盧渙滋，王迪侃，王智

HPV陽(yáng)性口咽癌患者預(yù)后與T細(xì)胞浸潤(rùn)和新抗原負(fù)荷相關(guān)性分析

盧渙滋，王迪侃，王智

中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院，廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510080

口咽癌是頭頸鱗癌中重要的癌種之一，與人類(lèi)乳頭瘤狀病毒(human papillomavirus, HPV)感染有關(guān)，其發(fā)病率逐年上升。但在臨床治療過(guò)程發(fā)現(xiàn)，HPV陽(yáng)性口咽癌患者整體預(yù)后好于HPV陰性患者。目前，導(dǎo)致這一現(xiàn)象發(fā)生的分子機(jī)制尚不明確。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)HPV陽(yáng)性和陰性患者的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和效應(yīng)功能以及新抗原負(fù)荷進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPV陽(yáng)性患者的總體生存率比HPV陰性患者顯著提高。對(duì)腫瘤組織中的免疫細(xì)胞相對(duì)豐度進(jìn)行分析顯示，HPV陽(yáng)性患者的CD8+T細(xì)胞較HPV陰性患者顯著提高，其效應(yīng)分子IFN-γ和Granzyme B表達(dá)量顯著升高。同時(shí)對(duì)新抗原數(shù)目進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HPV陽(yáng)性患者腫瘤組織中新抗原較HPV陰性患者低。本研究結(jié)果為HPV相關(guān)口咽癌的治療提供了一定的基礎(chǔ)理論支撐。

口咽癌；人類(lèi)乳頭瘤狀病毒；生物信息學(xué)分析；T細(xì)胞浸潤(rùn)；新抗原負(fù)荷

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSC)是全球范圍內(nèi)發(fā)病率排名第7的癌癥，每年新增病例達(dá)60萬(wàn)[1]。頭頸鱗癌包括口腔癌、口咽癌、喉癌等，盡管目前治療理念已從手術(shù)治療發(fā)展為以手術(shù)為主，放化療及靶向藥物治療為輔助的綜合治療模式[2]，但其5年總體生存率并無(wú)顯著提高(50%)[3]?？谘拾┦穷^頸鱗癌中的一種重要亞類(lèi)，相對(duì)于其他頭頸腫瘤，口咽癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)[4]。同時(shí)，相比于口腔癌，其預(yù)后更差[5]；且因其位置關(guān)系，術(shù)后常導(dǎo)致患者出現(xiàn)言語(yǔ)及進(jìn)食功能障礙，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[6]。

口咽癌的致病因素包括煙、酒、檳榔，以及人類(lèi)乳頭瘤狀病毒(human papillomavirus, HPV)等。其中，HPV16型(p16)是導(dǎo)致口咽癌的主要病毒[7]。據(jù)報(bào)道，在美國(guó)，HPV感染已經(jīng)成為最主要的口咽癌致病因素，帶來(lái)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[8]。有趣的是，當(dāng)研究HPV陽(yáng)性(HPV+)和HPV陰性(HPV–)口咽癌患者的預(yù)后時(shí)發(fā)現(xiàn)，HPV+患者的總生存率顯著高于HPV–患者[9]。導(dǎo)致HPV+口咽癌患者預(yù)后較好的原因，目前仍未完全闡明。有研究表明，HPV+口咽癌患者腫瘤細(xì)胞中基因突變率較低，所以對(duì)放化療敏感性高[10]；另一項(xiàng)研究表明，HPV+頭頸鱗癌中免疫細(xì)胞，特別是T細(xì)胞的浸潤(rùn)更加豐富，是一種“熱腫瘤”，因此對(duì)放化療及免疫治療等較敏感[11]。然而，目前對(duì)HPV相關(guān)口咽癌的免疫微環(huán)境及其與腫瘤突變的關(guān)系的研究仍較缺乏。

本研究將從免疫細(xì)胞浸潤(rùn)角度，利用生物信息學(xué)分析方法，闡述HPV+和HPV–口咽癌患者中的CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度差異，并分析其效應(yīng)分子的表達(dá)差異，同時(shí)分析HPV+和HPV–腫瘤的基因突變負(fù)荷，為更深入理解HPV相關(guān)口咽癌提供一個(gè)新的方向，同時(shí)為HPV+口咽癌的治療方案的優(yōu)化提供一定的基礎(chǔ)理論支撐。

1 材料與方法

1.1 口咽癌患者隊(duì)列的獲取

口咽癌患者隊(duì)列來(lái)自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)中的HNSC患者，TCGA是由美國(guó)國(guó)立癌癥研究院和美國(guó)國(guó)立人類(lèi)基因組研究院合作開(kāi)展的腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)劃，旨在通過(guò)高通量測(cè)序和多維度分析方法來(lái)深入了解多種腫瘤在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中基因水平、轉(zhuǎn)錄水平及表觀遺傳水平等層面的變化情況[12]。其中頭頸鱗癌患者基本信息、3級(jí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果和腫瘤突變數(shù)據(jù)從UCSC Xena上下載(https://xenabrowser.net/datapages/)?？谘拾┗颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)為：腫瘤解剖部位為舌根(base of tongue)，扁桃體(tonsil)和口咽部(oropharynx)，排除標(biāo)準(zhǔn)為接受術(shù)前新輔助化療的患者?；颊叩腍PV狀態(tài)由人類(lèi)乳頭狀瘤病毒p16陽(yáng)性或陰性進(jìn)行鑒定，根據(jù)HPV狀態(tài)，將口咽癌患者分為HPV+組及HPV–組。

1.2 免疫細(xì)胞構(gòu)成比計(jì)算

將口咽癌患者的3級(jí)FPKM標(biāo)準(zhǔn)化的Illumina HiSeq RNA表達(dá)數(shù)據(jù)(版本：09-14-2017)使用CIBERSORT反卷積算法[13]估計(jì)每個(gè)腫瘤組織中22種免疫細(xì)胞類(lèi)型的相對(duì)比例，以評(píng)估腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的構(gòu)成比，這22種免疫細(xì)胞的構(gòu)成比是通過(guò)在線計(jì)算得到的(https://cibersort.stanford.edu/)。將CIB-ERSORT運(yùn)算結(jié)果中>0.05的樣本排除并將剩余樣本進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.3 RNA表達(dá)量的計(jì)算和比較

將口咽癌患者的基本臨床數(shù)據(jù)(版本：11-27- 2017)和3級(jí)FPKM標(biāo)準(zhǔn)化的Illumina HiSeq RNA表達(dá)數(shù)據(jù)(版本：09-14-2017)在Excel表格中進(jìn)行合并。CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度由CD8A和CD8B的表達(dá)量平均值定義，T細(xì)胞的效應(yīng)功能由(干擾素γ，IFN-γ)、(腫瘤壞死因子α，TNF-α)、(白細(xì)胞介素2，IL-2)、(穿孔素，Perforin)、(顆粒酶A，Granzyme A)和(顆粒酶B，Granzyme B)的表達(dá)量來(lái)反映，使用GraphPad Prism v7.0 (Grap-hpad Software，Inc.，美國(guó))繪制直方圖對(duì)HPV+組和HPV–組基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，使用雙尾非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)計(jì)算值，<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 基因集富集分析(gene set enrichment an-alysis, GSEA)

采用GSEA軟件對(duì)HPV+和HPV?患者隊(duì)列的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行基因集富集分析(軟件地址：http://soft-ware.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)，使用C7(免疫相關(guān)基因集)作為分析中的參照基因集。結(jié)果中標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)(normalized enrichment score, NES)>1，<0.05，同時(shí)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)< 0.25被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 腫瘤新抗原負(fù)荷(tumor neoantigen burden, TNB)分析

頭頸腫瘤新抗原數(shù)據(jù)下載自TSNAdb v4.0 (http://biopharm.zju.edu.cn/tsnadb/)，TSNAdb是基于TCGA腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)的腫瘤特異性新抗原數(shù)據(jù)庫(kù)[14]，其中的新抗原類(lèi)型均為主要組織相容性復(fù)合體I型(major histocompatibility complex class Ⅰ, MHC-Ⅰ)。TCGA頭頸腫瘤患者基因突變數(shù)據(jù)下載自UCSC Xena，采用的算法為mutect2。利用Excel對(duì)表格中每個(gè)患者的新抗原頻次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到TNB值，并計(jì)算HPV+和HPV–組的TNB的差異，使用雙尾非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)計(jì)算值，<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)對(duì)HPV+和HPV–口咽癌患者中出現(xiàn)頻數(shù)最高的新抗原、基因和對(duì)應(yīng)蛋白的突變位點(diǎn)、產(chǎn)生的新表位肽及其頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 生存分析及統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于HPV+組和HPV?組中的連續(xù)變量和等級(jí)變量采用均值±SEM表示，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)評(píng)估兩組間的差異；對(duì)于分類(lèi)變量，使用卡方檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估各種危險(xiǎn)因素之間的關(guān)聯(lián)程度。采用Kaplan-Meire法對(duì)各種危險(xiǎn)因素進(jìn)行單因素預(yù)后分析，用Log-rank檢驗(yàn)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(Hazard ratio, HR)及值；單因素預(yù)后分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的危險(xiǎn)因素進(jìn)行多因素Cox回歸分析。采用GraphPad Prism v7.0繪制生存曲線，并比較HPV+組和HPV–組的總體生存率(overall survival, OS)和無(wú)病生存率(Disease-free survival, DFS)的差異，用Log-rank檢驗(yàn)計(jì)算值，<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPV+和HPV–口咽癌患者的臨床病理學(xué)特征和接受治療的差異

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中頭頸鱗癌患者共有612例，其中口咽癌患者共80例，HPV+33例，HPV–47例；HPV+組中女性3例，男性30例；HPV–組中女性9例，男性38例，如表1所示，兩組間男女比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(>0.05)；兩組患者的年齡、吸煙史、飲酒史均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(>0.05)；此外，兩組患者腫瘤部位、T分期、N分期、AJCC分期和淋巴血管侵犯均無(wú)顯著差異(>0.05)。

為比較HPV+和HPV?組中接受不同治療方案的患者的差異，根據(jù)術(shù)后是否接受放療、化療、放化療、靶向治療將口咽癌患者分為“手術(shù)+術(shù)后放療手術(shù)+無(wú)術(shù)后放療”、“手術(shù)+術(shù)后化療手術(shù)+無(wú)術(shù)后化療”、“手術(shù)+術(shù)后放化療單純手術(shù)”和“手術(shù)+術(shù)后靶向治療手術(shù)+無(wú)術(shù)后靶向治療”4種方案。通過(guò)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HPV+和HPV–患者的接受4種方案的病例數(shù)及比例總體上無(wú)顯著差異(表2，>0.05)。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HPV+和HPV–口咽癌患者的臨床資料和病理學(xué)資料

2.2 HPV+和HPV–口咽癌患者預(yù)后分析

為確定HPV是否對(duì)口咽癌患者的預(yù)后是否具有顯著影響，對(duì)HPV+和HPV–口咽癌患者隊(duì)列進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示，HPV+組5年OS顯著高于HPV–組(89.8%. 39.8%，<0.05) (圖1A)，5年DFS同樣稍高于HPV–組，但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(55.2%32.2%，>0.05) (圖1B)。將患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位(舌根、扁桃體、口咽)、T分期、N分期、AJCC分期、淋巴血管侵犯狀況、HPV狀態(tài)作為危險(xiǎn)因素進(jìn)行單因素及多因素預(yù)后分析，結(jié)果顯示在單因素分析中，年齡>60歲(HR=7.906，<0.001)為患者總體生存率的危險(xiǎn)因素，而HPV+(HR=0.302,<0.05)為患者總體生存率的保護(hù)因素(表3)。然而，當(dāng)進(jìn)行多因素Cox回歸分析時(shí)，僅年齡為獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=7.190，<0.001)，而HPV+在對(duì)患者總體生存率的作用上無(wú)顯著差異(HR=0.352,>0.05) (表2)。以上結(jié)果表明HPV+口咽癌患者總體生存率顯著優(yōu)于HPV–患者。

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HPV+和HPV–口咽癌患者的接受不同治療方式的人數(shù)

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HPV+與HPV–口咽癌患者的生存分析

A：總體生存率(overall survival, OS)；B：無(wú)病生存率(disease-free survival, DFS)。

表3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)口咽癌患者隊(duì)列的單因素和多因素預(yù)后分析

*表示<0.05；***表示<0.001。

2.3 HPV+和HPV–口咽癌患者免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況

為進(jìn)一步探討HPV+口咽癌患者和HPV–口咽癌患者在腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況的差異，采用CIBERSORT算法對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中兩組患者的腫瘤樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用反卷積算法進(jìn)行分析，獲得22種免疫細(xì)胞在腫瘤樣本中的相對(duì)豐度，然后去除CIBERSORT分析結(jié)果中>0.05的樣本，剩余67個(gè)樣本做進(jìn)一步分析(HPV+：42個(gè)，HPV–：25個(gè))。由圖2A可知，HPV+組的CD8+T細(xì)胞相對(duì)豐度顯著高于HPV–組(<0.05)，同時(shí)濾泡輔助T細(xì)胞也高于HPV–組(<0.001)，但靜止CD4+記憶T細(xì)胞豐度較低(<0.01)；另外，HPV+組的激活肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例均顯著低于HPV–組(<0.05) (圖2B)。該結(jié)果提示CD8+T細(xì)胞在HPV+組的浸潤(rùn)程度顯著高于HPV–組。此外，HPV+組中具有腫瘤殺傷作用的漿細(xì)胞、激活CD4+記憶T細(xì)胞、激活NK細(xì)胞的比例均稍高于HPV–組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步檢測(cè)HPV+組和HPV–組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中CD8 (CD8A和CD8B的均值)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示HPV+組的CD8表達(dá)水平顯著高于HPV–組(<0.05) (圖2C)。因此推測(cè)，CD8+T細(xì)胞可能在HPV+患者的腫瘤微環(huán)境中起關(guān)鍵作用。

2.4 HPV+口咽癌患者T細(xì)胞效應(yīng)分子的表達(dá)情況

為進(jìn)一步探究CD8+T細(xì)胞在HPV+口咽癌患者中的作用，對(duì)HPV+患者中的T細(xì)胞效應(yīng)分子的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HPV+組中顯著上調(diào)(<0.01) (圖3A)，同時(shí)也顯著上調(diào)(<0.05) (圖3B)。此外，、、和在HPV+組中均稍高于HPV–組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(>0.05) (圖3，C~F)。對(duì)HPV+和HPV–患者的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行GSEA分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于T細(xì)胞激活和效應(yīng)功能相關(guān)基因集顯著富集到HPV+組中(CD8+T細(xì)胞激活基因集：NES=1.55，=0.01, FDR=0.12；CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能基因集：NES=1.56，=0.04，F(xiàn)DR=0.12) (圖3G)。因此，在HPV+口咽癌患者的腫瘤微環(huán)境中，CD8+T細(xì)胞殺傷功能顯著增強(qiáng)，主要通過(guò)分泌IFN-γ和Granzyme B來(lái)促進(jìn)細(xì)胞殺傷功能。

2.5 HPV+口咽癌患者腫瘤新抗原負(fù)荷較少

因?yàn)镃D8+T細(xì)胞的產(chǎn)生需要MHC-I類(lèi)限制性抗原的呈遞和激活，因此對(duì)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)是否與腫瘤組織中MHC-I類(lèi)新抗原的負(fù)荷(tumor neoa-tigen burden, TNB)相關(guān)進(jìn)行了探究。對(duì)HPV+和HPV–口咽癌患者腫瘤細(xì)胞新抗原頻數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPV+組的TNB顯著低于HPV–組(23.2± 6.2431.33±3.36<0.01，圖4)。進(jìn)一步比較兩組之間MHC-I限制性新抗原之間的差異，分析發(fā)現(xiàn)HPV+組中新抗原負(fù)荷最大的基因?yàn)?表4)，HPV–組中新抗原負(fù)荷最大的基因分別為和(表5)，兩組中均顯示為最常見(jiàn)的產(chǎn)生新抗原的突變位點(diǎn)；同時(shí)，編碼肌聯(lián)蛋白的基因TTN也同時(shí)出現(xiàn)于兩組中，但沒(méi)有共同突變位點(diǎn)和新抗原表位。值得注意的是，HPV+組中突變頻數(shù)為0，而HPV–組中突變頻數(shù)為5，其中和為產(chǎn)生新抗原的突變位點(diǎn)。

圖2 HPV+和HPV–口咽癌患者的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞相對(duì)豐度和CD8 mRNA表達(dá)量

A：采用CIBERSORT算法計(jì)算HPV+和HPV–口咽癌中naive B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、naive CD4+T細(xì)胞、靜止CD4+T細(xì)胞、激活CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、靜止NK細(xì)胞、激活NK細(xì)胞的相對(duì)豐度；B：采用CIBERSORT算法計(jì)算HPV+和HPV–口咽癌中γδT細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M0、巨噬細(xì)胞M1、巨噬細(xì)胞M2、靜止樹(shù)突狀細(xì)胞、激活樹(shù)突狀細(xì)胞、靜止肥大細(xì)胞、激活肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的相對(duì)豐度；C：HPV+和HPV–腫瘤組織中的表達(dá)量(CD8A和CD8B表達(dá)量的FPKM均值)。n.s.表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*表示<0.05；**表示<0.01；***表示<0.001。

3 討論

本研究從HPV相關(guān)口咽癌的腫瘤免疫微環(huán)境浸潤(rùn)角度，探討了HPV相關(guān)口咽癌的預(yù)后及其與CD8+T細(xì)胞的關(guān)系。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)，HPV+口 咽癌患者雖然在性別、年齡、腫瘤分級(jí)上無(wú)顯著差異，但整體預(yù)后較HPV–患者好。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HPV+口咽癌患者的CD8+T細(xì)胞豐度顯著高于HPV–患者，同時(shí)通過(guò)比較CD8+T的效應(yīng)因子的表達(dá)情況，結(jié)果表明HPV+組的CD8+T細(xì)胞中IFN-γ和Granzyme B的mRNA表達(dá)量顯著提高，而且其他效應(yīng)分子(IL-2、TNF-α、Perforin和Granzyme A)也較HPV–組稍升高。再進(jìn)一步通過(guò)GSEA基因集富集分析，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞激活和效應(yīng)功能的相關(guān)基因集富集于HPV+組中，證明了HPV+口咽癌中T細(xì)胞效應(yīng)功能較為活躍。最后，通過(guò)對(duì)新抗原的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HPV+口咽癌患者的新抗原頻數(shù)顯著低于HPV–患者。

圖3 HPV+和HPV–口咽癌患者中CD8+ T細(xì)胞效應(yīng)分子mRNA表達(dá)量和GSEA分析結(jié)果

A：HPV+和HPV–口咽癌的IFNG的mRNA表達(dá)量；B：HPV+和HPV–口咽癌的GZMB的mRNA表達(dá)量；C：HPV+和HPV–口咽癌的TNF的mRNA表達(dá)量；D：HPV+和HPV–口咽癌的PRF1的mRNA表達(dá)量；E：HPV+和HPV–口咽癌的GZMA的mRNA表達(dá)量；F：HPV+和HPV–口咽癌的IL2的mRNA表達(dá)量；G：HPV+和HPV–腫瘤轉(zhuǎn)錄組的GSEA分析結(jié)果。n.s.表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*表示<0.05；**表示<0.01。

根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的高低，可將腫瘤分為“熱腫瘤”(hot tumor)和“冷腫瘤”(cold tumor)[15]。這種分類(lèi)方法最早見(jiàn)于結(jié)直腸癌患者，根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度，研究者將結(jié)直腸癌分為高免疫浸潤(rùn)和低免疫浸潤(rùn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高免疫浸潤(rùn)的結(jié)直腸癌的預(yù)后顯著高于低免疫浸潤(rùn)患者，且其預(yù)后的判定價(jià)值比TNM分期、淋巴血管侵犯和腫瘤分化程度更高[16]。另一項(xiàng)研究表明，高免疫浸潤(rùn)的結(jié)直腸癌中CD8+T細(xì)胞豐度更高，且其分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、Granzyme A、Granzyme B和Perforin等均較高，這些因子可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的裂解和凋亡[17]。本研究與既往結(jié)直腸癌研究結(jié)果一致，即HPV+口咽癌患者免疫浸潤(rùn)程度較HPV–患者更高，且T細(xì)胞效應(yīng)因子分泌比HPV–患者高，表明CD8+T細(xì)胞參與了腫瘤殺傷作用。因此，提高腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞的豐度，可能有助于抗腫瘤免疫反應(yīng)。有研究通過(guò)注射腫瘤疫苗或者過(guò)繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)輸?shù)确椒?，提高腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞豐度，并顯著提高了抗腫瘤治療的效果[18,19]。

圖4 HPV+和HPV–口咽癌患者的腫瘤新抗原負(fù)荷的差異

**表示<0.01。

腫瘤新抗原是由腫瘤特異性體細(xì)胞非同義突變產(chǎn)生的表位，在MHC上表達(dá)。因其具有腫瘤細(xì)胞的高表達(dá)頻率、正常細(xì)胞的低表達(dá)頻率、高親和力免疫原性、低耐受性等特點(diǎn)，目前已成為個(gè)性化癌癥免疫治療的有希望的靶點(diǎn)[20]。既往研究表明，腫瘤中新抗原的產(chǎn)生與預(yù)后較好相關(guān)，因?yàn)樾驴乖脑黾优c免疫細(xì)胞特異性識(shí)別和浸潤(rùn)相關(guān)[21,22]。但本研究結(jié)果顯示，雖然HPV–患者免疫浸潤(rùn)較低，但HPV–患者腫瘤中新抗原顯著高于HPV+患者，似乎與既往在其他腫瘤中的研究結(jié)果相悖。Rosenthal等[23]研究表明，肺非小細(xì)胞癌細(xì)胞可以不斷產(chǎn)生新抗原，以適應(yīng)免疫微環(huán)境的選擇壓力并促使免疫逃逸。本研究發(fā)現(xiàn)，突變僅發(fā)生在HPV–患者中，HPV+患者未見(jiàn)突變及新抗原產(chǎn)生。是一個(gè)非常重要的抑癌基因，其基因突變或高甲基化狀態(tài)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖不受控制，并與頭頸鱗癌患者存活率降低顯著相關(guān)[24,25]。此外，Guo等[26]研究顯示，突變可以誘導(dǎo)抑制性免疫微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。另外，相比于HPV–口咽癌，HPV+口咽癌中和突變率較高，而有研究表明頭頸腫瘤細(xì)胞中和突變與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增多相關(guān)[27,28]。

此外，HPV+患者腫瘤細(xì)胞表達(dá)外源性p16病毒抗原E6和E7[29]，因此更容易產(chǎn)生病毒抗原特異性T細(xì)胞，因此免疫浸潤(rùn)程度較高，同時(shí)對(duì)腫瘤免疫治療響應(yīng)程度更高[30]。Ramous等[31]通過(guò)收集HPV+口咽癌患者的外周血在體外用HPV特異性抗原E6和E7對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)有62%的口咽癌患者的外周血T細(xì)胞可以響應(yīng)刺激并大量增殖，表明HPV相關(guān)口咽癌患者體內(nèi)存在HPV抗原特異性T細(xì)胞；此外，Masterson等[32]發(fā)現(xiàn)，外周血可檢測(cè)到E6/E7抗原特異性CD8+T細(xì)胞的患者對(duì)放療及化療更加敏感，其無(wú)病生存率較無(wú)抗原特異性T細(xì)胞的患者更高。因此，HPV相關(guān)抗原E6/E7可能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的識(shí)別和浸潤(rùn)，并介導(dǎo)腫瘤殺傷作用。關(guān)于HPV相關(guān)口咽癌的免疫浸潤(rùn)和新抗原負(fù)荷的關(guān)系，仍需進(jìn)一步研究。

表4 HPV+口咽癌中頻率最高的新抗原及其突變位點(diǎn)和MHC-Ⅰ限制性表位肽序列

下劃線：氨基酸突變位點(diǎn)。

表5 HPV–口咽癌中頻率最高的新抗原及其突變位點(diǎn)和MHC-Ⅰ限制性表位肽序列

下劃線：氨基酸突變位點(diǎn)。

本研究表明HPV+患者口咽癌患者中免疫細(xì)胞，特別是CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度以及效應(yīng)功能顯著高于HPV–患者，同時(shí)新抗原負(fù)荷顯著低于HPV–患者，這可能是導(dǎo)致HPV+患者預(yù)后較好的原因。本研究為口咽癌患者的臨床治療提供了一種新的思路，即提高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，可以提高口咽癌患者治療效果。

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Correlation analysis of the prognosis of HPV positive oropharyngeal cancer patients with T cell infiltration and neoantigen load

Huanzi Lu, Dikan Wang, Zhi Wang

Oropharyngeal cancer is one type of head and neck squamous cell carcinoma that is commonly associated with human papillomavirus (HPV) infection. Its incidence is increasing year by year. However, in the clinical treatment, it is found that the overall prognosis of HPV positive oropharyngeal cancer patients is better than that of HPV negative patients. But till now, the underlying mechanism that leads to this phenomenon has not been fully elucidated. This research analyzed the immune cell infiltration and function, as well as neoantigen loads between HPV positive and negative patients by bioinformatic analysis using the TCGA database, and found that the overall survival rate of HPV positive patients was significantly higher than those in the HPV negative group. Analysis of the relative abundance of immune cells in tumor tissues showed that CD8+T cells in HPV positive patients were significantly increased compared to those in HPV negative patients, and the expression levels of effector molecules, like IFN-γ and Granzyme B, were significantly upregulated. Meanwhile, the analysis of tumor neoantigen load (TNB) showed that the TNB of HPV positive patients was lower than that of the HPV negative group. This study provides some basic theoretical support for the treating HPV-related oropharyngeal cancer.

oropharyngeal cancer; human papillomavirus; bioinformatic analysis; T cell infiltration; tumor neoantigen load

2019-05-13;

2019-07-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81772896，81630025，81602383)和廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2017004020102)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81772896, 81630025, 81602383) and the Science and Technology Planning Project of Guangzhou City of China (No. 2017004020102)]

盧渙滋，博士研究生，研究方向：頭頸腫瘤免疫。E-mail: luhuanzi@mail2.sysu.edu.cn

王智，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：頭頸腫瘤免疫。E-mail: wangzh75@mail.sysu.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-135

2019/8/6 11:24:34

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190806.1124.002.html

(責(zé)任編委: 岑山)