睪丸和培養(yǎng)的SSCs細(xì)胞膜中表達(dá)。因此，PLD6被認(rèn)為是小鼠SSCs的一種潛在的新型分子標(biāo)記。隨后在2018年，Zhang等[22]研究表明，PLD6在公豬睪丸組織未分化的精原細(xì)胞中特異性表達(dá)，并采用這種新型分子標(biāo)記通過免疫磁珠激活細(xì)胞分選(magnetic-activated cell sorting, MACS)富集到了豬未分化的精原細(xì)胞。GDNF家族受體α1(GFRα1)也被認(rèn)為是小鼠睪丸中未分化精原細(xì)胞的表面分子標(biāo)記[23]，最新研究表明它也是牛未分化精原細(xì)胞群的一種可靠的分子標(biāo)記[24]。近來對(duì)豬精原細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，青春期前后DDX4(DEAD-Box polypeptide 4，又稱VASA)和C-KIT的表達(dá)存在差異。DDX4和C-KIT可以作為青春期前豬睪丸中未分化精原細(xì)胞的潛在分子標(biāo)記；而在青春期后的豬睪丸中，它們則是分化的精母細(xì)胞的分子標(biāo)記[25]。這些基于小鼠模型的分子標(biāo)記的表達(dá)可以鑒定小鼠SSCs的存在，也可為其他物種SSCs的鑒定和體外培養(yǎng)提供參考。通過總結(jié)已有的文獻(xiàn)報(bào)道，大動(dòng)物SSCs可能的分子標(biāo)志物見表1。

1.3 精原干細(xì)胞微環(huán)境

青春期前的生殖細(xì)胞分化開始后，SSCs能夠持續(xù)分化提供精子，從而維持精子發(fā)生。理論上，SSCs可以對(duì)稱分裂產(chǎn)生兩個(gè)新的SSCs或分化的細(xì)胞，也可以進(jìn)行不對(duì)稱分裂產(chǎn)生一個(gè)新的SSCs和一個(gè)將繼續(xù)分化的祖代精原細(xì)胞(progenitor spermatogonia)[45]。為了保持無限的自我更新和分化能力以維持自身數(shù)量穩(wěn)定和精子發(fā)生，SSCs需要存在于一個(gè)能提供對(duì)其生存和分化潛力至關(guān)重要的因子及其相互作用的獨(dú)特的微環(huán)境。通過阻止SSCs分化來維持干細(xì)胞命運(yùn)的獨(dú)特的微環(huán)境被定義為“生態(tài)位”(Niche)，通常“生態(tài)位”本身是組織特異性的，隨著組織功能的狀態(tài)變化，“生態(tài)位”的特征可以通過支持細(xì)胞的貢獻(xiàn)來改變，以提示SSCs進(jìn)行對(duì)稱或不對(duì)稱分裂[45]。供體SSCs移植到已消除內(nèi)源性SSCs的受體動(dòng)物生精小管后可以成功定植，這證明了SSCs“生態(tài)位”的存在。在SSCs增殖期間，曲細(xì)精管似乎提供了支持新“生態(tài)位”形成的環(huán)境。Shinohara等[46]將SSCs移植到未成熟幼鼠(出生后第5~12天)和成年小鼠的睪丸中，結(jié)果顯示供體細(xì)胞在幼鼠中比在成年小鼠睪丸中定植機(jī)率高9.4倍，并且供體細(xì)胞定植的區(qū)域在受體幼崽睪丸中比成年睪丸大近4.0倍，這些結(jié)果表明SSCs可以在精子發(fā)生過程中發(fā)展出新的“生態(tài)位”。近年來發(fā)現(xiàn)SSCs的諸多功能(包括歸巢、自我更新和分化)受到這個(gè)高度動(dòng)態(tài)的“生態(tài)位”>精準(zhǔn)調(diào)控，參與調(diào)控SSCs增殖與分化的是多種細(xì)胞內(nèi)分泌因子以及與其相關(guān)的多個(gè)重要的信號(hào)通路，其中最重要的是膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)，它也是SSCs體外培養(yǎng)不可缺少的細(xì)胞因子[47]。

表1 大動(dòng)物精原干細(xì)胞的分子標(biāo)記

+：未分化的精原干細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)（方括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示參考文獻(xiàn)序號(hào)）；–：尚未確定是否表達(dá)。

SSCs“生態(tài)位”非常復(fù)雜，其構(gòu)成包括SSCs周圍的支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞、血-睪屏障及其周圍血管網(wǎng)等成分以及結(jié)合在胞外基質(zhì)上的多種生長因子和細(xì)胞因子等[48]。其中支持細(xì)胞是一種柱狀上皮細(xì)胞，為SSCs和分化的生殖細(xì)胞提供營養(yǎng)并介導(dǎo)復(fù)雜的信號(hào)以支持精子發(fā)生，同時(shí)又分泌產(chǎn)生許多影響精原細(xì)胞行為的生長因子[7]，如GDNF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和趨化因子(C-X-C基序)配體12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12, CXCL12)。支持細(xì)胞產(chǎn)生GDNF和bFGF，它們對(duì)體外培養(yǎng)SSCs的自我更新至關(guān)重要。同時(shí)，支持細(xì)胞在血-睪屏障形成中也起著重要作用，兩個(gè)支持細(xì)胞間形成緊密連接并且這個(gè)屏障可以起到將生精上皮的基底室中的精原細(xì)胞與頂端室中的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞分隔開的作用[49]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞是睪丸中主要的類固醇生成細(xì)胞，通過分泌因子影響SSCs，如胰島素生長因子1 (insulinlike growth factor-1, IGF1)和集落刺激因子1 (colony stimulating factor 1, CSF1)，其中CSF1表現(xiàn)出與GDNF的協(xié)同作用[50,51]。除了分泌CSF1的能力外，睪丸間質(zhì)細(xì)胞還能通過產(chǎn)生睪酮來刺激性腺的發(fā)育并維持精子發(fā)生[50]。另外，管周肌樣細(xì)胞能夠產(chǎn)生GDNF以及CSF1來調(diào)控SSCs的自我更新，而管周巨噬細(xì)胞在SSCs“生態(tài)位”中也起著十分重要的作用，它產(chǎn)生CSF1并表達(dá)參與維甲酸(retinoic acid, RA)生物合成的酶進(jìn)而調(diào)節(jié)精原細(xì)胞分化[52]。在了解SSCs微環(huán)境中的細(xì)胞組成，及其分泌的影響SSCs自我更新和分化的關(guān)鍵因子的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步闡明各關(guān)鍵因子的功能及其相互作用對(duì)于充分理解SSCs“生態(tài)位”至關(guān)重要[53]。

2 精原干細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)與移植

2.1 精原干細(xì)胞的分離純化

精原干細(xì)胞在成年小鼠睪丸中僅占總生殖細(xì)胞的0.02%~0.03%[54]。極其稀有的SSCs群體使得精原干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)十分困難。為了體外培養(yǎng)或操作這些細(xì)胞(如轉(zhuǎn)染、遺傳修飾等)，有必要分離和富集具有高純度和高活力的SSCs。分離精原干細(xì)胞的常用物理方法有差異平板培養(yǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)選擇(extracellular matrix, ECM)、速度沉降或密度梯度離心[55]。Izadyar等[56]采用Percoll密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法從5~7日齡牛睪丸中分離出A型精原細(xì)胞，純度達(dá)到67%~85%，表明富集技術(shù)的組合可以增加SSCs的純度。Tiptanavattana等[57]使用不同的ECM和不連續(xù)的梯度密度純化家貓()的SSC樣細(xì)胞，結(jié)果表明，用Percoll梯度密度離心和層粘連蛋白鋪板雙重富集可使家貓SSC樣細(xì)胞群體得到高度富集。

SSCs表面分子標(biāo)記的研究也為SSCs的高效分離奠定了基礎(chǔ)。熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence- activated cell sorting, FACS)或MACS可以獲得純度更高的SSCs，這兩種方法也經(jīng)常用于分離大動(dòng)物的SSCs。FACS主要是將SSCs與帶有免疫熒光的抗體相結(jié)合，從而依據(jù)所需的熒光信號(hào)收集目的細(xì)胞[55]。Kim等[36]選用豬A型精原細(xì)胞分子標(biāo)記PGP9.5進(jìn)行20%、30%、40%、50%和60% Percoll密度梯度沉降初選，收集每層的細(xì)胞并分析的表達(dá)，結(jié)果顯示40%Percoll梯度層大部分細(xì)胞呈PGP 9.5陽性。當(dāng)從30%和50%Percoll梯度層回收細(xì)胞時(shí)，只有1.7%±0.4%的細(xì)胞呈PGP 9.5陽性。而當(dāng)30%和50%Percoll梯度層的細(xì)胞群經(jīng)SSEA-1進(jìn)行標(biāo)記的FACS分選后，有48.2%±3.2%的SSEA-1陽性細(xì)胞，使來自豬的未分化精原細(xì)胞群顯著富集。

MACS是利用細(xì)胞表面抗原與連接有磁珠的特異性抗體相結(jié)合，在外加磁場的作用下通過磁珠把需要富集的細(xì)胞篩選出來[55]。Reding等[16]采用THY1-MACS來富集性成熟前的牛睪丸中未分化的精原細(xì)胞，THY1陽性群體中64.4%±5.0%的細(xì)胞表達(dá)PLZF；而未經(jīng)MACS富集的總睪丸細(xì)胞群中僅有24.7±3.5%的細(xì)胞表達(dá)PLZF。相比之下，MACS分選使PLZF陽性精原細(xì)胞富集了2.6倍(64.4/24.7)。Zhang等[22]使用PLD6-MACS從青春期前公豬睪丸組織中富集豬未分化的精原細(xì)胞，2×106分離的總細(xì)胞經(jīng)MACS分選得到3.24±0.48×105PLD6陽性細(xì)胞。隨后通過FACS檢測(cè)分選的PLD6陽性細(xì)胞中VASA、UCHL1和PLZF的表達(dá)，結(jié)果表明，PLD6陽性細(xì)胞群由91.31%±0.56%的VASA陽性細(xì)胞群、86.04%±0.63%的UCHL1陽性細(xì)胞群和84.45%± 0.35%的PLZF陽性細(xì)胞群組成。MACS分離的PLD6陽性細(xì)胞群體中含有84.45%的PLZF陽性精原細(xì)胞，這意味著在分選的部分中未分化的精原細(xì)胞(PLZF呈陽性)富集約8.4倍，使未分化的精原細(xì)胞得到高度純化與富集。由于MACS具有快速、方便，并且能很好地適應(yīng)較大細(xì)胞數(shù)量的粗單細(xì)胞懸液等諸多優(yōu)勢(shì)，MACS在從大動(dòng)物中分離和富集精原細(xì)胞方面發(fā)揮著越來越重要的作用。

2.2 精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)

SSCs的體外培養(yǎng)是擴(kuò)增和操作這種稀有細(xì)胞群的重要手段。鑒定影響SSCs自我更新的外在因素對(duì)建立SSCs的長期培養(yǎng)體系至關(guān)重要，因此有必要在已添加各種候選的體外生長因子的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)SSCs，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行移植來評(píng)估SSCs活性，進(jìn)而評(píng)估SSCs培養(yǎng)的體外因子需求[53,58]。體外培養(yǎng)的小鼠SSCs一般呈克隆團(tuán)形態(tài)，并松散地粘附于飼養(yǎng)層細(xì)胞上，單個(gè)細(xì)胞來源的克隆團(tuán)植入內(nèi)源生殖細(xì)胞缺陷的小鼠睪丸內(nèi)可以產(chǎn)生供體SSCs來源的后代，顯示體外培養(yǎng)的SSCs具有在體內(nèi)分化為精子并產(chǎn)生后代的能力[59]。為了研究飼養(yǎng)層細(xì)胞中GDNF的表達(dá)是否足以支持SSCs增殖，Wei等[60]用小鼠GDNF的cDNA構(gòu)建慢病毒顆粒以及表達(dá)GDNF的支持細(xì)胞系，研究發(fā)現(xiàn)使用該細(xì)胞系作為飼養(yǎng)層細(xì)胞體外培養(yǎng)SSCs時(shí)，SSCs的生長和增殖超過3個(gè)月，并且沒有明顯的表型變化或功能喪失。

即使研究人員對(duì)家畜SSCs的最佳體外培養(yǎng)條件進(jìn)行了大量探索，家畜等大動(dòng)物SSCs的長期體外培養(yǎng)也只能維持很短的時(shí)間，仍然處于起步階段[2]。但近來，也有一些大動(dòng)物SSCs在體外成功長期培養(yǎng)的報(bào)道，如豬[61]、牛[32,62,63]和樹鼩()[64]等。由于嚙齒類動(dòng)物SSCs的長期培養(yǎng)體系不能支持家畜SSCs的不斷增殖，因此推測(cè)可能是來自大型動(dòng)物的SSCs具有獨(dú)特的特征[65]。SSCs的富集方法、培養(yǎng)基組成中特定營養(yǎng)成分、適當(dāng)?shù)纳L因子的組合、各種類型的飼養(yǎng)層細(xì)胞以及不同的物理環(huán)境條件(如溫度、氧濃度等)是實(shí)現(xiàn)SSCs體外長期培養(yǎng)的關(guān)鍵因素[53]。在SSCs的體外培養(yǎng)體系中，為了保證SSCs的長期生長，必須在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)拇龠M(jìn)生長發(fā)育的物質(zhì)，如非必需氨基酸、谷氨酰胺和β-巰基乙醇等；同時(shí)還要添加一些必要的細(xì)胞因子，如GDNF、bFGF、IGF1、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)和表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)等[54]。通常在培養(yǎng)期間使用GDNF進(jìn)行小鼠SSCs的長期維持和自我更新，研究表明GDNF也在家畜SSCs的長期培養(yǎng)中發(fā)揮不可或缺的作用，另外血清和飼養(yǎng)層細(xì)胞也是SSCs長期培養(yǎng)不可或缺的組成部分[1]。SSCs培養(yǎng)一般添加1% 以上的優(yōu)質(zhì)胎牛血清作為對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的補(bǔ)充，體外培養(yǎng)的環(huán)境溫度、活性氧等也影響SSCs體外培養(yǎng)效率[63]。Oatley等[63]采用供體來源的牛胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)牛未分化的精原細(xì)胞成功存活了2個(gè)多月。Zhang等[61]使用新生仔豬支持細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，以DMEM/F12添加10%血清替代物(knockout serum replacement, KSR)和4種細(xì)胞因子(GDNF、GFRα1、bFGF和IGF1)作為培養(yǎng)基，未分化的豬精原細(xì)胞可以在體外增殖至少2個(gè)月而不喪失干性。然而迄今為止，仍沒有建立起能夠支持家畜等大動(dòng)物SSCs增殖和維持干性的長期培養(yǎng)體系，且培養(yǎng)后的SSCs不能在免疫功能缺陷的小鼠睪丸或同一物種受體睪丸中重建供體來源的精子發(fā)生[3,53]。大動(dòng)物體外長期培養(yǎng)體系的建立，不僅有助于研究SSCs的生物學(xué)功能，而且對(duì)SSCs的應(yīng)用(如遺傳修飾、輔助生殖等)至關(guān)重 要。因此，對(duì)家畜等大動(dòng)物SSCs體外長期培養(yǎng)條件的進(jìn)一步深入研究是后續(xù)SSCs成功應(yīng)用于實(shí)踐的基礎(chǔ)。

2.3 精原干細(xì)胞移植

SSCs移植是鑒定SSCs的黃金標(biāo)準(zhǔn)，也是實(shí)現(xiàn)SSCs具體應(yīng)用的最重要的技術(shù)手段。此過程將來自供體睪丸的SSCs移植到宿主的生精小管中，植入的SSCs可重新定植到基底膜，進(jìn)而啟動(dòng)精子發(fā)生過程并產(chǎn)生功能型精子。SSCs移植能使睪丸受損傷的雄性個(gè)體恢復(fù)生育能力，已成為精子發(fā)生和雄性遺傳改造極有價(jià)值的研究工具。1994年，Brinster等[66]首次將小鼠生殖細(xì)胞懸液注射到經(jīng)白消安(Busulfan)處理的生精缺陷小鼠曲細(xì)精管中，使受體小鼠精子發(fā)生得以恢復(fù)。該研究首次實(shí)現(xiàn)了SSCs的移植，證實(shí)了SSCs移植后繼續(xù)向精子分化的能力。SSCs移植主要分為以下幾個(gè)步驟：(1)供體SSCs的分離和純化；(2) SSCs體外處理(體外培養(yǎng)或者基因操作)；(3) SSCs的冷凍保存；(4)受體動(dòng)物的準(zhǔn)備，一般需缺失受體動(dòng)物內(nèi)源精子發(fā)生，為供體SSCs提供合適的睪丸微環(huán)境；(5) SSCs移植技術(shù)，即將SSCs移植到受體睪丸的曲細(xì)精管中。

根據(jù)供受體物種不同，SSCs移植技術(shù)可以分為同種移植和異種移植。同種移植是將一種動(dòng)物睪丸中的SSCs移植到與它同種的另一個(gè)體中。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了小鼠、大鼠、牛、豬、狗、羊和獼猴()等物種的同種移植，但只有小鼠、大鼠、山羊和綿羊通過生殖細(xì)胞移植產(chǎn)生了后代，其它物種的同種移植的研究還處于SSCs附植、增殖或產(chǎn)生供體衍生的精子等不同的階段[1,67,68]。異種移植是將一種動(dòng)物睪丸中的SSCs移植到與它不同種的另一個(gè)體中。Clouthier等[69]在小鼠睪丸中觀測(cè)到了植入的大鼠SSCs產(chǎn)生的完整的精子發(fā)生，為其他物種提供了異種精子發(fā)生的可能性。Dobrinski等[70]研究發(fā)現(xiàn)，豬供體生殖細(xì)胞可以在免疫缺陷小鼠體內(nèi)定植，但是未觀察到供體衍生的精子發(fā)生的后期階段；移植的牛睪丸細(xì)胞最初看起來與豬生殖細(xì)胞的定植特征相似，但隨后主要發(fā)育成受體曲細(xì)精管內(nèi)的纖維組織；在小鼠睪丸中，馬生殖細(xì)胞可以附植但幾乎沒有增殖。這些都表明來自大型動(dòng)物的新鮮或冷凍保存的生殖細(xì)胞可以定植免疫缺陷小鼠睪丸，但不能進(jìn)一步增殖與分化。大鼠()[69]、倉鼠()[71]SSCs作為供體移植到免疫缺陷的小鼠睪丸中，均檢測(cè)到了完整的供體來源的精子發(fā)生。這些都表明異種移植的成功可能依賴于供體和受體物種之間的系統(tǒng)發(fā)育距離的遠(yuǎn)近。但與嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行SSCs移植會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)不同的是，家畜等大動(dòng)物的SSCs同種移植并不會(huì)引起具有正常免疫功能的供受體間的免疫不相容[72]。盡管人們并不清楚造成這種種間差異的原因，然而普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，睪丸支持細(xì)胞在賦予供體細(xì)胞在受體中免疫豁免方面發(fā)揮著重要作用[73]。

如何準(zhǔn)確地將供體來源的SSCs移植到已消除內(nèi)源SSCs的受體動(dòng)物體內(nèi)是影響SSCs移植成敗的一個(gè)關(guān)鍵因素。研究較為成熟的是小鼠SSCs移植，有3種將供體細(xì)胞注入到受體睪丸中的注射方法可供選擇[74,75]：(1)微量移液管可以直接到插入生精小管中；(2)微量移液管直接插入到一個(gè)稱為睪丸網(wǎng)的收集系統(tǒng)中，該系統(tǒng)由許多生精小管末端附著形成；(3)微量移液管直接插入到睪丸的輸出小管。Ogawa等[75]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞懸液微量注射到曲細(xì)精管、輸出小管或睪丸網(wǎng)中對(duì)于在受體中產(chǎn)生供體SSCs衍生的精子發(fā)生同樣有效，但小鼠的SSCs移植方法作為一個(gè)模型，延伸到其他物種時(shí)應(yīng)根據(jù)物種的不同來選擇具體的供體細(xì)胞懸液注射方法。由于睪丸解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的物種特異性，特別是睪丸大小和結(jié)構(gòu)，因此小鼠的移植方法推廣到家畜等大動(dòng)物時(shí)需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。雖然在小鼠系統(tǒng)中開發(fā)了3種生殖細(xì)胞注射方法，但是通過超聲引導(dǎo)或者外科手術(shù)解剖的方法將供體的生殖細(xì)胞懸液注射到受體睪丸的睪丸網(wǎng)部位已經(jīng)被證明是家畜和伴生動(dòng)物等SSCs移植的一種可行的方案[68,76~79]。

無論用何種方法在受體睪丸中引入供體SSCs，為了實(shí)現(xiàn)定植，供體SSCs細(xì)胞必須從睪丸內(nèi)腔移位到曲細(xì)精管的基底膜上，這一過程受到受體睪丸中內(nèi)源SSCs存在的阻礙[74]。因此在消除受體動(dòng)物的內(nèi)源精子發(fā)生的同時(shí)保留受體睪丸曲細(xì)精管的正常結(jié)構(gòu)是決定SSCs移植成敗的又一個(gè)關(guān)鍵因素。當(dāng)前采取的主要手段有藥物處理、輻射和基因修飾操作。白消安是一種可以誘導(dǎo)分裂細(xì)胞凋亡的細(xì)胞周期特異性藥物，由于未分化的精原細(xì)胞比其他體細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，該細(xì)胞群極易受到白消安的影響而引起細(xì)胞凋亡，因而被廣泛應(yīng)用于消除受體動(dòng)物的內(nèi)源性生殖細(xì)胞[80]。注射白消安消除內(nèi)源生殖細(xì)胞群的效率具有劑量依賴性的特點(diǎn)。如何在完全消除受體動(dòng)物的內(nèi)源精子發(fā)生的同時(shí)，盡可能的減少對(duì)受體動(dòng)物副作用是該方法所面臨的主要問題[81]。亞致死劑量的白消安有助于消除內(nèi)源精子發(fā)生，但不會(huì)損傷曲細(xì)精管的微環(huán)境。Ogawa等[81]采用腹腔注射白消安的方法消除受體大鼠的內(nèi)源性SSCs，取得了比阿霉素等更完全的內(nèi)源性SSCs消除效果。Lin等[82]直接將白消安注入到豬陰囊的鞘膜腔中，使完整的內(nèi)源生殖細(xì)胞丟失，為外源SSCs的進(jìn)入提供了有利的微環(huán)境。另一種消除內(nèi)源精子發(fā)生的方法是直接對(duì)成體睪丸進(jìn)行輻射。由于對(duì)睪丸進(jìn)行局部輻射而不損害體內(nèi)其他組織，因此對(duì)受體動(dòng)物的毒副作用比藥物處理低。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)常規(guī)小鼠進(jìn)行X射線局部照射時(shí)，使用1.5+8Gy或1.5+12Gy劑量可以較為完全地破壞受體睪丸精原細(xì)胞，且對(duì)其他細(xì)胞幾乎沒有損傷[83]。Izadyar等[68]用10~14Gy劑量X射線局部照射牛睪丸制備受體，移植后睪丸能支持供體SSCs的增殖與分化并產(chǎn)生精子。

新近開發(fā)的基因編輯技術(shù)提供了一種新的消除動(dòng)物內(nèi)源SSCs的理想方法。利用基因編輯技術(shù)敲除某種僅在雄性生殖細(xì)胞中表達(dá)并在其存活中起關(guān)鍵作用的基因，可以起到消除內(nèi)源SSCs且不影響其他支持細(xì)胞的效果，獲得“唯支持細(xì)胞表型”。完整的支持細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)可以保留睪丸的正常結(jié)構(gòu)，為SSCs的移植提供了良好的生長環(huán)境[84]。Tsuda等[85]研究發(fā)現(xiàn)，前體雄性生殖細(xì)胞在基因敲除小鼠的睪丸中經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致成年期完全不育。Suzuki等[86]研究發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠敲除基因會(huì)因精母細(xì)胞前體凋亡而不育，但純合子敲除雌性以及雜合子敲除雄性和雌性具有正常的生殖細(xì)胞系，并且可育。Park等[84]使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功的在豬胚胎中基因編碼區(qū)產(chǎn)生了失活突變，獲得了內(nèi)源性生殖細(xì)胞近乎完全消融但曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)完整的理想豬模型。同時(shí)，由于基因敲除豬與基因敲除小鼠的表型相似，當(dāng)雜合子敲除豬雄性與純合子敲除豬雌性(均可育)交配時(shí)，可以高效地產(chǎn)生基因敲除豬。因此，純合子敲除雄性會(huì)大大減少內(nèi)源的生殖細(xì)胞，可作為理想的SSCs移植受體。

3 大動(dòng)物精原干細(xì)胞

3.1 豬

豬是與人類生活息息相關(guān)的家畜之一，作為重要的農(nóng)業(yè)資源為人類提供大部分的肉食，而且由于其在解剖學(xué)和生理學(xué)上與人類的高度相似性，也越來越多地被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。豬SSCs體外培養(yǎng)技術(shù)仍需完善。Zhang等[61]使用支持細(xì)胞作為飼養(yǎng)層和補(bǔ)充含有KSR、GDNF、bFGF、GFRα1和IGF1的細(xì)胞因子組合的培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)豬未分化的精原細(xì)胞，超過2個(gè)月仍具有正常核型。Wang等[87]使用差速貼壁法和支持細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，豬SSCs能夠在體外傳代培養(yǎng)至15代。Park等[88]采用基于瓊脂糖的水凝膠三維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)豬SSCs，有效地維持豬SSCs的干細(xì)胞特性并促進(jìn)豬SSCs的增殖。與二維培養(yǎng)環(huán)境相比，豬SSCs在三維微環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)與SSCs自我更新相關(guān)的基因沒有明顯的轉(zhuǎn)錄或翻譯下調(diào)，、、的轉(zhuǎn)錄水平和PLZF、OCT4、SOX2蛋白水平明顯增加，此外精原細(xì)胞分化的標(biāo)志的轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)，這些都表明在 三維微環(huán)境中豬SSCs可以更有效地維持在未分化狀態(tài)。

體外培養(yǎng)的豬SSCs可以移植到曲細(xì)精管后重新啟動(dòng)宿主睪丸中供體SSCs衍生的精子發(fā)生[55]。Honaramooz等[77]使用PKH26紅色熒光染料標(biāo)記青春期前的供體公豬的睪丸細(xì)胞，在超聲引導(dǎo)下將供體來源的生殖細(xì)胞懸液注入受體豬睪丸網(wǎng)。通過檢查睪丸中熒光標(biāo)記供體細(xì)胞的定位，在接受生殖細(xì)胞移植的11只受體豬中，有10只豬的睪丸生精小管中發(fā)現(xiàn)了移植的供體細(xì)胞，并且移植的細(xì)胞在受體睪丸中保留至少1個(gè)月。這些結(jié)果表明生殖細(xì)胞移植在未性成熟豬中是可行的。內(nèi)源SSCs的缺失可以提高植入SSCs定植的效率。利用藥物處理消除內(nèi)源SSCs所需的藥物劑量、注射途徑、受體年齡都影響藥物處理的效果。Honaramooz等[76]用白消安(7.5 mg/kg)處理第98天和108天妊娠母豬子宮，以消融仔豬內(nèi)源性的生殖細(xì)胞，結(jié)果顯示經(jīng)白消安處理的妊娠母豬的仔豬生殖細(xì)胞數(shù)量在出生后第2、4和8周顯著減少，到16周齡時(shí)，只有不到8%的曲細(xì)精管橫切面含有減數(shù)分裂的生殖細(xì)胞。因此，用低劑量白消安對(duì)晚期妊娠母豬進(jìn)行子宮內(nèi)處理可導(dǎo)致內(nèi)源生殖細(xì)胞群的減少，這可以促進(jìn)生殖細(xì)胞移植后的供體細(xì)胞定植。豬SSCs研究進(jìn)展緩慢主要是由于對(duì)豬SSCs自我更新和分化的機(jī)制還知之甚少；豬SSCs分離富集的方法效率不高，用于SSCs移植的受體動(dòng)物的有效制備和SSCs移植方法還有待進(jìn)一步研究；同時(shí)，如何高效準(zhǔn)確地進(jìn)行SSCs原位移植也是實(shí)際操作中的難點(diǎn)之一[80]。

基因修飾技術(shù)的不斷發(fā)展為SSCs的研究提供了新思路。近年來，研究人員可以通過將外源基因隨機(jī)整合到細(xì)胞基因組中或人工核酸酶精確的基因組編輯方法對(duì)家畜等大動(dòng)物雄性生殖系干細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾[73]。Kim等[89]將經(jīng)EGFP標(biāo)記的豬SSCs移植到內(nèi)源性精原干細(xì)胞消除的受體豬中，成功產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因精子，并且采用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技術(shù)可以使卵子受精。Tang等[90]設(shè)計(jì)了一對(duì)專門針對(duì)豬杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne's muscular dystrophy, DMD)基因座的TALENs (DMD7.1)，通過核轉(zhuǎn)染的方法將TALENs引入豬精原細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的基因打靶。在豬中，基于ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因技術(shù)尚不能應(yīng)用且當(dāng)前生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的方法存在效率低下、花費(fèi)高昂等缺點(diǎn)[3]，所以基于豬SSCs的基因工程生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬將具有巨大的潛力。

3.2 牛

牛具有體質(zhì)強(qiáng)壯、適應(yīng)性強(qiáng)、食物范圍廣、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，在我國的畜牧業(yè)中有著舉足輕重的地位。但是牛SSCs的研究仍然處于探索的階段，還存在許多待解決的問題，如SSCs體外存活時(shí)間短、分裂增殖能力差、長期培養(yǎng)體系尚未建立、體外培養(yǎng)時(shí)無法長久保持分化潛能等[91]。目前，諸多小鼠上的分子標(biāo)記被證實(shí)可用于鑒定牛SSCs。Fujihara 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，UCHL1在雄性生殖細(xì)胞中表達(dá)，并且在體細(xì)胞中不表達(dá)，可以作為分子標(biāo)記鑒定、富集以及純化牛SSCs。植物凝集素(dolichos biflorus agglutinin, DBA)特異性結(jié)合牛睪丸內(nèi)的末端N-乙酰半乳糖胺殘留物，廣泛應(yīng)用于生殖母細(xì)胞和SSCs的富集與標(biāo)記[29]。牛SSCs的長期培養(yǎng)條件仍需完善，Aponte等[92]用牛支持細(xì)胞做飼養(yǎng)層，最低必須培養(yǎng)基(minimum essential medium, MEM)體外培養(yǎng)牛精原干細(xì)胞可使A 型精原細(xì)胞在體外存活至少1個(gè)月。Oatley等[63]采用供體來源的牛胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)牛未分化的精原細(xì)胞，成功存活了兩個(gè)多月，基于細(xì)胞團(tuán)形態(tài)與小鼠精原細(xì)胞的高度相似性以及保守分子標(biāo)記PLZF、LIN28、NANOS2、GFRα1和ID4等的表達(dá)，培養(yǎng)的細(xì)胞被證實(shí)是未分化的精原細(xì)胞。

Dobrinski等[70]將牛生殖細(xì)胞異種移植到受體小鼠中，發(fā)現(xiàn)牛異種移植時(shí)生殖細(xì)胞最初看起來與豬生殖細(xì)胞特征相似，但隨后主要發(fā)育成受體曲細(xì)精管內(nèi)的纖維組織。該結(jié)果表明來自牛的新鮮或冷凍保存的生殖細(xì)胞可以定植小鼠睪丸，但不能分化超出精原細(xì)胞擴(kuò)增階段。Izadyar等[68]分離5個(gè)月大荷斯坦–弗里斯蘭牛犢睪丸的A型精原細(xì)胞，一半閹割進(jìn)行自體移植，一半進(jìn)行同種移植。移植前用10~14Gy的X射線局部照射受體睪丸以消耗內(nèi)源性精子發(fā)生。在照射后2個(gè)月，通過長注射針、超聲波檢查和超聲造影劑溶液將A型精原細(xì)胞(約10× 106)注射到受體睪丸中。移植后2.5個(gè)月，取睪丸樣本進(jìn)行組織學(xué)檢查，結(jié)果顯示經(jīng)輻照的非移植對(duì)照組睪丸中只有45%的生精小管含有A型精原細(xì)胞，而在自體精原細(xì)胞移植組超過80%的生精小管橫切面含有A型精原細(xì)胞。自體精原細(xì)胞移植后，約60%的生精小管含有精母細(xì)胞、30%的生精小管含有精子細(xì)胞；而同種移植后未發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞再增殖的改善。該研究結(jié)果首次證明了牛SSCs的自體移植是可行的，并且形成了完整的精子發(fā)生。2006年，Herrid等[93]采用青春期前的不同品種的牛進(jìn)行了SSCs移植試驗(yàn)，用熒光染料PKH26標(biāo)記經(jīng)酶消化制備的供體睪丸細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，然后在超聲介導(dǎo)下轉(zhuǎn)移到具有完整的內(nèi)源種系的受體公牛睪丸的睪丸網(wǎng)中。移植幾周到幾個(gè)月后，經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞仍存在于受體睪丸中，表明移植的供體生殖細(xì)胞在受體睪丸中持續(xù)存在。3年后，該小組采用相同的方法將來自供體公牛犢的睪丸細(xì)胞懸液移植到青春期前(5~9個(gè)月齡)受體公牛睪丸網(wǎng)中，在生殖細(xì)胞移植后52~56周從6個(gè)受體獲得精液樣品，并在此后46周的時(shí)間內(nèi)再收集4次，樣品中供體DNA是否存在由微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行確定。其中一個(gè)受體公牛的精液樣本顯示對(duì)供體來源的細(xì)胞呈陽性，但受體精子中供體精子的百分比隨時(shí)間而下降。這些結(jié)果首次表明，不同品種的牛之間的睪丸生殖細(xì)胞移植是可行的，并且移植后受體公牛能夠產(chǎn)生供體來源的精子[94]。然而，這些結(jié)果并不能令人信服，因?yàn)槭荏w公牛中仍存在內(nèi)源SSCs，而且不可能區(qū)分供體和受體來源的精子[74]。

3.3 羊

羊SSCs的體外培養(yǎng)以及移植研究對(duì)于羊高效繁育技術(shù)的研究、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊和保存優(yōu)良羊品種具有重要意義。羊SSCs移植雖然有成功的報(bào)道，但是其一般是供體睪丸的生殖細(xì)胞混合液移植到受體睪丸內(nèi)且其效率較低，穩(wěn)定的羊SSCs分離、培養(yǎng)和移植技術(shù)流程依然有待完善[67,95]。羊SSCs目前只能進(jìn)行初步的分離和短期的體外培養(yǎng)，其富集純化的方法還不夠成熟，純化的效果很不理想，體外培養(yǎng)的體系還沒有建立，在體外增殖分化過程中的多種細(xì)胞因子的作用還沒有完全了解。

2003年，Honaramooz等[68]用熒光親脂性染料PKH26標(biāo)記來自山羊的供體細(xì)胞，在移植后12周的期間內(nèi)，每3周檢查受體睪丸中被標(biāo)記供體細(xì)胞的存在和定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有睪丸的曲細(xì)精管中均有標(biāo)記的供體細(xì)胞，受體睪丸的組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)除了針插入部位的有限纖維變化外無明顯的組織損傷，這些結(jié)果表明生殖細(xì)胞移植在未性成熟的雄性山羊中在技術(shù)上是可行的。并且供體來源的細(xì)胞在受體睪丸中保留至少3個(gè)月并且移植后在受體山羊中檢測(cè)到了供體精子的存在。Herrid等[67]對(duì)受體美利奴公羊進(jìn)行輻照以消除內(nèi)源生殖細(xì)胞，并將邊區(qū)萊斯特羊的睪丸生殖細(xì)胞移植到受體睪丸內(nèi)。通過采集受體精液對(duì)50只美利奴母羊進(jìn)行子宮內(nèi)人工授精，每個(gè)子宮角接受約(4~5)×106個(gè)運(yùn)動(dòng)精子，結(jié)果產(chǎn)生了6只供體基因型的成活后代。該研究通過移植產(chǎn)生了供體SSCs來源后代，表明不同品種的公羊之間的睪丸生殖細(xì)胞移植是可行的。

3.4 猴

作為最接近于人類的模式大動(dòng)物，猴SSCs的體外培養(yǎng)條件的研究和移植技術(shù)的突破將對(duì)人類SSCs相關(guān)研究和臨床應(yīng)用提供重要的臨床前參考。SSCs的稀有性要求更加有效的分離選擇方法，但人們對(duì)體外猴SSCs增殖的培養(yǎng)條件仍知之甚少[30]。近來研究表明，與其他無血清培養(yǎng)基(包括小鼠無血清培養(yǎng)基和大鼠無血清培養(yǎng)基)相比，猴生殖細(xì)胞在補(bǔ)充4種生長因子(bFGF、GDNF、LIF和EGF)的StemPro培養(yǎng)基(StemPro-34-based medium)中，于 37℃溫度條件下更好地維持增殖[30]。首次對(duì)大型動(dòng)物SSCs移植是2002年在猴中進(jìn)行的，Schlatt等[96]將食蟹獼猴()的睪丸生殖細(xì)胞移植到受體睪丸中，4周后在其中一只猴子的生精上皮基膜上發(fā)現(xiàn)了供體來源的B型精原細(xì)胞。Hermann等[97]通過超聲引導(dǎo)的睪丸網(wǎng)注射，將經(jīng)慢病毒處理的半閹割自體SSCs移植到12只成年和5只青春期前經(jīng)白消安處理的受體獼猴的生精小管中。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在自體移植后，在12只成年獼猴和白消安處理的5只獼猴性成熟后的精液中，分別有9只和3檢測(cè)到了慢病毒攜帶的轉(zhuǎn)基因，顯示了植入SSCs的成功定植并分化為精子。通過ICSI技術(shù)將來自供體SSCs的精子注射到85個(gè)恒河猴()卵母細(xì)胞中，有81個(gè)卵母細(xì)胞受精，產(chǎn)生從4細(xì)胞到胚泡的胚胎，在81個(gè)胚胎中有7個(gè)胚胎是來自供體SSCs分化的精子。這些結(jié)果表明移植后的非人靈長類動(dòng)物猴SSCs能重啟精子發(fā)生過程，且分化的精子能夠支持受精和完成胚胎植入前的發(fā)育。Fayomi等[98]將新鮮分離和冷凍保存的青春期前睪丸組織自體移植到閹割的青春期恒河猴的背部皮膚或陰囊皮下，移植后觀察到移植的睪丸組織生長并產(chǎn)生睪酮、進(jìn)而恢復(fù)精子發(fā)生產(chǎn)生使恒河猴卵子受精的功能型精子。隨后采用ICSI技術(shù)獲得不同時(shí)期的胚胎，胚胎移植到代孕母體后可以完成發(fā)育并獲得了健康的后代，為睪丸組織移植的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3.5 其他動(dòng)物

家貓是貓科家族的代表，也是發(fā)育生物學(xué)、生理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究的重要模型[99]，并且與其他高等哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生起始和調(diào)節(jié)過程十分相似[100]。目前對(duì)貓SSCs的表達(dá)模式還知之甚少。Powell等[101]發(fā)現(xiàn)家貓未分化的A型精原細(xì)胞表達(dá)GFRα1標(biāo)記，這些細(xì)胞位于生精小管的基底膜并表達(dá)SSCs的特異性基因。Silva等[102]獲得的數(shù)據(jù)表明，來自家貓和豹貓()的供體生殖細(xì)胞能夠在經(jīng)X射線處理消除內(nèi)源生殖細(xì)胞的家貓睪丸中定植，并形成更成熟的生殖細(xì)胞。由于多數(shù)貓科動(dòng)物都處于瀕臨滅絕或是生存受到威脅的狀態(tài)，開發(fā)有效同種和異種貓科動(dòng)物SSCs移植的程序?yàn)榉敝骋吧埧拼髣?dòng)物提供候選方案。鑒于家貓是瀕危貓科動(dòng)物保護(hù)的潛在模型，因此相關(guān)物種珍貴遺傳物質(zhì)能否成功保存取決于能否建立體外擴(kuò)增家貓SSCs的培養(yǎng)體系[103]。

狗因其大小、壽命、生理學(xué)和遺傳學(xué)等參數(shù)與人類相似，因此被認(rèn)為是研究疾病的遺傳基礎(chǔ)和再生治療的最佳預(yù)測(cè)模型[104]。Kim等[105]在移植前對(duì)5個(gè)月大的狗進(jìn)行輻射處理以消除內(nèi)源的生殖細(xì)胞但保留較為完整的睪丸結(jié)構(gòu)，供體來源的生殖細(xì)胞注射后12個(gè)月從受體附睪中收集精子檢測(cè)，基于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)的定量PCR的結(jié)果顯示約在受體中有19.5%的供體來源的精子，這也是狗首次成功完成同種移植并產(chǎn)生了供體來源的精子。

樹鼩是應(yīng)用于若干人類重要疾病如HBV、HCV感染以及抑郁癥的重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?017年，樹鼩SSCs在其基因修飾和移植上取得重大突破。Li等[64]使用THY1表面蛋白富集樹鼩 SSCs，在樹鼩支持細(xì)胞作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)時(shí)，SSCs可大量增殖并長期存活。樹鼩SSCs增殖后用表達(dá)EGFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染，移植到已通過腹腔內(nèi)注射白消安(40 mg/kg)消除內(nèi)源生殖細(xì)胞的成年雄性樹鼩睪丸后，EGFP標(biāo)記的SSCs能夠恢復(fù)精子發(fā)生并成功產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。該研究利用SSCs轉(zhuǎn)基因和移植制作出了轉(zhuǎn)基因樹鼩，為其他多種無成熟胚胎操作技術(shù)物種的輔助生殖技術(shù)開發(fā)、轉(zhuǎn)基因/基因修飾動(dòng)物制備提供了重要技術(shù)手段。

4 結(jié)語與展望

相比于嚙齒類動(dòng)物SSCs的分離培養(yǎng)、遺傳修飾以及細(xì)胞移植等方面的研究，大動(dòng)物的SSCs體外培養(yǎng)及移植等方面的研究仍然處于起步階段。SSCs作為家畜等大動(dòng)物的輔助生殖技術(shù)的成功應(yīng)用還存在諸多未解決的問題，其中最重要的有以下兩點(diǎn)： (1)大動(dòng)物SSCs的體外穩(wěn)定和長期培養(yǎng)。培養(yǎng)基是SSCs體外培養(yǎng)的關(guān)鍵。適量的生長因子是大動(dòng)物SSCs體外培養(yǎng)不可缺少的，但大動(dòng)物SSCs培養(yǎng)時(shí)，嚙齒動(dòng)物SSCs培養(yǎng)中常用生長因子(如bFGF、EGF和LIF等)的功能仍不清楚。自體支持細(xì)胞通常作為大動(dòng)物SSCs長期培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞，但支持細(xì)胞可能會(huì)分泌一些促進(jìn)SSCs分化的生長因子。Zheng等[1]推測(cè)，家畜SSCs長期培養(yǎng)時(shí)使用支持細(xì)胞或?qū)诱尺B蛋白(laminin)替代飼養(yǎng)層細(xì)胞效果會(huì)更好。通過解析體外培養(yǎng)過程中的分子機(jī)制，有望獲得更優(yōu)越的大動(dòng)物SSCs培養(yǎng)體系。(2)受體動(dòng)物的處理。白消安處理具有劑量依賴性效應(yīng)，雖然可以較好地消除內(nèi)源SSCs，但其造成的副作用仍然難以解決，如白消安會(huì)消融骨髓干細(xì)胞，常常導(dǎo)致貧血[80]；在消融內(nèi)源的SSCs的同時(shí)會(huì)損傷其支持細(xì)胞等[106,107]。而且與所有化學(xué)治療藥物一樣，由于個(gè)體的差異，白消安通過糞便和尿液從家畜體內(nèi)排出的時(shí)間跨度不同，這些細(xì)微差別可能會(huì)引起生物安全問題。輻射處理可以通過局部照射睪丸而到達(dá)消融受體睪丸內(nèi)源SSCs的目的。但是，成年雄性受體的睪丸的大尺寸可能需要極高劑量才能消除所有內(nèi)源性SSCs，而一些內(nèi)源性精原細(xì)胞可能經(jīng)輻射嚴(yán)重?fù)p害后仍然存活，如若進(jìn)一步發(fā)育成精子細(xì)胞，可能會(huì)將獲得的基因組畸變傳遞到下一代[108]。并且輻射處理的所需的儀器設(shè)備、操作過程的繁復(fù)及不穩(wěn)定性都限制了輻射處理的廣泛應(yīng)用?；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展為建立內(nèi)源SSCs缺失動(dòng)物提供了一種新思路，CRISPR/ Cas9技術(shù)敲除豬的基因提供了理想的SSCs移植受體動(dòng)物，并且可以預(yù)計(jì)有其他多種候選基因的修飾可以獲得同樣的效果。在實(shí)際操作中，人們可以維持可育的基因修飾雜合子群體以達(dá)到長期保有受體動(dòng)物的目的，在使用時(shí)通過配種獲得純合子動(dòng)物用于移植受體。

穩(wěn)定的SSCs體外培養(yǎng)和移植技術(shù)的建立無論對(duì)農(nóng)業(yè)還是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有重要意義。主要表現(xiàn)在：(1)快速擴(kuò)繁優(yōu)良種畜和保存瀕危物種。優(yōu)良種畜的經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)大于其飼養(yǎng)價(jià)值，通過分離富集優(yōu)良種畜的SSCs，可以在體外培養(yǎng)條件下擴(kuò)繁SSCs，然后通過高效的移植技術(shù)將SSCs移植到生育能力受損的公畜睪丸內(nèi)就可以快速繁殖優(yōu)良種畜。同時(shí)我們可以通過SSCs的保存和移植對(duì)我國的畜禽地方品種和瀕危物種進(jìn)行保護(hù)。(2)制作轉(zhuǎn)基因家畜。目前常用的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜的方法主要是原核顯微注射法、胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染法和體細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)合細(xì)胞核移植。但是這些方法都需要成熟的胚胎操作技術(shù)手段和設(shè)備，故而在一定程度上限制轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用。SSCs的體外長期培養(yǎng)并發(fā)育成功能型精子為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜提供了一種新方法。通過轉(zhuǎn)基因SSCs，而后進(jìn)行細(xì)胞移植即可以制作出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該方法不需要復(fù)雜的顯微操作技術(shù)和昂貴的設(shè)備，具有廣泛的應(yīng)用和推廣價(jià)值。(3)服務(wù)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。大動(dòng)物SSCs的研究和移植可以為人類生殖相關(guān)研究、男性不育相關(guān)致病的細(xì)胞治療提供重要的臨床前實(shí)驗(yàn)依據(jù)。人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs)、和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)已成功分化為原始生殖細(xì)胞(PGCs)，并獲得了在兩個(gè)基因座(、)類似于人類精子單親基因組印記的精子樣細(xì)胞(spermatid-like cells)[109]。此外，其他類型的干細(xì)胞也已經(jīng)被證明可以分化為PGC樣細(xì)胞(PGC-like cells)，且這些細(xì)胞在移植到不育小鼠睪丸后可以產(chǎn)生有功能的單倍體精子細(xì)胞(haploid sperm cells)[110]。雖然其他干細(xì)胞可以分化為PGC樣細(xì)胞并產(chǎn)生有功能的單倍體精子細(xì)胞，但這些精子細(xì)胞的發(fā)育潛力以及存活率仍然很低[110]。故而大動(dòng)物SSCs的研究與進(jìn)步都將為人類生殖發(fā)育的基礎(chǔ)研究、更好的為人類雄性不孕治療提供一些新的策略。隨后Wang等[87]研究發(fā)現(xiàn)，與其他的成體干細(xì)胞相似，SSCs可以去分化成為具有胚胎干細(xì)胞特性的多能性干細(xì)胞，該多能性干細(xì)胞在特定的培養(yǎng)條件下可以被誘導(dǎo)分化為造血細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，并且在早期發(fā)育階段注入胚泡時(shí)能夠發(fā)育成各種器官。這使得SSCs還可以作為提供重要細(xì)胞的來源服務(wù)于再生醫(yī)學(xué)。

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Progress on spermatogonial stem cells of large animals

Xin Zhao, Huaqiang Yang

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spermatogonial stem cell; large animals; cell transplantation; spermatogenesis

2019-06-10;

2019-07-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31772555)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31772555)]

趙鑫，碩士研究生，專業(yè)方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail: 17727753812@163.com

楊化強(qiáng)，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：大動(dòng)物基因修飾。E-mail: yangh@scau.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-167

2019/8/5 20:59:45

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190805.2059.001.html

(責(zé)任編委: 苗龍)