莫健新，王豪強(qiáng)，黃廣燕，蔡更元,，吳珍芳,，張獻(xiàn)偉,

微生物源果膠酶在豬PK15細(xì)胞中異源表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)分析

莫健新1，王豪強(qiáng)2，黃廣燕2，蔡更元1,2，吳珍芳1,2，張獻(xiàn)偉1,2

1. 溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，新興 527400 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642

果膠是植物細(xì)胞壁組分之一，是畜禽飼料中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響畜禽對(duì)日糧中能量和氮的利用效率。果膠酶在自然界中廣泛存在于細(xì)菌、酵母和絲狀真菌等微生物中，對(duì)解除果膠的抗?fàn)I養(yǎng)作用、提高飼料利用率具有良好的效果。為了探索在豬細(xì)胞中表達(dá)微生物源果膠酶基因的可行性，本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將微生物源果膠酶基因、、和導(dǎo)入豬PK15細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，利用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)法測(cè)定這4種基因編碼果膠酶的酶活力。結(jié)果顯示，4種果膠酶基因均能在豬PK15細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出mRNA，但只有和適應(yīng)豬細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。其中，果膠酶PG5A的最高酶活為0.95 U/mL，最適作用pH為pH4.0，在pH4.6~6.0范圍內(nèi)維持46%以上的酶活；PGI在pH5.0處獲得最高酶活，為0.30 U/mL，在pH4.0~6.0范圍內(nèi)維持35%以上的酶活。消化蛋白酶耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PG5A和PGI對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶均有較強(qiáng)的耐受能力，用1 mg/mL的豬胃蛋白酶處理2 h后，PG5A和PGI的剩余酶活分別為76%和71%；用1 mg/mL的豬胰蛋白酶處理2 h后，PG5A和PGI的剩余酶活分別為44%和93%。綜上所述，果膠酶基因和能在豬細(xì)胞中正常表達(dá)，其編碼的果膠酶對(duì)豬消化道pH條件和消化蛋白酶具有較強(qiáng)的耐受能力，可作為制備轉(zhuǎn)果膠酶基因豬的候選基因。

果膠酶；果膠；抗?fàn)I養(yǎng)因子；轉(zhuǎn)基因；豬

果膠是畜禽飼料中主要的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，阻礙動(dòng)物對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。有研究顯示，在30 kg“杜長(zhǎng)大”生長(zhǎng)豬日糧中添加8%果膠，顯著降低日糧的能量表觀消化率、表觀消化能和氮表觀消化率，極顯著降低能量表觀代謝率和表觀代謝能[1]；在每千克日糧中添加62.2 g果膠，顯著降低白羅曼鵝(White Roman Geese)日增重和飼料轉(zhuǎn)化率[2]；在每千克玉米日糧中添加30 g甲基化程度為60%的果膠，使1~21日齡肉雞的飼料利用率下降37%，增重下降19%[3]。

果膠在結(jié)構(gòu)上主要由D-半乳糖醛酸(D-Galactu-ronic acid)通過α-1,4糖苷鍵連接構(gòu)成，同時(shí)含有DL-鼠李糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖等中性糖[4,5]，是一類廣泛存在于植物細(xì)胞初生壁和細(xì)胞中間片層的雜多糖[6]，占雙子葉植物和非禾本科單子葉植物初生壁的35%、草類初生壁的2%~10%、木本植物細(xì)胞壁的5%[4,7]。在植物細(xì)胞壁中，果膠對(duì)纖維素和半纖維素起到包裹和粘連的作用，降低了畜禽對(duì)植物性飼料細(xì)胞壁物質(zhì)的可消化性。此外，果膠具有較強(qiáng)的持水性，溶于水后使腸道中食糜粘性增大，阻礙消化酶與營(yíng)養(yǎng)物接觸和減緩營(yíng)養(yǎng)小分子向小腸粘膜擴(kuò)散[8]。果膠酶在自然界中廣泛存在細(xì)菌、酵母和絲狀真菌等微生物中，在線蟲和昆蟲中也有少量分布[9,10]，是可特異性降解果膠的一類非淀粉多糖酶。在飼料中添加果膠酶對(duì)解除果膠的抗?fàn)I養(yǎng)作用、提高飼料利用率和改善畜禽的生長(zhǎng)性能具有顯著的效果[8,9,11]。高玉紅等[12]研究顯示，在“杜長(zhǎng)大”三元雜交仔豬基礎(chǔ)日糧中添加含有1%果膠酶的復(fù)合酶制劑使日增重提高14.50%，料肉比降低17.8%。鄭騰[13]研究顯示，在“長(zhǎng)大”二元雜交豬的基礎(chǔ)日糧中添加含有活性為5195 U/kg果膠酶的復(fù)合酶制劑，對(duì)36~56日齡仔豬和57~98日齡生長(zhǎng)豬的日增重、料肉比和飼料利用率都有顯著的改善作用。

盡管果膠酶以飼料添加劑的方式使用可有效解除果膠的抗?fàn)I養(yǎng)作用，但是其酶活力容易受環(huán)境溫度、濕度和酸堿度等條件影響，飼用效果極不穩(wěn)定[14,15]。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，創(chuàng)制能在消化道分泌非淀粉多糖酶的節(jié)糧環(huán)保轉(zhuǎn)基因畜禽新品種為解決非淀粉多糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用提供了新方案[16,17]。2001年，Golovan等[18]利用轉(zhuǎn)基因方法首次獲得在唾液腺中表達(dá)大腸桿菌()植酸酶EsAPPA (GenBanK登錄號(hào)：M58708.1)的轉(zhuǎn)基因豬，該豬對(duì)飼料磷的消化率提高88%~99%，糞磷排放量降低75%。2018年，本課題組利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功得到在唾液腺中特異性表達(dá)葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶的轉(zhuǎn)基因豬，與非轉(zhuǎn)基因豬相比，該豬在生長(zhǎng)–育成階段糞氮排放顯著減少24.0%，糞磷排放顯著減少45.8%，對(duì)飼料磷的表觀消化率顯著提高119.3%，對(duì)飼料氮的表觀消化率顯著提高7.8%，對(duì)飼料鈣的表觀消化率顯著提高41.2%，日增重顯著提高30.69%，料肉比顯著下降12.03%，育成所需飼料減少12.18%，育成周期縮短22.58%，具有明顯的環(huán)保和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[19]。但到目前為止，表達(dá)果膠酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型尚未見報(bào)道。

豬消化道有其本身特殊的環(huán)境條件，溫度較為穩(wěn)定，一般在38.5~40℃之間波動(dòng)[20]。pH處于動(dòng)態(tài)變化中：正常情況下胃液pH在1.7~4.9間波動(dòng)，小腸液pH在6.1~6.7間波動(dòng)，盲腸液pH在6.0~6.4間波動(dòng)，結(jié)腸液pH在6.1~6.6間波動(dòng)。果膠酶的活力極容易受到溫度與酸堿度影響，溫度過高或者過低、pH偏酸或偏堿均會(huì)抑制果膠酶的活性，甚至使其失活。因此，篩選作用條件與豬消化道環(huán)境條件相適應(yīng)的果膠酶是成功制備轉(zhuǎn)果膠酶基因豬的關(guān)鍵。目前已有數(shù)條微生物源果膠酶基因被挖掘出來。Wang等[21]報(bào)道，黑曲霉(ZJ5)基因(GenBank登錄號(hào)：KU896780，簡(jiǎn)寫為)編碼的果膠酶在畢赤酵母()中異源表達(dá)，最高酶活為10436 U/mL，最適溫度為25~45℃，最適pH為4.5~6.5。Tu等[22]研究表明，無毛毛殼屬微生物(sp. Xz8)基因(GenBank登錄號(hào)：KC633130)編碼的果膠酶在畢赤酵母中異源表達(dá)，最高酶活為49934 U/mL，最適溫度為30~60℃，最適pH為4.0~6.5。Zhou等[23]研究表明，黑曲霉(SC323)基因(GenBank登錄號(hào)：KP265703)編碼的果膠酶在釀酒酵母()中異源表達(dá)，最大酶活為1448.48 U/mg，最適溫度為35~70℃，最適pH為3.0~6.0。Liu等[24]報(bào)道，黑曲霉(JL-15)基因(GenBank登錄號(hào)：KF157661)編碼的果膠酶在畢赤酵母中異源表達(dá)，最高酶活為2091 U/mg，最適溫度為30~60℃，最適pH為4.0~6.0。以上4種果膠酶在酵母中異源表達(dá)均能獲得高酶活，且其最適作用溫度和最適作用pH與豬消化道條件較為接近，具備作為制備轉(zhuǎn)果膠酶基因豬候選基因的條件。

本課題組前期研究顯示，豬腎細(xì)胞系PK15 (porcine kidney 15，PK15)能很好地模擬外源非淀粉多糖酶基因在豬唾液腺分泌細(xì)胞中的表達(dá)模式，用豬PK15細(xì)胞篩選得到的外源非淀粉多糖酶基因可有效地在豬腮腺分泌細(xì)胞中表達(dá)[19]。本研究根據(jù)豬遺傳密碼子使用偏好，對(duì)微生物源果膠酶基因、、和的編碼序列進(jìn)行優(yōu)化，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入豬PK15細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，參照國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《QB 1502-92 食品添加劑果膠酶制劑》，利用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)法測(cè)定這些基因編碼的果膠酶在豬PK15細(xì)胞中表達(dá)的酶活力，并分析它們的最適作用pH范圍和對(duì)酸堿度以及消化蛋白的耐受能力，旨在篩選出作用條件與豬消化道環(huán)境條件相適應(yīng)的果膠酶，為創(chuàng)制分泌果膠酶的新型節(jié)糧環(huán)保轉(zhuǎn)基因豬提供候選基因和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 候選果膠酶基因密碼子優(yōu)化、真核表達(dá)載體構(gòu)建及在豬PK15細(xì)胞中表達(dá)

果膠酶基因、、和經(jīng)SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)信號(hào)肽后，去掉其原有信號(hào)肽，利用OptimumGeneTM基因設(shè)計(jì)軟件根據(jù)豬密碼子使用偏好進(jìn)行優(yōu)化(由南京金斯瑞生物科技公司完成)。將牛源的腮腺分泌蛋白信號(hào)肽編碼序列添加到密碼子優(yōu)化后的候選基因上，在其5′端添加dⅢ酶切位點(diǎn)，3′端添加Ⅰ酶切位點(diǎn)，利用南京金斯瑞生物科技公司的Gene-on-DemandTM技術(shù)平臺(tái)合成基因并分別克隆到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體上(由南京金斯瑞生物科技公司完成)，分別得到果膠酶真核表達(dá)載體pCD-、pCD-、pCD-和pCD-。

將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)。用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒Endo-free Plasmid Mini KitⅡ(OMEGA，廣州)提取質(zhì)粒，保存于?20℃冰箱中備用。復(fù)蘇豬PK15細(xì)胞，培養(yǎng)至密度為80%左右。以pcDNA3.1(+)作為空白對(duì)照，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTMLTX + PLUSTMReagent (Thermo Fisher Scientific，美國(guó))將無內(nèi)毒素的果膠酶基因真核表達(dá)載體導(dǎo)入豬PK15細(xì)胞，每個(gè)反應(yīng)轉(zhuǎn)染4 μg質(zhì)粒，每個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行3次重復(fù)。48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，90離心3 min，取上清液作為粗酶液，保存于?20℃冰箱中備用。收集剩余細(xì)胞，用RNA抽提試劑盒Total RNA Kit Ⅰ(OMEGA，廣州)抽提RNA，通過RT-PCR法檢測(cè)果膠酶基因mRNA水平的表達(dá)情況(引物序列見表1)。

1.2 果膠酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取150 μL磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液于2 mL離心管中，加入450 μL DNS試劑，混勻，沸水加熱5 min。冷卻至室溫，用雙蒸水定容至1 mL，10 000離心1 min，取上清液作為標(biāo)準(zhǔn)空白樣。

取7個(gè)潔凈的100 mL容量瓶，依次加入1~7 mL 1%的半乳糖醛酸溶液，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液定容至100 mL，搖勻，獲得濃度為0.10~0.70 mg/mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別吸取50 μL半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 (每個(gè)濃度梯度進(jìn)行3次重復(fù)) 到2 mL離心管中，依次加入100 μL磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液和450 μL DNS試劑，混勻，沸水浴5 min。冷卻至室溫，用雙蒸水定容至1 mL，10 000離心1 min。用標(biāo)準(zhǔn)空白樣調(diào)零，在540 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值。

以半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度為Y軸，吸光度值為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：= 3.3889+ 0.2707 (相關(guān)系統(tǒng)R2=0.997)。對(duì)應(yīng)的果膠酶酶活計(jì)算公式為：果膠酶活力(U/mL)=D×((A1–A0)×3.3889+0.2707)/ 6483.6×1000；其中，A1為酶反應(yīng)液吸光度，A0為滅活組吸光度，D為酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.2 果膠酶活性測(cè)定方法

以1%多聚半乳糖醛酸溶液作為底物，以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的豬PK15細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，分別測(cè)定質(zhì)粒pCD-pCD-、pCD-和pCD-表達(dá)果膠酶的酶活性。測(cè)定方法參考國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《QB 1502-92 食品添加劑果膠酶制劑》，具體如下：

滅活組：取50 μL粗酶液放入2 mL離心管中，加入450 μL DNS試劑，混勻。加入100 μL底物，39.5℃處理30 min，沸水浴加熱5 min。冷卻至室溫，用雙蒸水定容到1 mL，混勻，10 000離心1 min，吸取上清液，測(cè)定540 nm處的吸光度值。

酶活測(cè)定組：取50 μL粗酶液(設(shè)置3個(gè)重復(fù))放入2 mL離心管中，加入100 μL底物，混勻，39.5℃反應(yīng)30 min。加入450 μL DNS試劑，沸水浴加熱5 min。冷卻至室溫，用雙蒸水定容到1 mL，混勻，10 000離心1 min，測(cè)定540 nm處吸光度值。

表1 RT-PCR擴(kuò)增引物

1.2.3 最適pH測(cè)定

配制pH梯度(pH2.5~7.0)的1%多聚半乳糖醛酸溶液作為底物，分別與粗酶液進(jìn)行酶促反應(yīng)(設(shè)置3個(gè)重復(fù))，測(cè)定果膠酶的最適pH。

1.2.4 pH穩(wěn)定性測(cè)定

配制pH梯度(pH2.0~8.0)的緩沖液，分別取200 μL不同pH的緩沖液與50 μL粗酶液混合(設(shè)置3個(gè)重復(fù))，39.5℃孵育2 h，加入1.2.3中測(cè)得的最適pH多聚半乳糖醛酸溶液100 μL，39.5℃反應(yīng)30 min，加入450 μL DNS試劑，沸水浴5 min，以最高酶活為100%，測(cè)定不同pH緩沖液處理后果膠酶的剩余酶活。

1.2.5 胃蛋白酶和胰蛋白酶耐受能力測(cè)定

果膠酶胃蛋白酶和胰蛋白酶耐受性測(cè)定參考Tu等[25]和孫悅[26]報(bào)道的方法，具體如下：

胃蛋白酶耐受性分析：取50 μL粗酶液與200 μL豬胃蛋白酶溶液(1 mg/mL，pH4.3)混合(設(shè)置3個(gè)重復(fù))，39.5℃處理2 h，加入1.2.3中測(cè)得的最適pH多聚半乳糖醛酸溶液100 μL，39.5℃反應(yīng)30 min，視粗酶液經(jīng)pH4.3谷氨酸–鹽酸緩沖液處理2 h后測(cè)得的酶活力為100%，測(cè)定果膠酶的剩余酶活。

胰蛋白酶耐受性分析：取50 μL粗酶液與200 μL豬胰蛋白酶(1 mg/mL，pH8.0)混合， 39.5℃處理2 h，加入1.2.3中測(cè)得的最適pH多聚半乳糖醛酸溶液100 μL，視粗酶液經(jīng)pH7.0 Tris-HCl緩沖液處理2 h后測(cè)得的酶活力為100%，測(cè)定其剩余酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶基因?qū)ωi細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)適應(yīng)性提高

根據(jù)豬基因表達(dá)系統(tǒng)的密碼子使用偏好，對(duì)果膠酶基因、、和的編碼序列進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，4種果膠酶基因優(yōu)化后的密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index, CAI)分別為0.98、0.81、0.97和0.82，均大于0.8 (一般認(rèn)為CAI> 0.8時(shí)，基因即可得到較高水平的表達(dá)) (表2)；4種基因評(píng)分為0~50的低頻率使用的密碼子和稀有密碼子被完全剔除，豬高頻使用的密碼子比例均顯著提高(圖1 A)；4種基因的GC含量均在30%~70%理想范圍內(nèi)，統(tǒng)計(jì)區(qū)域60 bp以內(nèi)的GC%峰被移除(圖1 B)。以上結(jié)果表明，4種果膠酶基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后對(duì)豬基因表達(dá)系統(tǒng)的適應(yīng)性提高，有利于它們?cè)谪i細(xì)胞中表達(dá)。

2.2 果膠酶基因在豬PK15細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄

以空白載體pcDNA3.1(+)為對(duì)照，分別將果膠酶基因表達(dá)載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入豬PK15細(xì)胞。48 h后，利用RT-PCR檢測(cè)4種果膠酶基因mRNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，果膠酶基因、、和均能成功轉(zhuǎn)錄出mRNA (圖2)。

2.3 果膠酶PG5A和PGI的酶活力較PGA3A和PGAA強(qiáng)

以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體的細(xì)胞培養(yǎng)液作為對(duì)照組，根據(jù)豬消化道的溫度條件和4種果膠酶在酵母細(xì)胞中表達(dá)的最適pH，測(cè)定它們?cè)?9.5℃和pH5.0條件下的果膠酶活力。結(jié)果顯示，果膠酶PG5A的活性最高，為0.48 U/mL；其次是PGI，為0.37 U/mL；PGA3A的果膠酶活性極低；PGAA與對(duì)照組酶活差異不顯著(>0.05) (圖3)。果膠酶PGAA進(jìn)行完酶活力比較實(shí)驗(yàn)后被淘汰，不再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.4 果膠酶PG5A和PGI最適pH與豬消化道pH相近

分別用pH梯度(pH2.5~7.0)底物溶液與果膠酶PG5A、PGI和PGA3A進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定它們的最適作用pH，結(jié)果如圖4所示。PG5A在pH4.0處獲得最高酶活，為0.95 U/mL，在pH3.0和pH5.0處的酶活分別為0.51 U/mL和0.57 U/mL，當(dāng)?shù)孜飌H低于pH2.5或者大于pH6.0時(shí)，其活性受到了極大的抑制。PGI在pH5.0處獲得最大活性，為0.30 U/mL，在pH4.0處和pH6.0處的活性分別為0.25 U/mL和0.19 U/mL，當(dāng)?shù)孜飌H小于pH3.0或者大于pH7.0時(shí)幾乎不表現(xiàn)出酶活力。PGA3A在pH2.5~7.0范圍內(nèi)均沒有檢測(cè)到果膠酶活性。綜上所示，果膠酶PG5A和PGI的最適pH范圍分別為pH3.0~5.0和pH3.0~6.0，均在豬消化道pH波動(dòng)范圍(pH1.7~6.7)內(nèi)。果膠酶PGA3A進(jìn)行完最適pH測(cè)定后被淘汰，不再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 4種果膠酶基因密碼子適應(yīng)指數(shù)優(yōu)化結(jié)果

CAI：密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index)。

圖1 4種果膠酶基因最優(yōu)密碼子頻率和GC含量?jī)?yōu)化結(jié)果

A：最優(yōu)密碼子頻率優(yōu)化結(jié)果；B：GC含量?jī)?yōu)化結(jié)果。

圖2 4種果膠酶基因mRNA水平表達(dá)檢測(cè)

圖3 4種果膠酶酶活力比較

不同字母標(biāo)注表示組間差異顯著(<0.05)。

2.5 果膠酶PG5A和PGI對(duì)酸堿度和消化蛋白酶耐受能力強(qiáng)

利用不同pH (pH2.0~8.0)的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液處理2 h后，測(cè)定果膠酶PG5A和PGI的剩余酶活力，分析它們的酸堿度耐受能力，結(jié)果如圖5A所示。PG5A在pH4.0~6.0范圍內(nèi)維持46%以上的活性，當(dāng)pH低于pH3.0或高于pH7.0時(shí)，pH對(duì)其活性的具有明顯的抑制作用；PGI在pH4.0~6.0范圍內(nèi)維持35%以上的活性，而當(dāng)pH低于pH3.0或者高于pH7.0時(shí)，其活性同樣受到極大的抑制。利用豬胃蛋白酶和胰蛋白酶處理PG5A和PGI，測(cè)定它們對(duì)消化蛋白酶的耐受能力。胃蛋白酶耐受性試驗(yàn)結(jié)果顯示，PG5A和PGI對(duì)胃蛋白酶均具有較強(qiáng)的耐受能力，處理后剩余酶活分別為76%和71% (圖5 B)；胰蛋白酶耐受性試驗(yàn)結(jié)果顯示，PGI對(duì)胰蛋白酶的耐受能力較強(qiáng)，處理后保留93%的剩余酶活，而PG5A僅保留44%的剩余酶活(圖5 B)。以上結(jié)果表明，果膠酶PG5A和PGI對(duì)酸堿度和消化蛋白酶具有較強(qiáng)的耐受能力。

圖4 果膠酶PG5A、PGI和PGA3A的最適作用pH測(cè)定

A：pH穩(wěn)定性；B：消化蛋白酶耐受性。*表示組間差異顯著(<0.05)。

3 討論

果膠酶基因、、和在酵母中高效表達(dá)，其編碼果膠酶發(fā)揮最大酶活力的溫度和pH范圍與豬消化道溫度和pH范圍相似[21~24]。本文根據(jù)豬基因表達(dá)系統(tǒng)遺傳密碼使用偏好，對(duì)、、和的編碼序列進(jìn)行優(yōu)化，并導(dǎo)入豬PK15細(xì)胞中異源表達(dá)，探究它們?cè)谪i細(xì)胞中表達(dá)的可行性，為創(chuàng)制轉(zhuǎn)果膠酶基因豬提供候選基因。研究結(jié)果顯示，在豬PK15細(xì)胞表達(dá)果膠酶活力最高，其次為。而和雖然能正常轉(zhuǎn)錄，但在其細(xì)胞培養(yǎng)液中沒能檢測(cè)到果膠酶活力。

和在豬PK15細(xì)胞表達(dá)獲得果膠酶的最適作用pH范圍分別在3.0~5.0和4.0~6.0之間，與它們?cè)诋叧嘟湍钢斜磉_(dá)獲得果膠酶的最適pH范圍相似。在PK15細(xì)胞中，編碼果膠酶的最大酶活在pH4.0處測(cè)得，為0.95 U/mL，編碼果膠酶的最大酶活在pH5.0處測(cè)得，為0.30 U/mL，二者均與它們?cè)诋叧嘟湍钢斜磉_(dá)獲得的最大酶活存在較大差異(為10 436 U/mL，為49 934 U/mL)，與孫悅[26]報(bào)道的結(jié)果相似。原因可能與果膠酶基因在兩種細(xì)胞中的表達(dá)效率差異導(dǎo)致的單位體積培養(yǎng)基內(nèi)含有酶數(shù)量的不同有關(guān)。首先，和在畢赤酵母中的表載體是pPIC9K，該載體允許基因多拷貝插入[27]，而在PK15細(xì)胞中的表達(dá)載體是pcDNA3.1(+)，只含有單拷貝的外源基因，導(dǎo)致二者在PK15細(xì)胞中表達(dá)量遠(yuǎn)低于它們?cè)诋叧嘟湍钢械谋磉_(dá)量。其次，畢赤酵母在培養(yǎng)罐中可進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源基因的表達(dá)量可隨細(xì)胞密度的增加而呈指數(shù)式增加，而PK15細(xì)胞在培養(yǎng)皿中為單層細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞愈合之后停止生長(zhǎng)，導(dǎo)致PK15細(xì)胞介導(dǎo)和表達(dá)的能力遠(yuǎn)低于畢赤酵母。

經(jīng)密碼子優(yōu)化后，和的CAI分別為0.97和0.82，均大于0.8，GC含量分別為63.26%和54.24%，密碼子均分布在評(píng)分為51~100之間的高頻使用密碼子間，優(yōu)化結(jié)果與和相似，說明優(yōu)化結(jié)果利于和在豬細(xì)胞中表達(dá)。但在它們的細(xì)胞培養(yǎng)液中沒有檢測(cè)到果膠酶活性，與它們?cè)诮湍钢斜磉_(dá)的結(jié)果不同。在釀酒酵母中表達(dá)獲得果膠酶的最大酶活為1448.48 U/mg[23]，在畢赤酵母中表達(dá)獲得果膠酶的最大酶活為2091.0 U/mg[24]，均遠(yuǎn)小于和在酵母細(xì)胞中表達(dá)獲得果膠酶的最大酶活。結(jié)合和在豬PK15細(xì)胞中表達(dá)獲得果膠酶的最大酶活僅為0.95 U/mL和0.30 U/mL的結(jié)果，我們推測(cè)PGA3A和PGAA不表現(xiàn)出果膠酶活性的原因可能與二者的活性低有關(guān)，在PK15細(xì)胞的表達(dá)量可能不足以使它們表現(xiàn)出酶活力。此外，動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)蛋白翻譯后修飾方式存在明顯差異。PGA3A和PGAA不表現(xiàn)果膠酶活性也可能是它們無法適應(yīng)豬細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)致的。PG5A和PGI在豬細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得最大酶活力(PG5A>PGI)與酵母表達(dá)系統(tǒng)(PG5A

豬的消化道有其獨(dú)特的生理?xiàng)l件，其消化液一般為酸性，且處于動(dòng)態(tài)變化中。豬胃液pH在1.7~4.9間變化，平均水平為4.4，小腸液pH在6.1~6.7間變化，盲腸液pH在6.0~6.4間變化，結(jié)腸pH在6.1~ 6.6間變化。因此，果膠酶必須含有較寬的適宜pH范圍且對(duì)酸堿度有較強(qiáng)的耐受能力才能在豬消化道內(nèi)發(fā)揮作用。本研究篩選得到的果膠酶PG5A和PGI的最適pH范圍在3.0~5.0和4.0~6.0之間，在豬消化道pH的波動(dòng)范圍內(nèi)。PG5A和PGI在pH4.0~6.0條件下處理2 h后分別維持46%和35%以上的酶活，說明二者對(duì)酸堿度有較強(qiáng)的耐受能力，適應(yīng)豬消化道的pH條件。另外，豬消化道還含有高濃度的消化蛋白酶。果膠酶能在豬消化道發(fā)揮作用的另一個(gè)條件是對(duì)消化蛋白酶具有較強(qiáng)的耐受能力。消化蛋白酶耐受性實(shí)驗(yàn)顯示，PG5A和PGI在1 mg/mL胃蛋白酶溶液中分別維持76%和71%的酶活，在1 mg/mL胰蛋白酶溶液中分別維持著93%和44%的酶活，對(duì)消化道的消化蛋白酶具有較強(qiáng)的耐受能力。

綜上所述，果膠酶基因和能在豬細(xì)胞中高效表達(dá)。其編碼果膠酶的最適作用pH在豬消化道pH變化范圍內(nèi)，且對(duì)酸堿度和豬消化蛋白酶具有較強(qiáng)的耐受能力，可作為創(chuàng)制新型節(jié)糧環(huán)保轉(zhuǎn)基因豬的功能基因。

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Heterogenous expression and enzymatic property analysis of microbial-derived pectinases in pig PK15 cells

Jianxin Mo1, Haoqiang Wang2, Guangyan Huang2, Gengyuan Cai1,2,Zhenfang Wu1,2, Xianwei Zhang1,2

As one of plant cell wall components, pectin is the main anti-nutritional factor in livestock and poultry feeds and has an adverse effect on utilization efficiency of feed energy and nitrogen. Pectinases, which are widely found in microorganisms such as bacteria, yeast and filamentous fungi in nature，can improve feed efficiency by relieving the anti-nutritional effect of pectin through promoting the hydrolysis reaction of feed pectin. To explore the feasibility of expressing microbial-derived pectinase genes in pig cells, we introduced microbial-derived pectinase genes,,, andinto porcine PK 15 cells by lipofection for heterogenous expression. Enzymatic activities of the pectinases encoded by these genes were analyzed using the 3,5 dinitrosalicylic acid (DNS) method. Results showed that all four pectinase genes were able to be transcribed into mRNAs in porcine PK 15 cells, but onlyandwere adapted to the porcine cell expression system. Among them, the maximum activity of pectinase PG5A was 0.95 U/mL, the optimum pH was pH 4.0, and the enzymatic activity was maintained above 46% in the range of pH 4.6 to 6.0. Pectinase PGIobtained the highest enzymatic activity at pH 5.0, which was 0.30 U/mL, and maintained more than 35% of the activity in the range of pH 4.0 to 6.0. The results of digestive protease tolerance test showed that PG5A and PGI were highly resistant to pepsin and trypsin. After treatment with 1 mg/mL pig pepsin for two hours, the residual enzymatic activities of PG5A and PGI were 76% and 71%, respectively. And after two hours treatment with 1 mg/mL of pig trypsin, the remaining enzymatic activities of PG5Aand PGI were 44% and 93%, respectively. In summary, pectinase PG5A and PGI can be effectively expressed in pig cells, and have strong tolerance to pig intestinal pH environment and digestive proteases. Therefore, bothandcan be used as candidate genes for production of transgenic pigs.

pectinases; pectin; anti-nutritional factors; transgene; pigs

2019-03-27;

2019-07-18

國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)(編號(hào)：2016ZX08006002)和廣東省科技廳平臺(tái)條件建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：2013B070702003)資助[Supported by the National Transgenic Major Projects (No.2016ZX08006002) and Guangdong Provincial Science and Technology Department Platform Condition Construction Project (No. 2013B070702003)]

莫健新，碩士研究生，專業(yè)方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail: 2696064146@qq.com

張獻(xiàn)偉，博士，在站博士后，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：zxianw@163.com

10.16288/j.yczz.19-087

2019/8/5 20:59:45

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190805.2059.002.html

(責(zé)任編委: 任軍)