孫朱貞，馮小海，許召賢，曹長虹，徐　錚，徐　虹

(1. 南京工業(yè)大學材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京210009;

2. 南京工業(yè)大學食品與輕工學院，江蘇南京211800)

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一株產(chǎn)ε-聚賴氨酸的白色鏈霉菌遺傳轉化體系

孫朱貞1,2，馮小海1,2，許召賢1,2，曹長虹1,2，徐錚1,2，徐虹1,2

(1. 南京工業(yè)大學材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京210009;

2. 南京工業(yè)大學食品與輕工學院，江蘇南京211800)

摘要：為了更好地研究ε-聚賴氨酸(ε-PL)生物合成的分子機制以及構建ε-PL高產(chǎn)基因工程菌株，擬建立一株ε-PL產(chǎn)生菌株Streptomyces albulus PD-1的遺傳轉化體系。通過對培養(yǎng)基類型、孢子預萌發(fā)處理、培養(yǎng)基中Mg(2+)濃度等條件進行考察，以Escherichia coli ET12567(pUZ8002)為供體菌，成功地將pIB139質粒導入S. albulus PD-1中。結果表明：質粒轉化效率達到(3±0.4)× 10(-6)個接合轉化子/受體。接合子傳代實驗和PCR結果發(fā)現(xiàn)，pIB139質粒能夠穩(wěn)定整合在S. albulus PD-1染色體的attB位點上。本研究建立了一株ε-PL生產(chǎn)菌株的遺傳轉化體系，為從分子水平上研究ε-PL的合成及ε-PL高產(chǎn)菌株的構建奠定了基礎。

關鍵詞：ε-聚賴氨酸；白色鏈霉菌；遺傳轉化體系；pIB139

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是由L-賴氨酸的α-氨基和ε-羧基通過酰胺鍵連接而成的同型聚氨基酸。由于其良好的抑菌性和生物安全性，ε-PL已經(jīng)作為一種天然的食品及化妝品防腐劑被多個國家批準使用[1-2]。2014年我國批準ε-PL及其鹽酸鹽作為新型食品添加劑可以在食品行業(yè)中使用[3]，極大地推動了國內(nèi)ε-PL的生產(chǎn)和研究工作。

在工業(yè)上，ε-PL主要是通過放線菌發(fā)酵獲得。自1977年第1株ε-PL產(chǎn)生菌株被篩選出來，研究者們通過新型菌株篩選、高效菌株誘變、發(fā)酵體系優(yōu)化等措施大大提高了微生物合成ε-PL的效率[4-6]，但是關于ε-PL合成機制的研究卻較少。究其原因是缺少ε-PL相關產(chǎn)生菌株的遺傳轉化體系。遺傳轉化體系是對菌株進行基因鑒定分析、代謝途徑改造和其他遺傳操作的前提。2000～2006年期間，Pandey等[5,7-11]利用基于S.albulusIFO14147內(nèi)源質粒復制子構建的復制型質粒建立了適用于S.albulusIFO14147的接合轉移體系，并借助此遺傳轉化體系進行了ε-PL的合成機制探索。但由于此工作是基于S.albulusIFO14147內(nèi)源質粒復制子展開的，并不能為其他ε-PL產(chǎn)生菌株所借用。盡管近年來多個ε-PL研究小組指出ε-PL產(chǎn)生菌株遺傳轉化體系構建的重要性[12-14]，但是由于放線菌絲狀菌體形態(tài)、較厚的細胞壁以及較長的生長周期等特點，未見有其他關于ε-PL生產(chǎn)菌株遺傳轉化體系及其分子改造的報道[15-18]。

目前鏈霉菌常用的遺傳轉化體系有3種：原生質體轉化、電轉化和接合轉移。在此3種方法中，接合轉移由于其操作簡便、轉化效率高、穩(wěn)定性好而被應用于許多鏈霉菌中。根據(jù)相關報道表明，不同鏈霉菌進行接合轉移的培養(yǎng)基是不同的，例如，方志鍇等[19]研究金色鏈霉菌遺傳轉化體系時發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基為其最理想的接合轉移培養(yǎng)基； Park等[20]發(fā)現(xiàn)ISP-4是S.mobaraensisATCC29032最適接合轉移培養(yǎng)基，而以AS-2和ISP-2作為接合轉移培養(yǎng)基時無S.mobaraensisATCC29032接合子長出；朱云霞等[21]發(fā)現(xiàn)ISP-4是抗生素Bagremycin生產(chǎn)菌Streptomycessp. Tü4128最適的接合轉移培養(yǎng)基。因此，本文中，筆者嘗試采用接合轉移的方法應用于遺傳轉化體系的建立，并嘗試上述幾種培養(yǎng)基，最終選擇轉化效率最高的培養(yǎng)基，作為本實驗的最適培養(yǎng)基。在此基礎上對實驗過程中各條件進行優(yōu)化，以達到最高的轉化效率。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株與質粒

ε-PL高產(chǎn)菌株S.alublusPD-1，由徐虹老師課題組篩選、誘變獲得，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2011043。pIB139質粒是由pSET152質粒發(fā)展而來的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型質粒，其中包含紅霉素抗性基因強啟動子、pUC18復制子、阿泊拉霉素抗性基因以φ31的整合酶基因和整合位點。E.coliET12567(pUZ8002)為接合轉移供體菌。pIB139質粒和E.coliET12567(pUZ8002)菌株均由武漢大學瞿旭東老師饋贈。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂。

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基(g/L)：TSB 30,購于Oxoid公司。

接合轉移用培養(yǎng)基有MS培養(yǎng)基(g/L)：甘露醇20，大豆粉20，瓊脂20。AS-1培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，L-丙氨酸0.2，L-精氨酸0.5，可溶性淀粉5，NaCl 2.5，Na2SO410，瓊脂20；pH 7.5。ISP-2培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉4，麥芽提取物10，葡萄糖4，瓊脂20。ISP-4培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉10，(NH4)2SO42， MgSO4·7H2O 2，CaCO32，NaCl 1，K2HPO41，ZnSO41，F(xiàn)eSO4·7H2O 1，MnCl21，瓊脂20；pH 7.2。所有接合轉移用固體培養(yǎng)基均添加10 mmol/L的MgCl2。

1.2實驗方法

1.2.1S.albulusPD-1菌株對抗生素的敏感性測試

為了確定用于S.albulusPD-1菌株進行遺傳操作的選擇標記，筆者考察S.albulusPD-1對阿泊拉霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、硫鏈絲菌素、萘啶酮酸等6種常用抗生素的抗性水平。試驗中分別配制了含0、5、10、25、50 和100 μg/mL上述抗生素的MS平板。之后將200 μL含有約108個S.albulusPD-1的孢子懸浮液均勻涂布于平板上，30 ℃培養(yǎng)7 d后對平板上菌落長出情況進行統(tǒng)計，確定S.albulusPD-1對各種抗生素的敏感性。

1.2.2接合轉移

接合轉移方法參照鏈霉菌操作手冊，且進行了適當?shù)膬?yōu)化。首先將pIB139質粒通過熱激轉化法轉入E.coliET12567(pUZ8002)中，得到供體菌株E.coliETl2567(pUZ8002,pIB139)。挑取E.coliET12567(pUZ8002,pIB139)單菌落接種在50 mL LB培養(yǎng)基(含有50 μg/mL的阿泊拉霉素、卡那霉素和氯霉素)中，37 ℃培養(yǎng)至OD600達到0.5左右，離心收集菌體。使用同等體積的新鮮LB培養(yǎng)基洗滌菌體2次，以除去菌體上附著的抗生素，將洗滌好的供體菌懸浮于0.5 mL新鮮LB培養(yǎng)基中待用。同時，將事先凍藏的S.albulusPD-1的孢子(約108個)懸浮于TSB培養(yǎng)基中，然后經(jīng)過熱激處理誘導孢子萌發(fā)后懸浮于0.5 mL新鮮LB培養(yǎng)基中。最后，將處理好的E.coliET12567(pUZ8002,pIB139)和S.albulusPD-1孢子混合均勻分別涂布于MS、AS-1、ISP-2、ISP-4固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)15～18 h后，將1 mL含有阿泊拉霉素和萘啶酮酸(質量濃度分別為50和25 μg/mL)的無菌水覆蓋，以殺滅平板上的大腸桿菌和未發(fā)生質粒轉化的S.albulusPD-1。30 ℃培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計平板上接合子菌落長出情況。

2結果與討論

2.1S.albulusPD-1菌株對抗生素的敏感性測試

表1為S.albulusPD-1菌株對抗生素的敏感性試驗結果。由表1可知：S.albulusPD-1對硫鏈絲菌素和阿泊拉霉素非常敏感，分別在質量濃度為5和10 μg/mL時即可完全抑制S.albulusPD-1在MS平板上的生長；對卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素表現(xiàn)出較強的抗性，在100 μg/mL的平板上仍有少量S.albulusPD-1菌落長出。鑒于此，硫鏈絲菌素和阿泊拉霉素的抗性基因可以作為S.albulusPD-1進行遺傳操作的選擇標記，以建立其遺傳轉化體系。本研究中選擇的質粒是含有阿泊拉霉素抗性基因和φ31整合酶基因的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒pIB139。萘啶酮酸是鏈霉菌屬間接合轉移過程中常用的一種可完全抑制供體菌(大腸桿菌)生長的化學藥品，因此在選擇用于S.albulusPD-1菌株進行遺傳操作選擇標記的同時也考察了S.albulusPD-1對萘啶酮酸的敏感性，最終發(fā)現(xiàn)50 μg/mL的萘啶酮酸可抑制部分S.albulusPD-1的生長，而在25 μg/mL萘啶酮酸時S.albulusPD-1即可較好的生長，因此在接合轉移過程完成后，選定萘啶酮酸的工作濃度為25 μg/mL，可以高效地抑制供體大腸桿菌的生長而對S.albulusPD-1的生長沒有影響。

表1　S. albulus PD-1菌株對不同抗生素的抗性

2.2培養(yǎng)基類型對S.albulusPD-1接合轉移效率的影響

表2為不同培養(yǎng)基對S.albulusPD-1的接合轉移效率的影響結果。

表2　培養(yǎng)基類型對接合轉移效率的影響

由表2可知，固體培養(yǎng)基種類對S.albulusPD-1的接合轉移效率具有很大影響。使用MS培養(yǎng)基接合轉移時的效率最高，為(4.0±0.5)×10-7，而ISP-4作為接合轉移培養(yǎng)基并沒有轉化子長出。因此，選定MS培養(yǎng)基為S.albulusPD-1接合轉移時使用的培養(yǎng)基。

2.3孢子熱激處理對S.albulusPD-1接合轉移效率的影響

除了培養(yǎng)基的選擇，對受體菌孢子進行熱激處理能夠在一定程度上提高接合轉移的效率[19,21-22]。因為鏈霉菌孢子成熟后細胞壁較厚，不易與大腸桿菌發(fā)生接合轉移；但經(jīng)過熱激處理后能夠促使孢子快速萌發(fā)，進而能夠提高接合轉移的效率。根據(jù)鏈霉菌孢子常用熱激溫度，選取30～60 ℃下對孢子處理不同的時間來研究熱激處理對接合轉移效率的影響，結果見圖1。由圖1可知，在孢子進行50 ℃熱激處理10 min時接合轉移效率最佳。太高和太低的熱激溫度均不利于S.albulusPD-1接合轉移的進行，可能是由于太高的熱激溫度會對孢子造成損傷而太低的熱激溫度下孢子萌發(fā)不完全。

圖1　　　孢子熱激處理溫度對S. abulus PD-1　　　接合轉移效率的影響Fig.1　　　Heat shock treatment of spores on the trans-　　　conjugation efficiency of S. albulus PD-1

2.4其他處理條件對接合轉移效率的影響

除培養(yǎng)基種類和熱激處理條件以外，培養(yǎng)基中MgCl2的濃度和供體菌/受體菌的比例同樣對接合轉移效率有著重要的影響。因此，后續(xù)對接合轉移培養(yǎng)基中不同MgCl2的濃度(5、10、20、40、60和80 mmol/L)進行試驗，發(fā)現(xiàn)初始條件的培養(yǎng)基中含10 mmol/L MgCl2時接合轉移效率最高。同樣，改變供體菌和受體菌的比例也未進一步提高接合轉移的效率。最終以S.albulusPD-1孢子作為受體菌，50 ℃熱激處理10 min，使用含有10 mmol/L MgCl2的MS培養(yǎng)基進行接合轉移，其轉化效率最高，為(3.0±0.4)×10-6(圖2)。此外，抗生素覆蓋時間也對接合轉移效率同樣影響顯著：就本實驗而言，16～18 h覆蓋效果最佳；時間少于16 h，接合轉移不完全；時間長于18 h，由于菌絲體大量生長，工作濃度的抗生素則無法完全抑制未發(fā)生接合轉移的S.albulusPD-1生長。

圖2　　　 優(yōu)化前和優(yōu)化后S. albulus PD-1　　　接合子在平板上的生長情況Fig.2　　　Transformation efficiency of conjugational　　　transfer before optimization and 　　　after optimization

2.5pIB139質粒在S.albulusPD-1菌株中的穩(wěn)定性測試

為了檢測pIB139質粒在S.albulusPD-1菌株中的穩(wěn)定性，將轉化子接種到不含抗生素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，再轉接到新的不含抗生素的MS培養(yǎng)基中。轉接10代后，隨機挑選100個單菌落分別轉接到含有阿泊拉霉素的MS平板上，結果這些單菌落全部可以在含有阿泊拉霉素的MS平板上生長。該實驗表明pIB139質粒在S.albulusPD-1中穩(wěn)定存在，并未發(fā)生質粒丟失的情況。Hamano等[11]在此前的研究中截取S.albulusIFO14147內(nèi)源質粒pNO33的復制子，并基于此復制子構建了一系列在適用于S.albulusCR1(內(nèi)源質粒pNO33被消除的S.albulusIFO14147菌株)的復制型質粒。但是由于游離質粒的不穩(wěn)定性，在使用該質粒的過程中需要添加25 μg/mL新霉素來維持質粒的存在，若投入工業(yè)化生產(chǎn)中， 10 t的發(fā)酵罐則需要添加175 g的新霉素(按裝液量70%計算)，而按照目前的市場價格，生產(chǎn)成本將增加714元；且若后期分離不當，則會造成ε-PL產(chǎn)品的抗生素污染，將無法作為食品防腐劑應用到食品生產(chǎn)中。pIB139質粒能穩(wěn)定整合在S.albulusPD-1染色體上，因此使用pIB139質粒對S.albulusPD-1基因組進行修飾則可避免相應抗生素的使用，節(jié)約生產(chǎn)成本，更適用于工業(yè)菌株規(guī)?；a(chǎn)。

2.6pIB139在S.albulusPD-1中整合位點的確定

pIB139屬于鏈霉菌基因整合型質粒，不能單獨存在于細胞質中，而是通過整合酶和attP位點整合到鏈霉菌基因組的attB位點上。目前已發(fā)現(xiàn)多個鏈霉菌的attB位點，并且該位點多存在于染色體縮合蛋白或者匹林類似蛋白(SCO3798)中[23]。通過對S.albulusPD-1基因組序列的分析，發(fā)現(xiàn)了1個SCO3798相似蛋白(圖3(a))。為了進一步驗證此位點即為S.albulusPD-1中attB插入位點，以此位點兩翼的核苷酸序列設計引物，進行PCR，獲得了pIB139質粒的全部堿基以及部分attB序列(結果未列出)。這個實驗結果表明pIB139質粒成功地插入到了S.albulusPD-1染色體的attB位點上(圖3(b))。后續(xù)的實驗同時證明pIB139質粒的引入并未引起S.albulusPD-1菌株表型以及ε-PL生產(chǎn)能力的變化，因此pIB139質粒適用于S.albulusPD-1菌株改造。

圖3　　　pIB139插入S. albulus PD-1位點分析 Fig.3　　　Analysis of pIB139-based transconjugants of S. albulus PD-1

3結論

通過對上述幾種條件的探索，最終確定：以S.albulusPD-1孢子作為受體菌，50 ℃熱激處理10 min，使用含有10 mmol/L MgCl2的MS培養(yǎng)基進行接合轉移，且16 h后進行抗生素覆蓋，其轉化效率最高，達到(3.0±0.4)×10-6；經(jīng)過傳代實驗和PCR驗證表明pIB139質粒能夠穩(wěn)定存在于S.albulusPD-1染色體的attB位點上。在此研究中除了pIB139質粒，也曾嘗試將復制型質粒pIJ702和溫敏型質粒pKC1139導入到S.albulusPD-1中，但并未得到相對應的轉化子，猜測這些質粒的復制子不能在S.albulusPD-1中行使其功能，只能作為自殺型質粒存在，但這些質粒攜帶同源片段可以進行S.albulusPD-1特定基因的敲除工作。因此，筆者建立了相對高效的ε-PL生產(chǎn)菌株S.albulusPD-1的遺傳轉化體系，為將來ε-PL生產(chǎn)菌株在分子水平上的研究奠定了基礎。

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(責任編輯荀志金)

Genetic transformation system of aε-poly-l-lysine-producingStreptomycesalbulusstrain

SUN Zhuzhen1,2,FENG Xiaohai1,2,XU Zhaoxian1,2,CAO Changhong1,2,XU Zheng1,2,XU Hong1,2

(1. State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China;

2. College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Abstract：To study the biosynthetic mechanism of ε-Poly-l-lysine(ε-PL)in the producing strain,we developed a genetic transformation system for Streptomyces albulus PD-1,a well-known ε-PL-producing strain. Plasmid pIB139 was introduced into S. albulus PD-1 when Escherichia coli ET12567(pUZ8002)was used as a donor. After optimizing for conjugal transfer conditions,a maximal conjugation frequency of(3.0±0.4)× 10(-6) per recipient was obtained. Further test indicated that plasmid pIB139 was integrated into the attB site of S. albulus PD-1 chromosome,and the integration of plasmid pIB139 was stable after passing several generations. This inter-generic conjugal transformation system for S. albulus PD-1 will provide powerful tools to study ε-PL biosynthesis mechanism and to construct high ε-PL over-producers.

Keywords：ε-poly-l-lysine;Streptomyces albulus;genetic transformation system;pIB139

中圖分類號：Q933；S476

文獻標志碼：A

文章編號：1672-3678(2016)02-0027-06

作者簡介：孫朱貞(1990—)，女，安徽馬鞍山人，研究方向：微生物學、發(fā)酵工程；徐虹(聯(lián)系人)，教授，E-mail:xuh@njtech.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(21476112)；江蘇省自然科學基金(BK20140933)；材料化學工程國家重點實驗室自主課題(ZK201403)

收稿日期：2015-11-09

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.006