張 鵬,王明秀,敬科民,彭 巍,田 園,李雨謙,付長(zhǎng)其,舒 適,鐘金城*,蔡 欣*

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041;2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,西寧 810016)

犏牛是雌牦牛和雄黃牛的種間雜交后代,是典型的雄性不育動(dòng)物。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn),犏牛垂體前葉促性腺激素細(xì)胞發(fā)育不良,因而導(dǎo)致卵泡刺激素(FSH)分泌不足,影響了曲細(xì)精管的發(fā)育,從而使生精上皮發(fā)育受阻[1]。細(xì)胞學(xué)研究表明,犏牛精子發(fā)生在減數(shù)第一次分裂時(shí)期停滯,粗線期初級(jí)精母細(xì)胞發(fā)生凋亡,導(dǎo)致附睪中沒有成熟的精子[2],并且犏牛支持細(xì)胞的增殖活性和生精細(xì)胞的分化關(guān)鍵功能基因的表達(dá)均存在缺陷[3]。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在精子發(fā)生過程中參與細(xì)胞增殖[4]、雙鏈DNA斷裂和修復(fù)[5-6]以及聯(lián)會(huì)[7]的基因都有不同程度的下調(diào)和甲基化。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)未分化精原細(xì)胞的自我更新和抑凋亡起重要作用。FGF2可以通過增加SSCs(spermatogonial stem cells)中Ras(mitogen-activated protein kinase 1)通路中ERK的磷酸化上調(diào)SSC中ETV5(ets translocation variant 5)和Bcl6b(B-cell/lymphoma 6 member B protein)的表達(dá)[8],促進(jìn)SSCs的增殖[9]。FGF8與FGFR1結(jié)合后激活Ras信號(hào)通路誘導(dǎo)GFRα1(GDNF family receptor alpha 1)和RET(Ret proto-oncogene)的表達(dá),抑制SSCs的分化[10]。FGF5通過激活Ras通路中的ERK信號(hào)增強(qiáng)ETV5、SHISA6(shisa family member 6)和ID4(inhibitor Of DNA binding 4)等基因的表達(dá),抑制Ngn3(neurogenin 3)、Sox3(SRY-box transcription factor 3)和Piwil4(Piwi like RNA-mediated gene silencing 4)等基因的表達(dá),從而促進(jìn)SSCs的增殖[11]。體細(xì)胞表達(dá)的FGF9也能通過p38(mitogen-activated protein kinase 14)-MAPK信號(hào)通路上調(diào)ETV5和Bcl6b的表達(dá),促進(jìn)SSC的增殖[12]。FGF4和FGF21通過Ras通路[13-14]抑制未分化精原細(xì)胞的凋亡。

FGF家族成員能顯著促進(jìn)未分化精原細(xì)胞的增殖活性,而犏牛未分化精原細(xì)胞數(shù)量稀少[15],因此研究FGF家族成員對(duì)犏牛未分化精原細(xì)胞增殖的影響有重要意義。本研究通過CCK-8、EDU染色檢測(cè)了牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞的增殖活性;通過RT-qPCR檢測(cè)了6種FGF家族成員、3種FGF受體、FGF介導(dǎo)的Ras和MAPK信號(hào)通路基因和與未分化精原細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因的差異表達(dá)。本研究旨在為進(jìn)一步解釋犏牛生精停滯提供新的思路和線索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

二氧化碳培養(yǎng)箱(Model 3111,Thermo),倒置熒光顯微鏡(Axio Observer 3,Zeiss),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(A28140,Thermo),細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Thermo Countess II,Thermo),酶標(biāo)儀(1510,Thermo);特級(jí)胎牛血清(FB25015,CLARK),DMEM高糖培養(yǎng)基(SH30021.01B,Hyclone),4%多聚甲醛(P1110,索萊寶)。

于四川省阿壩州紅原縣選取24月齡公麥洼牦牛和F1代公犏牛各3頭,取其睪丸組織。用滅菌PBS將睪丸組織沖洗干凈,去除附睪及睪丸白膜。經(jīng)75% 酒精噴灑消毒后用滅菌的剪刀將睪丸組織沿縱膈切開,部分睪丸組織放入有4% 多聚甲醛的15 mL離心管中;部分睪丸組織進(jìn)行玻璃化冷凍。本試驗(yàn)采用的牦牛和犏牛的未分化精原細(xì)胞是消化玻璃化冷凍睪丸組織得到的,是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)鑒定過的細(xì)胞。

1.2 HE染色

將睪丸組織從4%多聚甲醛中取出,自來水沖洗過夜。將組織切成大小合適的組織塊,放入包埋盒中,并用鉛筆做好標(biāo)記。依次放入50% 乙醇、75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇和無水乙醇中各1 h。然后依次放入石蠟I、石蠟II和石蠟III 中各30 min。切片機(jī)切片,將石蠟切片依次放到二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III中各15 min,無水乙醇I、無水乙醇II、85% 乙醇、75% 乙醇中各5 min,并用蒸餾水清洗。石蠟切片入蘇木素中染2 min,自來水漂洗,1%鹽酸酒精分化數(shù)秒,自來水漂洗,然后1%氨水水溶液返藍(lán)1 min,流水沖洗,放入伊紅染液中染色1 min,流水漂洗。將切片依次置于75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、無水乙醇和二甲苯中分別浸泡10 min,中性樹膠封片,最后鏡檢。

1.3 ImageJ測(cè)量生精小管基底膜到管腔中細(xì)胞分布位置的距離

將圖片導(dǎo)入到ImageJ后,以圖片中的標(biāo)尺為基準(zhǔn),測(cè)量出牦牛和犏牛生精小管基底膜到管腔中細(xì)胞分布位置的距離(r)。如圖1B所示,生精小管的兩條白色虛線互相垂直且等分,每個(gè)生精小管取4個(gè)值(r1、r2、r3、r4),以平均值作為該生精小管的r值。

A. 牦牛;B. 犏牛。SG、SC、RS、LC和PC分別為精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞。C. 牦牛和犏牛生精小管基底膜到管腔的距離,即圖1B中r1-r4的均值。*. P<0.05;**. P<0.01,下同A. Yak; B.Cattleyak. SG, SC, RS, LC and PC are spermatogonia, spermatocyte, round sperm cell, leydig cell and peritubular myoid cell, respectively. C.The distance from basal membrane of seminiferous tubule to lumen of yak and cattleyak, namely, the mean of r1-r4 in figure B. *. P<0.05;**. P<0.01, the same as below圖1 牦牛和犏牛睪丸組織HE染色(40×)Fig.1 HE staining of yak and cattleyak testis(40×)

1.4 CCK-8檢測(cè)

將牦牛和犏牛的試驗(yàn)組和對(duì)照組的未分化精原細(xì)胞接種于96孔板中,濃度為2×104個(gè)·mL-1,終體積為100 μL。分別于不同的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每種處理5個(gè)重復(fù)。在0、24、48、72和96 h時(shí)分別加入10 μL CCK-8 Solution (A311,Vazyme,中國),在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值。

1.5 細(xì)胞群體倍增時(shí)間PDT(population doubling time)檢測(cè)

將牦牛和犏牛的試驗(yàn)組和對(duì)照組的未分化精原細(xì)胞接種于12孔板中,濃度為2×106個(gè)·mL-1,終體積為1.5 mL。分別于不同的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每種處理3個(gè)重復(fù)。在培養(yǎng)48 h后,用Countess? II進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照公式(1)計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。

(1)

其中,t為培養(yǎng)時(shí)間,N0為初始培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量,Nt為培養(yǎng)t時(shí)間后的細(xì)胞數(shù)量。

1.6 EDU染色

牦牛和犏牛的未分化精原細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min,用2 g·L-1甘氨酸中和,用PBS洗滌,然后種植在粘附載玻片上。0.5% Triton X-100 (100 μL)滲透10 min后,載玻片上的細(xì)胞用EdU染色30 min (100 μL)。用DAPI將細(xì)胞核染色30 min,然后于顯微鏡下記錄圖像。

1.7 RNA的提取

懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞收集后,500 G、4 ℃離心6 min,棄上清。加入1 mL PBS重懸浮細(xì)胞,將細(xì)胞稀釋至1×107個(gè)·mL-1,每個(gè)1.5 mL Rnase-free離心管分裝1 mL細(xì)胞懸液。500 G、4 ℃再次離心6 min,棄上清。加入1 mL Trizol,混勻后在室溫下靜置10 min。加入200 μL氯仿,渦旋振蕩混勻15 s,室溫下靜置2 min。12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。將上層的透明相吸到新的1.5 mL Rnase-free離心管中,加入500 μL異丙醇,混勻后室溫靜置10 min。12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。棄上清,加入1 mL 75% 乙醇,輕輕洗滌沉淀。7 500 r·min-1、4 ℃離心5 min。棄上清,加50 μL Rnase-free H2O,溶解RNA。用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA的濃度及純度。將剩余RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或置于-80 ℃保存。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)

利用HiScript? III RT SuperMix for qPCR (+ gDNA wiper) 試劑盒 (R323-01,Vazyme,中國) 將“1.7”中提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

基因組DNA的去除:將4 μL 4×gDNA wiper Mix、1 μL 1 g·L-1RNA和11 μL Rnase-free H2O在200 μL離心管中輕輕吹打混勻,42 ℃放置2 min。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):向上述16 μL反應(yīng)液中加入4 μL 5×HiScript III qRT SuperMix,在37 ℃放置15 min,85 ℃放置5 s。將最終的產(chǎn)物置于-20 ℃保存。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)

利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒 (Q711,Vazyme,中國) 以“1.8”中逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。本試驗(yàn)所用基因引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequence

(續(xù)表1 Continued)

在200 μL離心管中將10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL F-primer、0.4 μL R-primer、1 μL cDNA和8.2 μL ddH2O混勻。

RT-qPCR反應(yīng):95 ℃放置30 s;95 ℃放置10 s,退火溫度放置30 s,40個(gè)循環(huán);95 ℃放置15 s,60 ℃放置60 s,95 ℃放置15 s

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

RT-qPCR以β-actin為內(nèi)參,采用ΔΔCt法分析。使用GraphPad Prism 9.0.0統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Inc.,美國)進(jìn)行單因素方差分析,以確定是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異 (P<0.05或P<0.01)。除非另有說明,否則每組試驗(yàn)重復(fù)至少3次。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛和犏牛睪丸組織的HE染色

通過對(duì)牦牛和犏牛睪丸組織的HE染色,發(fā)現(xiàn)牦牛的生精小管(圖1A)表現(xiàn)出正常的生理特征,從生精小管基底膜到管腔分布著類型豐富的生殖細(xì)胞,包括精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞。而犏牛生精小管(圖1B)主要的生殖細(xì)胞為精原細(xì)胞,少見精母細(xì)胞。牦牛睪丸組織中生精小管與生精小管的間質(zhì)部分的細(xì)胞數(shù)量也比犏牛豐富。另外,牦牛生精小管基底膜到管腔的距離((94.01±6.82) μm)顯著高于犏牛((53.42±1.40) μm) (P<0.01,圖1C),表明牦牛生精小管中的細(xì)胞數(shù)量比犏牛豐富。

2.2 牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞增殖活性的比較

通過計(jì)算牦牛和犏牛48 h未分化精原細(xì)胞的細(xì)胞群體倍增時(shí)間,發(fā)現(xiàn)犏牛未分化精原細(xì)胞細(xì)胞群體倍增時(shí)間((20.10±0.46)h)顯著大于牦牛((17.05±1.20)h,P<0.05),即犏牛未分化精原細(xì)胞的增殖活性低于牦牛(P<0.05,圖2A)。通過CCK-8試劑檢測(cè)牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞增殖活性,發(fā)現(xiàn)牦牛和犏牛的增殖曲線整體呈S型,但牦牛未分化精原細(xì)胞的增殖速率及活性都高于犏牛,尤其是在48 h之后(P<0.01,圖2B)。PDT和CCK-8的結(jié)果都表明,犏牛未分化精原細(xì)胞的增殖活性遠(yuǎn)低于牦牛未分化精原細(xì)胞。EDU染色試驗(yàn)也證明了犏牛未分化精原細(xì)胞增殖活性弱于牦牛(圖2C)。

A. 細(xì)胞群體倍增時(shí)間;B. CCK-8;C. EDU染色(200×)A. Cell population doubling time; B. CCK-8; C. EDU staining (200×)圖2 牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞增殖活性的比較Fig.2 Comparison of the proliferative activity of undifferentiated spermatogonia in yak and cattleyak

2.3 FGFs在牦牛和犏牛睪丸組織中的差異表達(dá)

通過qPCR檢測(cè)了FGFs家族成員FGF2、FGF4、FGF5、FGF8、FGF9和FGF21在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)FGF2、FGF8、FGF9和FGF21在犏牛睪丸組織中的表達(dá)約為牦牛睪丸組織中的一半(P<0.01),而FGF4和FGF5則在犏牛中以極低的水平表達(dá)(P<0.01,圖3A)。

A. FGFs在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達(dá);B. FGFRs在牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)A. Expression of FGFs in testis of yak and cattleyak; B. Expression of FGFRs in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak圖3 FGFs及FGFRs在牦牛和犏牛中的表達(dá)Fig.3 Expression of FGFs and FGFRs in yak and cattleyak

2.4 FGFRs在牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞中的差異表達(dá)

通過RT-qPCR的方法檢測(cè)了牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞中FGF受體家族成員FGFR1、FGFR2和FGFR3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,3種FGFR在犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)都顯著低于牦牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.01,圖3B)。

2.5 FGFs/FGFRs介導(dǎo)的Ras和MAPK通路基因在牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞中的差異表達(dá)

通過RT-qPCR檢測(cè)了FGFs/FGFRs介導(dǎo)的Ras和MAPK信號(hào)通路中基因的差異表達(dá)。結(jié)果如圖4A所示,在Ras通路基因中,只有HRas在犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)高于在牦牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.01);ARaf(A-Raf proto-oncogene)在牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)沒有明顯差異;Raf1(Raf-1 proto-oncogene)、BRaf(B-Raf proto-oncogene)、MEK1(mitogen-activated protein kinase kinase 1)、ERK都是在牦牛未分化精原細(xì)胞中的高表達(dá)(P<0.01,圖4A)。在MAPK通路基因中,p38、MEKK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3)、MEKK6(mitogen-activated protein kinase kinase 36)和ASK1(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5)都在牦牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于在犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.01,圖4B)。

A. FGFs/FGFRs介導(dǎo)的Ras通路基因在牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá);B. FGFs/FGFRs介導(dǎo)的MAPK通路基因在牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá);C. 與增殖相關(guān)基因在牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá);D. 與分化相關(guān)基因在牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)。ns.無顯著性差異A. Expression of Ras pathway genes mediated by FGFs/FGFRs in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak; B. Expression of MAPK pathway genes mediated by FGFs/FGFRs in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak; C. Expression of genes related to proliferation in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak; D. Expression of genes related to differentiation in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak. ns. No significant difference圖4 FGFs通路基因及與增殖和分化相關(guān)基因在牦牛和犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 Expression of FGFS pathway genes and genes related to the proliferation and differentiation in undifferentiated spermatogonia of yak and cattleyak

受Ras通路調(diào)控的與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因中,SHISA6和ID4在犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于在牦牛的表達(dá)(P<0.01),而ETV4、GFRα1、Ret和TAF4B(TATA-Box binding protein associated factor 4b)都是在牦牛未分化精原細(xì)胞的表達(dá)量更高(P<0.05,圖4C)。受Ras和MAPK通路共同調(diào)控的與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因中,ETV5和BCL6B也在牦牛未分化精原細(xì)胞的高表達(dá)(P<0.01,圖4C)。受Ras通路調(diào)控的與細(xì)胞分化相關(guān)的基因中,PIWIL4在犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于牦牛,而SOX3、Stra8(stimulated by retinoic acid 8)和NGN3則在牦牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)量更高(P<0.01,圖4D)。

3 討 論

對(duì)牦牛和犏牛睪丸組織的HE染色發(fā)現(xiàn),犏牛睪丸組織中從生精小管基底膜到管腔的距離比牦牛薄得多,管腔中間出現(xiàn)空泡,而且生殖細(xì)胞類型較少,以精原細(xì)胞為主,表明犏牛雄性不育表現(xiàn)為生精小管發(fā)育異常,精子發(fā)生受阻,無法產(chǎn)生精子。另外,CCK-8、PDT和EDU染色結(jié)果也表明犏牛未分化精原細(xì)胞的增殖活性也明顯低于牦牛。這可能會(huì)導(dǎo)致犏牛睪丸組織中用于維持自我更新的干細(xì)胞數(shù)量不足,進(jìn)而減少了用于分化產(chǎn)生精子的干細(xì)胞數(shù)量,進(jìn)一步加重了雄性犏牛的生精停滯。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是一個(gè)龐大的家族,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了23個(gè)家族成員(FGF1-23),它們與5種FGF細(xì)胞表面受體(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和FGFRL1)相結(jié)合,激活下游的信號(hào)通路,影響細(xì)胞的行為[16]。目前,已經(jīng)證實(shí)了FGF2、FGF5、FGF8和FGF9在哺乳動(dòng)物未分化精原細(xì)胞中與相應(yīng)的受體結(jié)合,以維持未分化精原細(xì)胞的自我更新[8-11],而FGF4和FGF21具有抗凋亡的作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示,6種FGF家族成員在犏牛睪丸組織中的表達(dá)都明顯低于其在牦牛中的表達(dá),3種FGF受體也在犏牛未分化精原細(xì)胞中低表達(dá)。因此,以上的結(jié)果表明,FGFs及其受體FGFRs的表達(dá)量不足是犏牛未分化精原細(xì)胞增殖活性低的原因之一。

FGFs/FGFRs介導(dǎo)多條信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為。FGF9與FGFR3結(jié)合,通過ASK1-MEKK3/6-p38信號(hào)的級(jí)聯(lián)激活來維持未分化精原細(xì)胞的自我更新[12]。FGF2、FGF5、FGF8通過HRas-Raf1/ARaf/BRaf-MEK1-ERK信號(hào)的級(jí)聯(lián)激活促進(jìn)未分化精原細(xì)胞的增殖[9-11]。FGF4[13]及FGF21[14]通過Ras-Raf-ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)激活抑凋亡。本研究結(jié)果顯示,只有Ras通路中的HRas的表達(dá)量是在犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)量高于牦牛,ARaf的表達(dá)量在兩種牛中沒有差異。其余的通路基因,包括MAPK通路中的ASK1、MEKK3、MEKK6和p38以及Ras通路中的Raf1、BRaf、MEK1和ERK,都是在牦牛未分化精原細(xì)胞中的高表達(dá)。因此,犏牛未分化精原細(xì)胞增殖能力弱的另一個(gè)重要原因是FGFs/FGFrs介導(dǎo)的Ras和MAPK信號(hào)通路中的基因表達(dá)異常,導(dǎo)致FGFs/FGFRs介導(dǎo)的信號(hào)不能準(zhǔn)確地調(diào)控與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的基因,降低了未分化精原細(xì)胞的增殖活性。

結(jié)果表明,受Ras通路調(diào)控的與未分化精原細(xì)胞增殖相關(guān)的基因中,ID4與SHISA6在犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)量更高。ID4在小鼠中能決定未分化精原細(xì)胞的狀態(tài),ID4+的未分化精原細(xì)胞主要維持自我更新,ID4-的未分化精原細(xì)胞則趨向于分化產(chǎn)生精子[17]。SHISA6是一種細(xì)胞固有的因子,能夠抑制Wnt的表達(dá),而Wnt/β-catenin通路能促進(jìn)未分化精原細(xì)胞的分化[18]。由于犏牛未分化精原細(xì)胞數(shù)量少,為維持用于自我更新的細(xì)胞的數(shù)量,犏牛未分化精原細(xì)胞通過上調(diào)SHISA6的表達(dá)以抑制分化,從而使得犏牛未分化精原細(xì)胞偏向自我更新而不是分化,間接導(dǎo)致了ID4表達(dá)的上調(diào)。

本研究也發(fā)現(xiàn),與增殖相關(guān)的其他基因都是在牦牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)更高。TAF4B是一種在性腺中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,能調(diào)控GFRα1和Ret的表達(dá)[19]。GFRα1和Ret是GDNF的受體[20-21],其介導(dǎo)的信號(hào)通路能促進(jìn)未分化精原細(xì)胞的增殖,同時(shí)又能調(diào)控Etv5的表達(dá)[22]。Etv5既是FGF9和FGF5下游的調(diào)控基因[11-12],同時(shí)又參與調(diào)控Bcl6b的表達(dá)[23-24],用以維持未分化精原細(xì)胞的自我更新。Taf4b在犏牛未分化精原細(xì)胞中表達(dá)不足導(dǎo)致GFRα1和Ret表達(dá)下調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致Etv5、Bcl6b的表達(dá)下調(diào),降低了犏牛未分化精原細(xì)胞的增殖活性。ETV4與ETV5是同源蛋白,也與精原細(xì)胞增殖相關(guān)[25],其表達(dá)量不足也會(huì)降低犏牛未分化精原細(xì)胞的增殖活性。而犏牛未分化精原細(xì)胞增殖活性降低會(huì)導(dǎo)致未分化精原細(xì)胞數(shù)量少,沒有足夠的未分化精原細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)產(chǎn)生精子。

另外,本研究還發(fā)現(xiàn)受Ras通路調(diào)控的與未分化精原細(xì)胞分化相關(guān)的基因中,Piwil4在犏牛未分化精原細(xì)胞中高表達(dá),但Sox3、Ngn3和Stra8在犏牛中低表達(dá)。PIWIL4屬于Argonaute蛋白家族的Piwi分支,在動(dòng)物生殖系中特異表達(dá),其mRNA被提前轉(zhuǎn)錄,以mRNP的形式被存儲(chǔ)[26]。Piwil4在犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)量更高,可能是由于犏牛精子發(fā)生被阻滯在減數(shù)分裂時(shí)期,導(dǎo)致Piwil4的mRNA被大量積累。Sox3是一種轉(zhuǎn)錄因子,與Ngn3啟動(dòng)子區(qū)域中的保守區(qū)域結(jié)合,能直接調(diào)控NGN3的表達(dá),以促進(jìn)未分化精原細(xì)胞的分化[27]。NGN3+的細(xì)胞是準(zhǔn)備進(jìn)入分化的干細(xì)胞,其通過上調(diào)Stra8的表達(dá)促進(jìn)減數(shù)分裂的進(jìn)程[28]。犏牛未分化精原細(xì)胞數(shù)量少,不能進(jìn)入分化態(tài),下調(diào)與分化相關(guān)的基因Sox3的表達(dá)。Sox3的低表達(dá)導(dǎo)致沒有足夠的SOX3轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到的Ngn3啟動(dòng)子上,進(jìn)而下調(diào)了Ngn3的表達(dá),也進(jìn)一步下調(diào)了Stra8的表達(dá),抑制了犏牛精原細(xì)胞的分化。Ngn3在犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于牦牛,表明犏牛未分化精原細(xì)胞群體中NGN3陽性的細(xì)胞占比較少,即犏牛未分化精原細(xì)胞更偏向于自我更新。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn),FGF家族成員(FGF2、FGF4、FGF5、FGF8、FGF9和FGF21)及其相應(yīng)的受體(FGFR1、FGFR2和FGFR3)、FGFs所介導(dǎo)的信號(hào)通路中的基因(p38、Raf、BRaf、MEK1、ERK、MEKK3、MEKK6和ASK1)及與未分化精原細(xì)胞增殖相關(guān)的基因(ETV5、TAF4B、ETV4、BCL6B、GFRα1和Ret)都在犏牛的未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)量不足導(dǎo)致犏牛未分化精原細(xì)胞的增殖活性顯著低于牦牛的未分化精原細(xì)胞,而犏牛未分化精原細(xì)胞增殖活性會(huì)降低導(dǎo)致未分化精原細(xì)胞數(shù)量少(圖5)。另外,與未分化精原細(xì)胞增殖相關(guān)的基因(SHISA6和ID4)及與未分化精原細(xì)胞分化相關(guān)的基因(SOX3、NGN3和Stra8)在犏牛未分化精原細(xì)胞中的表達(dá)量低表明犏牛未分化精原細(xì)胞是用于維持自我更新而不是分化產(chǎn)生精子。因此,FGFs/FGFRs介導(dǎo)的Ras和MAPK通路基因在犏牛未分化精原細(xì)胞中的異常表達(dá),降低了犏牛未分化精原細(xì)胞增殖活性,減少了未分化精原細(xì)胞的數(shù)量,導(dǎo)致犏牛睪丸中沒有足夠的未分化精原細(xì)胞進(jìn)入分化階段產(chǎn)生精子,這可能是犏牛生精停滯的一個(gè)重要原因(圖5)。

圖5 FGFs表達(dá)異常對(duì)犏牛生精停滯的影響Fig.5 Effect of abnormal expression of FGFs on spermatogenesis and stagnation of cattleyak