薛林濤 黃悅悅 施文

【關(guān)鍵詞】 精漿外泌體;精子發(fā)生;功能調(diào)控

中圖分類號(hào)：R711.6?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.09.014

精漿是精子運(yùn)輸和功能調(diào)控的載體[1]，精漿微環(huán)境直接影響精子質(zhì)量和受精功能，精漿外泌體作為精漿成分中重要部分，具有膜結(jié)合特征的雙層磷脂結(jié)構(gòu)，可攜帶并傳遞各種調(diào)控分子如蛋白質(zhì)、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）與脂質(zhì)內(nèi)容物等[2]，特殊的結(jié)構(gòu)使其擁有信號(hào)運(yùn)輸和調(diào)控等重要功能，近年研究發(fā)現(xiàn)精漿外泌體中信號(hào)傳遞通路對(duì)精子發(fā)生和運(yùn)動(dòng)能力獲得有重要調(diào)控作用[3～4]。因此本文就精漿外泌體的結(jié)構(gòu)功能、提取方法以及在精子發(fā)生成熟、功能調(diào)控中的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 精漿外泌體概述

外泌體是細(xì)胞分泌的一種類似于囊泡的納米級(jí)顆粒，外泌體中蘊(yùn)含有多種機(jī)體代謝和生長(zhǎng)所必須的重要物質(zhì)，例如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等[5]，能實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞以及調(diào)控功能，對(duì)機(jī)體的多種細(xì)胞信號(hào)傳輸做介導(dǎo)，因此在很多疾病上可利用外泌體作為診斷指標(biāo)[6]。在對(duì)癌癥研究的進(jìn)展中，發(fā)現(xiàn)循環(huán)體液中的外泌體可作為癌癥診斷的分子標(biāo)記，外泌體中含有一種miR-1910-3p血清能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和增殖，該血清與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CA153結(jié)合使用可增加乳腺癌診斷的敏感性[7]。在肝癌細(xì)胞研究上也發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)生過(guò)程中外泌體可以通過(guò)內(nèi)吞作用或者配體-受體結(jié)合來(lái)傳遞信息至靶細(xì)胞后發(fā)揮作用，是肝癌細(xì)胞增殖的重要部分[8]。因此對(duì)外泌體進(jìn)行研究不僅對(duì)癌細(xì)胞意義重大，對(duì)整個(gè)機(jī)體細(xì)胞的活動(dòng)都至關(guān)重要。

精漿外泌體是存在于精漿中的膜性囊泡，按分泌器官來(lái)源可以分為前列腺小體和附睪小體，它們主要由上皮細(xì)胞以頂漿分泌的形式進(jìn)入精漿，是精漿微環(huán)境的重要組成部分，由于精子特殊的生理結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)含量極少，缺乏體細(xì)胞具有的清除酶和細(xì)胞器，同時(shí)精子受精前基因組轉(zhuǎn)錄處于沉默狀態(tài)，因此精子發(fā)生與成熟對(duì)其微環(huán)境較為依賴。精漿外泌體發(fā)揮功能主要依靠其作為載體攜帶的特殊組分，包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和離子等，精漿外泌體通過(guò)膜融合機(jī)制被精子攝取，在精子自身的成熟和功能調(diào)控中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)不育男性與正常男性精漿外泌體的相關(guān)miRNA表達(dá)譜存在顯著差異，表明某些關(guān)鍵miRNA可能介導(dǎo)了男性不育發(fā)生[9]。精漿外泌體作為載體運(yùn)輸?shù)膒iRNAs在生殖系統(tǒng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄以及逆轉(zhuǎn)錄后的基因沉默中有重要作用，特別是在精子發(fā)生過(guò)程中，piRNAs扮演著信息傳遞的角色[10]。因此對(duì)精漿外泌體的研究有可能發(fā)現(xiàn)男性不育疾病發(fā)生的新機(jī)制，篩選的差異性功能因子有可能成為男性不育診斷的特異性指標(biāo)。

2 精漿外泌體的提取方法

不同組織來(lái)源的外泌體提取方法不同，整體而言大致分為兩種，離心法和試劑盒提取法[11]。離心法常見的有密度梯度離心法、超速離心法、差速離心法。精漿外泌體提取與胞外囊泡提取相似，劉聰慧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，利用差速離心法與密度梯度離心法能順利提取胞外囊泡，但可能提取后產(chǎn)物純度低。差速離心法主要原理為根據(jù)密度和粒子大小設(shè)置不同離心力，有差別離心后通過(guò)平衡沉降原理完成提純，但因?yàn)樵O(shè)置的范圍內(nèi)涵蓋的粒子較廣，可能提取產(chǎn)物純度不高。密度梯度離心法應(yīng)用在常見組織提純中，特別是針對(duì)細(xì)胞內(nèi)的分子與大分子物質(zhì)，一般分離分子密度介于1.1～1.9 g/mL之間，因此離心常用介質(zhì)為蔗糖，但介質(zhì)密度范圍過(guò)大，會(huì)造成濾過(guò)不純的結(jié)果。因早期外泌體提取方法有一定的誤差，提取物不純，有研究者開始使用納米級(jí)材料提取外泌體[13]，例如在血漿中提取外泌體，使用ExoQuick試劑盒提取外泌體，該方法提取到的外泌體蛋白質(zhì)濃度是傳統(tǒng)密度梯度離心法的19倍以上。隨著研究的深入與發(fā)展，最近有研究者還嘗試了純化試劑盒提取法提取小鼠血清的外泌體[14]，此方法提取外泌體操作簡(jiǎn)單快捷，并且不容易出錯(cuò)，適合提取容量較大的樣本，提高研究效率?？偨Y(jié)來(lái)說(shuō)提取外泌體如試驗(yàn)要求純度不高時(shí)可利用簡(jiǎn)單快捷的傳統(tǒng)方法如超速離心法與密度梯度離心法，或者使用純化試劑盒提取法，但要求高時(shí)可利用納米級(jí)操作提取，并且不同方法提取的外泌體成分可能有所差異，因此未來(lái)研究要進(jìn)一步優(yōu)化精漿外泌體提取操作，以便對(duì)精漿外泌體調(diào)控作用原理以及機(jī)制進(jìn)行深入研究。

3 精漿外泌體在精子發(fā)生中的作用

精漿外泌體在精子發(fā)生過(guò)程中起到信號(hào)傳遞的作用，對(duì)調(diào)節(jié)精子發(fā)生有重要影響。精子發(fā)生要經(jīng)過(guò)許多器官的作用，還需要許多因素協(xié)同作用，而調(diào)節(jié)協(xié)同作用傳輸信號(hào)的關(guān)鍵物質(zhì)就是精漿外泌體。精漿外泌體成分復(fù)雜，其來(lái)自附睪、前列腺還有精囊等[15]。外泌體是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵，能夠?yàn)榧?xì)胞相互傳遞信號(hào)分子和物質(zhì)建立橋梁，不僅如此，精漿外泌體還能在弱酸條件下（pH為5～7）與精子進(jìn)行融合;當(dāng)pH值過(guò)高時(shí)（pH>7）則基本不會(huì)進(jìn)行融合[16]。前列腺液與精液的pH值在7.4左右，這證明精漿外泌體促進(jìn)精子獲能和運(yùn)動(dòng)一般不發(fā)生在射精前，主要發(fā)生在射精后[17]。精漿外泌體還攜帶多種具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人精漿外泌體中的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大且具有不同功能類別，包括酶、黏附分子、轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳遞蛋白等，其對(duì)精子有多方面生物學(xué)作用[18]，醛酮還原酶家族1成員B1、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白、5型谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、泛素和精子黏附分子-1等直接參與精子活力和受精能力獲得，在精子氧化損傷防護(hù)中起到作用，F(xiàn)RENETTE等[19]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子與附睪小體結(jié)合，當(dāng)附睪小體與精子融合時(shí)進(jìn)入精子，通過(guò)作用于精子鞭毛上游離的巰基基團(tuán)，防止二硫鍵提前形成，移除結(jié)合于精子鞭毛上的鋅離子，進(jìn)而改變精子活力，促進(jìn)精子成熟。精漿外泌體中的mRNA和非編碼小RNA不僅是潛在的免疫調(diào)節(jié)分子，還具有遺傳性[20～21]。

4 精漿外泌體在精子功能調(diào)控中的作用

據(jù)統(tǒng)計(jì)目前育齡夫婦不孕不育癥的發(fā)生率為15%～20%，其中男性因素約占50%[22～23]，精子功能是保證正常受精的關(guān)鍵，精子活力及功能異常是導(dǎo)致男性不育的重要原因[24～25]。我們前期研究證實(shí)精子功能障礙常呈多因素并發(fā)[26～27]，精子活力低下多與精子形態(tài)異常、精子DNA碎片率升高、頂體功能障礙等并發(fā)，顯著影響精子正常受精功能，是導(dǎo)致男性不育的重要誘因，同時(shí)也是導(dǎo)致輔助生殖助孕周期受精失敗、胚胎發(fā)育異常、早期流產(chǎn)等治療結(jié)局差的重要原因[28]。精漿外泌體作為精漿微環(huán)境的重要組成部分，既參與精子發(fā)生，又在調(diào)節(jié)成熟精子功能中起到重要作用。有研究認(rèn)為精漿外泌體具有免疫抑制效應(yīng)，促進(jìn)精液液化，同時(shí)精漿外泌體含有豐富的膽固醇、鈣離子和表面膜蛋白，與精子融合之后能夠促進(jìn)精子活力、頂體反應(yīng)發(fā)生[29]。同時(shí)精漿外泌體在精子活力調(diào)控中也具有重要作用，SULLIVAN等[30]發(fā)現(xiàn)精子在附睪的成熟過(guò)程中，外泌體是產(chǎn)生具有最佳受精能力的雄性配子所必須的，MURDICA等[10]的研究顯示，精漿中外泌體可以通過(guò)增加誘導(dǎo)酪氨酸磷酸化來(lái)促進(jìn)精子獲能，從而引發(fā)頂體反應(yīng)。DU等[31]的研究通過(guò)添加不同比例的公豬精漿外泌體證實(shí)外泌體可以提高體外儲(chǔ)存精子活力，延長(zhǎng)精子保存期限，改善精子質(zhì)膜完整性，增加抗氧化能力。因此我們推測(cè)，精漿外泌體對(duì)精子功能調(diào)控具有重大影響，其中還有許多調(diào)控通路與機(jī)制值得進(jìn)行深入研究。

5 小結(jié)與展望

精漿外泌體在精漿中廣泛存在，其作為精子生存的重要生理微環(huán)境，在精子成熟及活力調(diào)控中起到至關(guān)重要作用，精漿外泌體功能及作用機(jī)制研究已成為男性不育研究中全新熱點(diǎn)領(lǐng)域，但目前精漿外泌體調(diào)控精子活力及運(yùn)動(dòng)的具體機(jī)制仍未完全闡明，因此開展相關(guān)研究非常有必要。尤其基于現(xiàn)在多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)男性不育患者精漿外泌體進(jìn)行全蛋白組、全轉(zhuǎn)錄組的系統(tǒng)研究，繪制出不育男性精漿外泌體蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組的全景圖及其與正常男性的動(dòng)態(tài)差異圖，從疾病整體角度進(jìn)行聯(lián)合分析，進(jìn)而挖掘出在精子發(fā)生與功能調(diào)控過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白及關(guān)鍵基因表達(dá)調(diào)控通路，將有助于闡明男性不育發(fā)生的分子機(jī)理，有可能提供精漿外泌體中關(guān)鍵因子影響精子發(fā)生與功能的直接證據(jù)，揭示精漿外泌體調(diào)控精子功能的具體機(jī)制，為男性不育的診斷提供新的診斷指標(biāo)，為男性不育臨床治療提供新的途徑。

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（收稿日期：2021-08-18 修回日期：2021-09-01）

（編輯：潘明志）