張倩倩，商璇，林宛穎，徐湘民

影響β-地中海貧血表型的遺傳修飾作用

張倩倩，商璇，林宛穎，徐湘民

南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室，廣州 510800

β-地中海貧血(β-地貧)是一種可致死、致殘的遺傳性血液病，臨床上具有較寬泛的表型變異譜，在致病基因型相同或類似的情況下，患者的臨床表型嚴重程度有很大的差異。探索影響β-地貧表型的遺傳修飾因素是當前血液病及遺傳病領域的研究熱點和重點。本文從α-珠蛋白基因型和胎兒血紅蛋白(Hb F)數(shù)量性狀位點兩個方面闡述了可加重或緩解β-地貧表型的遺傳修飾因素，并著重介紹了調控g-珠蛋白基因重激活的轉錄因子變異，以及β-珠蛋白基因簇順式元件變異。最后，本文舉例介紹了β-地貧遺傳修飾的臨床應用以及未來發(fā)展前景。

β-地中海貧血；胎兒血紅蛋白；遺傳修飾作用；基因編輯

β-地中海貧血(β-地貧，OMIM#613985)是世界上最常見的單基因遺傳病之一，全球約有8000~9000萬攜帶者。在我國，該疾病主要高發(fā)于長江以南地區(qū)，因高發(fā)區(qū)域人口基數(shù)龐大且該病致死、致殘率高，嚴重影響當?shù)爻錾丝谫|量，故被列為國家重點關注的出生缺陷篩查項目[1,2]。β-地貧根據(jù)貧血嚴重程度和臨床癥狀一般分為輕型、中間型和重型三種：輕型地貧臨床無明顯癥狀；中間型患者偶爾或無需輸血，一般可維持正常生長發(fā)育，隨著年齡的增長，會出現(xiàn)骨質疏松、血栓、腿部潰瘍等并發(fā)癥；重型地貧需接受規(guī)律性輸血和去鐵治療，由于長期的慢性溶血和鐵過載，患者常伴隨有特殊面容、生長發(fā)育遲緩、肝脾腫大、繼發(fā)性血色病、髓外造血、骨骼畸形等癥狀[3,4]。

β-地貧是遺傳性血紅蛋白病的一種，血紅蛋白是由兩條α類珠蛋白鏈和兩條β類珠蛋白鏈組成的四聚體結構，在人體內(nèi)行使運輸氧氣的功能，由于機體對氧氣的需求不同，不同發(fā)育時期的血紅蛋白組分存在差異。妊娠5周開始，由γ-鏈和α-鏈組成的胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin, Hb F)開始在肝臟中表達，成為胎兒期血中的主要血紅蛋白組分，在胎兒6個月時含量超過90%，出生前后Hb F迅速減少，至6個月不超過5%，2歲時不超過1%，同時β-珠蛋白開始在骨髓中表達增強，在1歲時達到高峰并維持終身，β-鏈和α-鏈構成的Hb A (adult hemoglobin)在出生后取代Hb F成為人體主要血紅蛋白組分[2]。

β-地貧是由于β-珠蛋白基因(, OMIM+ 141900)突變使受累個體β-珠蛋白肽鏈合成嚴重不足(或完全缺乏)而引起α-鏈與β-鏈比例不平衡，多余的游離α-鏈結合于紅細胞膜上，導致紅細胞氧化損傷進而破裂引發(fā)溶血[5]。目前，已報道300多個β-地貧致病突變，包括導致β-鏈合成完全缺失的β0突變，部分減少的β+突變，以及輕微減少的β++突變，β-地貧突變的不同組合基因型是決定患者臨床表型的最主要遺傳因素，表型嚴重程度排序為：β0/β0> β0/β+>β+/β+。β0/β0患者一般表現(xiàn)為重型β-地貧，β0/β+表現(xiàn)為中間型，β+/β+患者表型較輕。但是患者臨床表型并不完全取決于β-地貧的突變類型，部分β0/β0患者也可能表現(xiàn)出中間型表型，β0/β+患者也可表現(xiàn)出重型。因為β-地貧患者表型的嚴重程度和α-與β-鏈比例不平衡程度呈正比，除了β-基因變異外，任何改變肽鏈失衡程度的因素都可以作為影響表型的遺傳修飾因子，換言之，任何能降低珠蛋白鏈不平衡比例，減少游離α-鏈的因素都可以緩解β-地貧臨床癥狀，反之，增加不平衡比例的因素可加重癥狀[6,7]。本文將從加重和減輕臨床表型兩個方面介紹β-地中海貧血諸多遺傳修飾因素的研究進展，以及這些修飾因素在臨床診斷和治療方面的應用及前景。

1 加重β-地中海貧血表型的遺傳修飾因素

加重β-地中海貧血表型的遺傳修飾因素有兩種：(1) α-珠蛋白基因(, OMIM+141800;, OMIM+141850)多拷貝：一般β-地貧雜合子個體無明顯臨床貧血癥狀，但是當合并出現(xiàn)α-基因超過正?？截悢?shù)目(ααα/αα, ααα/ααα, αααα/αα)時，游離的α-珠蛋白增加，加重血紅蛋白鏈失衡，此時個體表現(xiàn)為中間型地中海貧血[8]；(2)修飾基因變異：目前尚未報道有可直接加重β-地貧患者表型的修飾基因，屬于金屬還原酶STEAP (six-transmembrane epithelial antigen of the prostate)家族，在機體內(nèi)發(fā)揮鐵離子還原酶的作用維持體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)，在巴基斯坦一個家系中鑒定出雜合無義突變可致嚴重貧血[9]，由此受到廣泛關注，后來對中國南方人群隊列展開突變譜的研究，證明攜帶突變并不會導致貧血表型，猜測其原因可能源于種族差異性[10]。另外，存在一些疾病修飾變異通過誘發(fā)或加劇患者并發(fā)癥加重β-地貧表型，極大地增加患者痛苦，縮短患者生存期。谷胱甘肽巰基轉移酶1(glutathione S-transferase pi-1, GSTP1)是體內(nèi)生物轉化最重要的Ⅱ相代謝酶之一，rs1695處于該酶的活性部位，可增加細胞對自由基介導的損傷的敏感性。病例隊列研究發(fā)現(xiàn)在β-地貧重型兒童中，rs1695攜帶率為77.14%，在正常對照組中為20%。該變異誘導β-地貧患者骨鈣素水平升高、骨密度降低，繼而造成骨質疏松癥，在純合子隊列里效應更為顯著[11]。使用MRI T2*技術評估100個罹患重型β-地貧的兒童及青少年的心臟鐵沉積程度，81.25%的心臟鐵沉積患者攜帶rs4025935變異，且rs4025935對應更低的T2*值，提示該變異導致谷胱甘肽硫轉移酶M1（GSTMl）活性降低，誘發(fā)心臟鐵超載，增加患兒的死亡風險[12]。

2 減輕β-地中海貧血表型的遺傳修飾因素

目前報道可緩解β-地貧臨床癥狀的修飾作用主要通過兩條途徑：(1)減少α-珠蛋白的表達，β-地貧患者同時遺傳α-地中海貧血(α-地貧，OMIM#604131)突變會減輕貧血嚴重程度，α-地貧突變導致α-珠蛋白合成減少，珠蛋白肽鏈比例趨于平衡，可改善患者貧血表型；(2)重新激活Hb F表達，β-地貧患者表型多樣性的一個重要原因，是Hb F含量具有明顯的個體差異，一般從0%~98%不等，Hb F含量越高，患者貧血癥狀越輕。α-珠蛋白和γ-珠蛋白組成的Hb F是胎兒期血液中的主要血紅蛋白組分，γ-珠蛋白基因(, MIM# 142200;, MIM# 142250)在出生前后關閉表達，β-珠蛋白開始表達，與α-珠蛋白形成Hb A，并維持終身。Hb F→Hb A表達轉化分子機制為解釋β-地貧表型變異性的遺傳學基礎提供了有力的科學證據(jù)，重新激活β-地貧患者的γ-珠蛋白表達，與游離α-鏈結合形成可正常攜氧的Hb F，降低α-鏈和β-鏈不平衡程度，可有效緩解患者癥 狀[13]。早在2007年，通過全基因組關聯(lián)分析(genome- wide association study, GWAS)和基因組連鎖分析，鑒定出Hb F的數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus, QTL)主要集中在2p15、6q23基因間區(qū)和11p15 β-珠蛋白基因簇上[14]，近年在中國人隊列里還鑒定出基因變異可顯著影響Hb F，減輕表型[15]。目前，可通過調控Hb F表達緩解β-地貧表型癥狀的變異主要分為3類(圖1)：(1)修飾基因變異，主要是指目前臨床上評估和表型顯著相關的修飾基因發(fā)生基因突變。這些修飾基因多數(shù)編碼重要的紅系轉錄因子，如BCL11A、LRF、KLF1和MYB等，它們均參與紅系分化及生長等通路，一旦其發(fā)生基因突變將通過減少該基因的蛋白表達量來減輕其對γ-基因的抑制作用，從而達到緩解表型的結果[16]；(2)順式作用元件變異，主要是發(fā)生在β-珠蛋白基因簇上轉錄因子結合序列的變異，導致反式因子的特異性結合親和力發(fā)生改變，進而影響β-珠蛋白基因簇重要基因的正常表達轉換；(3)表觀遺傳修飾變異，該類變異通過改變珠蛋白基因上的表觀修飾狀態(tài)調控珠蛋白基因表達。下文對已報道的可緩解β-地貧表型的修飾因素及變異根據(jù)其作用機制分類進行一一介紹。

圖1 β-地中海貧血遺傳修飾變異

珠蛋白表達的關鍵調控因子為KLF1、LRF、MYB、BCL11A、GATA1等。β-地中海貧血修飾變異主要分為：(1)影響重要紅系轉錄因子合成的修飾基因變異：rs483352838()、rs9399137()、rs766432()等；(2)結合反式作用因子的順式元件變異：γ-珠蛋白基因()近端啟動子?196C>T、?197C>T、?198T>C等通過改變轉錄因子結合序列，減少LRF和KLF1富集，減輕其對γ-基因的抑制作用。?113A>G產(chǎn)生新的GATA1結合位點，招募GATA1結合調控γ-基因表達；(3)通過改變甲基化狀態(tài)激活珠蛋白基因表達的表觀遺傳修飾變異：rs368698783。

2.1 修飾基因變異

BCL11A和LRF都是C2H2鋅指轉錄因子，在印度尼西亞血紅蛋白E(hemoglobin E, Hb E)與β-地貧雙重雜合的病例隊列里，內(nèi)含子區(qū)域rs11886868和rs766432的多態(tài)性與Hb F表達及患者臨床嚴重程度有較強的相關性[17]，已被證明是γ-珠蛋白表達的抑制基因，在人造血干細胞CD34+及β-YAC(yeast artificial chromosomes)轉基因小鼠胚胎中敲除基因，可減輕對γ-基因的抑制作用，染色質免疫沉淀實驗顯示BCL11A可直接結合于β-珠蛋白基因簇上游遠端調控元件LCR (locus control region)的HS3、δ-珠蛋白基因(, MIM# 142000)上游3.5 kb和γ-基因啟動子近端的GGCCGG序列[18]。研究表明失活并不能完全逆轉γ-珠蛋白向β-珠蛋白轉換的過程，提示人們存在其他重要調控子。

基因編碼的LRF是參與腫瘤形成和細胞轉化的重要因子，完全敲除后小鼠會因為嚴重貧血而胚胎致死，成鼠期敲除會引起輕度巨紅細胞性貧血。最近，LRF被鑒定為胎兒血紅蛋白的重要沉默子，在成人階段它結合到γ-基因上使染色體保持致密的核小體結構進而沉默γ-基因的表達。Martyn等[19]采用逆向思維的研究策略，用EMSA (electro-phoretic mobility shift assay)篩選結合于γ-基因啟動子區(qū)上已報道可引起遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白癥(hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)表型的變異的轉錄因子，結果顯示BCL11A結合在γ-基因轉錄起始位點前115 bp的位置，而LRF主要結合于前200 bp的位置。研究表明，在人永生化紅系祖細胞HUDEP-2中敲除或者任一基因，Hb F會上升至總體血紅蛋白水平的50%~70%，然而同時敲除這兩個基因，Hb F會超過95%。另外，在上游LCR區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了LRF的結合序列[20]，但至今仍未發(fā)現(xiàn)基因上自然發(fā)生的變異與Hb F表達相關聯(lián)。

紅系特異鋅指結構轉錄因子KLF1通過C末端鋅指與DNA結合促進β-珠蛋白的表達和胎兒期γ-珠蛋白到成年期β-珠蛋白的表達轉換。完全敲除后小鼠會因為嚴重貧血而胚胎致死。研究人員發(fā)現(xiàn)敲降可致表達減少，提示KLF1是BCL11A的正向轉錄調節(jié)因子。人群中存在多種自然突變，在正常人、β-地貧攜帶者和β-地貧患者研究隊列中，攜帶罕見變異均會伴隨升高的Hb F[21]。在我國，基因非同義突變在地貧高發(fā)區(qū)域較之低發(fā)區(qū)域有更高的發(fā)生頻率，提示極可能存在正向選擇作用，進一步評估多種修飾因素對中國β-地貧患者臨床表型的作用，候選列表為基因型、基因型、、、間區(qū)和，結果顯示基因變異對中國人群β-地貧表型修飾作用最為顯著[15]。

GWAS鑒定出位于6號染色體的基因間區(qū)上存在多個變異與Hb F表達量相關，在中國廣西壯族的中間型β-地貧患者隊列里研究顯示rs9376090、rs9399137、rs7776054、rs9389268等9個SNPs對應較高的Hb F，但多數(shù)變異影響血液學表型的作用機制尚未完全闡明[22]。目前最主要的猜想是部分SNPs通過降低轉錄因子親和力來遠端調控的表達量，MYB是參與造血與紅系分化過程的重要因子，敲除實驗表明會引起造血干細胞的減少和紅系細胞無法正常成熟，在K562細胞中過表達會抑制γ-珠蛋白的表達，而在人紅系祖細胞中敲降會導致microRNA-15a和microRNA- 16-1表達翻倍增加，進而刺激γ-珠蛋白開放表達。除了Hb F，還與紅細胞平均血紅蛋白量及紅細胞壓積等參數(shù)相關聯(lián)[23,24]。

2.2 順式作用元件變異

位于上游158 bp的C/T變異(rs7482144，XmnI多態(tài)性)與Hb F含量及β-地貧表型嚴重性顯著相關，在我國南方地貧高發(fā)區(qū)域此突變攜帶率高達13%，其多態(tài)性所引起的Hb F升高效應在極端紅系壓力下極為明顯，在正常人中效果甚微，rs7482144不僅對β-地貧的表型修飾作用顯著，對鐮刀形細胞貧血患者也會有一定的改善作用，其作用效能在不同人種之間中無明顯差異[25,26]。

現(xiàn)發(fā)現(xiàn)超過20種位于γ-基因近端啟動子區(qū)域可致HPFH的點突變，常見于?117、?196、?197、?198等位點，這些點突變可通過改變紅系重要轉錄因子BCL11A、KLF1、LRF等結合序列堿基，降低結合能力，減少抑制子對γ-基因的遏制作用，使其重新開放表達[27]。最近研究發(fā)現(xiàn)，除了改變既有的轉錄因子結合序列，這些近端啟動子的點突變也可能產(chǎn)生新的轉錄因子結合位點，如?113A>G通過招募紅系特異轉錄因子GATA1結合激活γ-珠蛋白的表達[28]。

某些β-地中海貧血患者的β-基因無變異卻無法正常表達，研究發(fā)現(xiàn)在其β-珠蛋白基因簇上游缺失一段很長的非編碼序列，導致致密的異染色質結構延伸到整個基因區(qū)域，抑制基因轉錄，提示位于基因上游6~20 kb的紅系特異HSs (hyper-sensitive site)調控元件可能發(fā)揮重要的調控作用[29]。在胎兒期，HSs、珠蛋白基因和紅系轉錄因子成環(huán)形成活性染色質中心(active chromatin hub, ACH)，轉錄因子較啟動子更易結合于LCR，LCR在空間上靠近γ-基因啟動子，更多的轉錄因子被傳遞到啟動子區(qū)域，促使γ-基因轉錄。目前對于LCR上的功能性變異鑒定和機制探索的研究少之又少，Kim等[30]成功用CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘變LCR HSs上KLF1、BCL11A和GATA1等紅系轉錄因子的結合序列，改變轉錄因子的結合力，從而影響珠蛋白基因表達，使人們進一步相信LCR上可能存在一些影響珠蛋白基因轉換的功能性變異。

2.3 表觀遺傳修飾

表觀遺傳學調控是指在不改變核苷酸序列的前提下，通過DNA甲基化、小RNA干擾和組蛋白修飾等途徑引起基因表達的可遺傳變化。DNA甲基化可改變?nèi)旧|結構、穩(wěn)定性和構象，從而降低基因的轉錄活性，而去甲基化則誘導了基因的重新表達[31]。實驗表明，γ-基因轉錄起始位點前53 bp處CG位點的低甲基化與γ-基因的重新激活相關[32]。胎兒出生后，LYAR蛋白與組蛋白甲基化轉移酶PRMT5結合后雙甲基化組蛋白H4上的精氨酸殘基，進而招募DNA甲基化轉移酶DNMT3A，DNMT3A甲基化γ-基因啟動子上的CG位點，抑制γ-基因的表達。隊列研究顯示中國南方地貧患者群體中HBG1啟動子上rs368698783 G/A變異的攜帶率高達16%，攜帶此變異患者Hb F值較高且表型較輕，功能實驗結果顯示變異使LYAR蛋白結合親和力降低，通過LYAR、PRMT5和DNMT3A作用通路，降低γ-基因啟動子附近CG位點的甲基化，從而開放γ-珠蛋白的表達，改善貧血表型[33]。抑制性染色質標記H3K27me3是α-珠蛋白基因僅在紅細胞表達的特異標志物。在非紅細胞中，H3K27me3富集于α-基因啟動子，抑制轉錄。IOX1是一種2OG氧合酶(2OG oxygenases) 的有效廣譜抑制劑，體外實驗可有效抑制KDM6A和KDM6B，研究報道在人造血干細胞CD34+中，IOX1通過抑制KDM酶增加α-基因啟動子上H3K27me3的富集，可在不影響其他基因表達和紅系分化過程的前提下，有選擇性地減少α-鏈合成，即可通過此途徑減少β-地貧珠蛋白鏈比例不平衡程度，緩解患者表型[34]。SIRT1是一種NAD依賴的組蛋白去乙酰化酶，促進組蛋白和DNA甲基化，抑制基因轉錄，使用小分子SIRT1激活劑SRT2104和SRT1720處理K562細胞和臍帶血來源CD34+細胞，可有效增強γ-珠蛋白 表達，提示SIRT1及其激活劑是治療β-地貧的潛在靶點[35]。

3 結語與展望

意大利卡利亞里大學于2015年發(fā)布TSS (Tha-lassemia severity score)系統(tǒng)(http://tss.unica.it)，結合致病基因與5個修飾位點可初步計算預測患者貧血嚴重程度，以期作為β-地貧篩查的預測評分和標準化嚴重程度量表，研發(fā)人員強調了遺傳修飾因素在β-地貧診斷及篩查中的重要作用，建議將修飾作用量化用于指導臨床決策[36]?，F(xiàn)有重型、中間型及輕型β-地貧的臨床分類指南和標準，已不能滿足當前包括精準人群防控和制定個體化臨床管理方案在內(nèi)的迫切需要。對文中所述修飾因素的充分研究及解析有助于建立整合致病變異及遺傳修飾因素的β-地貧新亞型分類指南和標準，并加速研發(fā)可用于疾病的人群分子篩查、臨床精準診斷和療效評價的遺傳變異檢測標準及技術體系。

異基因造血干細胞移植是目前較成熟的β-地貧根治方法，近些年手術方案及技術不斷發(fā)展，從同胞移植發(fā)展到非親緣供體移植，移植成功率在逐步提升，但由于供者難尋、費用昂貴等問題，受益患者極有限。表觀遺傳修飾和基因編輯改變珠蛋白基因表達有望成為治愈β-地貧的新方法。DNA甲基化轉移酶抑制劑5-氮雜胞苷和地它西濱、組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉和丁酸等具有激活與增強γ-珠蛋白表達的能力，目前已用于臨床治療，但由于藥物副作用較強、患者療效不穩(wěn)定等原因，尚未廣泛地推廣和使用[31]。深入研究β-地貧表觀遺傳調控作用可為研發(fā)安全性更高、特異性更好的表觀遺傳學藥物提供科學理論基礎。Wu等[37]以紅系增強子+58序列作為靶點對正常人與β-地貧病人來源的CD34+細胞進行編輯，通過優(yōu)化Cas9原核表達載體和編輯系統(tǒng)，使編輯效率達到98%，細胞體外培養(yǎng)實驗和免疫缺陷小鼠干細胞移植實驗結果均顯示，編輯后的β-地貧造血干細胞分化更加成熟，紅細胞Hb F含量較高，且細胞形態(tài)和大小均趨于正常。采用重激活內(nèi)源性Hb F的策略，CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯修飾基因，有望為β-地貧患者提供全新的基于自體干細胞移植的治愈方案。

β-地中海貧血是一種常染色體隱性遺傳血紅蛋白病，位于11號染色體上的基因發(fā)生缺失或變異，導致β-鏈合成不足，不同突變所致β-肽鏈合成量不同，對應患者貧血程度存在差異，但除了致病基因外，β-地貧表型嚴重程度仍受多種遺傳因素調控，包括α-基因拷貝數(shù)、修飾基因變異、珠蛋白基因簇順式元件變異和表觀遺傳學修飾。系統(tǒng)分析和闡述遺傳修飾作用對β-地貧表型影響將有助于臨床精準診斷、制定個性化優(yōu)生優(yōu)育方案、研發(fā)疾病表觀修飾藥物、探索基于DNA編輯技術的靶向基因治療方案，同時可為其他孟德爾遺傳病研究提供借鑒作用。

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Effect of genetic modifiers on the clinical severity of β-thalassemia

Qianqian Zhang, Xuan Shang, Wanying Lin, Xiangmin Xu

β-thalassemia (β-thal) is a fatal and disabling inherited blood disorder with diverse phenotypes. The same or similar genotype of β-thal can manifest variable clinical severities. It is the hotspot and emphasis in the field of hematopathy and genetic diseases to explore genetic modifiers that influence the phenotype of β-thal. This review illustrates the deteriorating and amelioratig modifiers from two aspects: genotypes of α-globin and quantitative trait locus of fetal hemoglobin (Hb F). Variations of transcription factors which reactive the γ-globin gene expression and β-globin cluster cis-acting elements were introduced emphatically. Finally, clinical applications and future development prospects of β-thal genetic modifiers are introduced by examples.

β-thalassemia; fetal hemoglobin; genetic modifier effects; gene editing

2019-05-13;

2019-07-29

國家重點研發(fā)計劃(編號：2018YFA0507803)和國家自然科學基金項目(編號：81870148)資助[Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFA0507803) and the National Natural Science Foundation of China (No.81870148)]

張倩倩，博士研究生，專業(yè)方向：遺傳學。E-mail: zqq.smu@foxmail.com

徐湘民，碩士，教授，研究方向：遺傳性血液病的分子機制及病理基礎。E-mail: xixm@smu.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-131

2019/8/5 20:59:54

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190805.2059.004.html

(責任編委: 楊昭慶)