王昭君　趙志軍　孫俊松　史吉平　王紹明

摘要：分別在培養(yǎng)基中添加2 g/L ε-聚賴氨酸（ε-PL）和復合抗生素抑菌劑，結(jié)合ε-聚賴氨酸與亞甲基藍形成透明圈的現(xiàn)象初篩產(chǎn)ε-PL的菌株，根據(jù)ε-聚賴氨酸與道夫根試劑的特殊沉淀反應現(xiàn)象復篩獲得5株菌株，經(jīng)生理生化試驗和16S rDNA分析鑒定，5株菌株中包括1株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），1株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），1株鏈霉菌屬（Streptomyces sp.，未鑒定到種）菌株，1株糖多孢屬（Saccharopolyspora sp）菌株，1株白色鏈霉菌（Streptomyces albulus），其搖瓶發(fā)酵ε-聚賴氨酸產(chǎn)量分別為0.06、0.08、0.70、0.82、1.56 g/L;采用2階段法對wzj4、wzj5進行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其ε-聚賴氨酸最大產(chǎn)量分別為2.54、6.99 g/L。凝膠色譜分析表明wzj5發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸分子量大小與對照品相近，最小抑菌濃度為250 μg/mL，對大腸桿菌的抑菌效果良好。

關(guān)鍵詞：ε-聚賴氨酸;ε-PL生產(chǎn)菌株;不同類型;篩選;鑒定;發(fā)酵;性能分析

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0291-06

收稿日期：2018-05-25

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：31300048）。

作者簡介：王昭君（1991—），女，新疆奎屯人，碩士研究生，研究方向為綠洲農(nóng)業(yè)生態(tài)。E-mail：wzjshz@163.com。

通信作者：趙志軍，博士，副研究員，研究方向為代謝工程，E-mail：zhaozj@sari.ac.cn;王紹明，教授，研究方向為生態(tài)學，E-mail：westwild@vip.sina.com。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）是由25～35個L-賴氨酸單體通過α-COOH和ε-NH2脫水縮合而成的氨基酸同型聚合物，相對分子質(zhì)量通常為3 500～4 500 Du[1]。ε-PL具有廣泛的抑菌譜，并且穩(wěn)定性強，安全高效，目前我國已經(jīng)批準其作為食品防腐劑[2]，在國外更是已被廣泛應用。

近年來，我國研究人員對ε-PL產(chǎn)生菌的篩選[3]、發(fā)酵[4]、產(chǎn)物鑒定[5]、提取[6]、應用[7]等進行了大量研究。傳統(tǒng)的篩選工作通過鑒定搖瓶發(fā)酵液中的產(chǎn)物來確定所篩菌株是否能夠產(chǎn)生ε-聚賴氨酸，篩選過程費時費力，且效率極低。Nishikawa等采用一種含酸性染料polyR-478的培養(yǎng)基篩選ε-PL產(chǎn)生菌，獲得了大量ε-PL產(chǎn)生菌，包括鏈霉菌屬（Streptomyces）、北里胞菌屬（Kitasatosporia）、香柱菌屬（Epichloe）等[8];該方法大大提高了篩選效率，且可獲得不同菌種的ε-PL產(chǎn)生菌，但因為所用染料試劑的停產(chǎn)，該方法未得到普及[9]。目前，我國研究人員多用亞甲基藍平板篩選法分離篩選ε-PL產(chǎn)生菌，如黃莉等利用含K2Cr7O7和亞甲基藍的平板篩選出一株Streptomyces griseolus，其ε-PL產(chǎn)量為0.808 g/L[10]。張波用同樣的方法從四川省成都市郊區(qū)土壤中篩選獲得一株ε-PL產(chǎn)量為1.893 g/L的不吸水鏈霉菌Streptomyces ahygroscopicus SAC23[11]。

江南大學[12]、天津科技大學[13]、南京工業(yè)大學[14]等單位在ε-PL菌種篩選與發(fā)酵優(yōu)化方面做了大量的研究工作。張超等篩到一株Streptomyces sp. M-Z18，該菌的搖瓶ε-PL產(chǎn)量為0.2 g/L，其所在課題組以Streptomyces sp. M-Z18為出發(fā)菌株采用物理化學誘變、原生質(zhì)體融合、基因組重排（genome shuffling）技術(shù)等一系列方法進行ε-PL高產(chǎn)菌株選育，2007年以該菌株為出發(fā)菌株進行紫外誘變得到一株高產(chǎn)ε-PL的菌株C-18，其搖瓶ε-PL產(chǎn)量為1.23 g/L[15]。任喜東等提出了一種酸性pH值沖擊策略，先將pH值調(diào)至5.0，對pH值沖擊階段進行預適應，再調(diào)節(jié)pH值至3.0，以調(diào)控菌體代謝活力，最后調(diào)節(jié)pH值至4.0為ε-PL的積累提供最適條件，在此條件下，5 L發(fā)酵罐的發(fā)酵產(chǎn)量達54.70 g/L，不僅達到了商業(yè)生產(chǎn)要求，甚至高于日本工業(yè)生產(chǎn)用菌Streptomyces albulus stain 410的報道產(chǎn)量（48.3 g/L）[16-17]。

本研究在篩選培養(yǎng)基中添加ε-PL和復合抗生素抑菌劑，結(jié)合ε-PL與亞甲基藍的靜電作用形成透明圈的特性，篩選不同類型的ε-PL生產(chǎn)菌株，并在搖瓶及5 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，對不同類型ε-PL生產(chǎn)菌株產(chǎn)ε-PL的性能進行考察。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?樣品

2016年9月從上海市郊區(qū)采集土樣，除去表層土，取距表層5～10 cm土壤100 g，裝入已滅菌的牛皮紙袋中，于室溫下自然風干3～10 d，碾碎過篩后，在50 ℃下烘1 h，取1 g土樣加入10 mL滅過菌的0.005 mol/L磷酸緩沖液[pH值為7.0，其中含6.00%蛋白胨和0.05%十二烷基硫酸鈉（SDS）]中，50 ℃下振蕩10 min[18]。

1.1.2?試劑

ε-PL對照品購自鄭州拜納佛生物工程股份有限公司;酶及引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司;DNA提取試劑盒購買自碧云天生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3?儀器

PCR儀（BIO-RAD），高壓蒸汽滅菌鍋（SANYO），電泳儀（BIO-RAD），SBA-40D生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所），5 L發(fā)酵罐（Sartorius Stedim Biotech GmbH），高效液相色譜儀（島津公司）等。

1.1.4?培養(yǎng)基及溶液

分離培養(yǎng)基（SG培養(yǎng)基）：甘油1%，酵母膏0.01%，KH2PO4 0.025%，NaH2PO4·2H2O 0.088%，MgSO4·7H2O 0.025%，（NH4）2SO4 0.066%，ZnSO4·7H2O 0.005%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，瓊脂1.5%，pH值7.5。115 ℃，滅菌15 min。

鏈霉菌篩選（ISP2）培養(yǎng)基：酵母浸膏0.4%，麥芽浸膏1%，葡萄糖0.4%，瓊脂1.5%，微量鹽溶液1 mL，pH值7.2。115 ℃，滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基（M3G）：葡萄糖5.000 0%，酵母粉0.500 0%，（NH4）2SO4 1.000 0%，K2HPO4·3H2O0.104 8%，KH2PO4 0.136 0%，10倍濃縮鹽溶液（MgSO4·7H2O 0.0500%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0030%，ZnSO4·7H2O0.004%）100 mL，pH值6.8。葡萄糖單獨滅菌。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂2 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。121 ℃，滅菌20 min。

微量鹽溶液：FeSO4·7H2O 0.1 g，MnCl2·4H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，加水定容至1 L。

復合抗生素抑菌劑：將10 mg放線菌酮、10 mg制霉菌素、20 mg萘啶酮酸鈉分別平鋪在三角瓶中，覆蓋乙醚，使乙醚沒過抗生素粉末，用培養(yǎng)基封口膜封口放入通風櫥中待乙醚揮發(fā)干后，轉(zhuǎn)至超凈臺上，加入定量無菌水，于45 ℃下水浴溶解后過0.2 μm濾膜。制霉菌素在pH值為7.2時溶解不完全，需用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至11.0，完全溶解后用鹽酸中和滴定，使pH值回復至7.2。

0.1 mol/L磷酸緩沖液：稱取35.820 g Na2HPO4·12H2O，15.605 g NaH2PO4·2H2O，分別定容至1 L，相互滴定至pH值為6.6。

道夫根試劑（DR試劑）：參照文獻[19]配制。

1.2?方法

1.2.1?產(chǎn)ε-PL菌株初篩

1.2.1.1?ε-PL耐受菌株的篩選

首先對土樣進行預處理，具體為大致去除土樣中的雜物，風干后碾碎過篩，烘干。取1 g 預處理過的土樣加入10 mL無菌水中，30 ℃、100 r/min振蕩15 min后靜置30 min，吸取上清液稀釋適當倍數(shù)后涂布于含2 g/L ε-PL的LB分離培養(yǎng)基平板上。

1.2.1.2?復合抗生素抑菌劑平板篩選

據(jù)文獻[20]報道，產(chǎn)ε-PL的菌種大多屬于北里胞菌屬、鏈霉菌屬等，其中鏈霉菌屬的菌種產(chǎn)量普遍較高。萘啶酮酸對細菌的抑制效果較好，制霉菌素能夠抑制真菌，放線菌酮能夠抑制霉菌和酵母等，因此添加抑制細菌、霉菌、酵母和真菌的抗生素于ISP2培養(yǎng)基平板上進行放線菌株的篩選。在已滅菌的ISP2平板中加入復合抗生素抑菌劑，倒板涂布，篩選產(chǎn)ε-PL的放線菌株。

1.2.1.3?透明圈篩選

挑取ε-PL耐受平板和復合抗生素篩選平板上的菌落，接種至含0.003%亞甲基藍的SG培養(yǎng)基平板上30 ℃培養(yǎng)7 d[8]。亞甲基藍是一種堿性染料，菌落分泌的帶正電荷的物質(zhì)（ε-PL）會由于靜電作用排斥亞甲基藍，進而形成透明圈，且?guī)д姾晌镔|(zhì)的濃度越高，透明圈越大[21]。挑取有明顯透明圈的單菌落進行保存，用于復篩。

1.2.2?復篩

將初篩得到的細菌接種至盛有30 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在30 ℃、200 r/min下發(fā)酵84 h;轉(zhuǎn)接到盛有30 mL M3G培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在30 ℃下發(fā)酵96 h，收集發(fā)酵液在7 000 r/min條件下離心10 min，用DR試劑檢測發(fā)酵產(chǎn)物是否存在ε-PL。該反應很靈敏，可以有效檢測出發(fā)酵液中的ε-PL[22]。

1.2.3?生理生化鑒定

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第9版）、《放線菌分類基礎(chǔ)》及《鏈霉菌鑒定手冊》對復篩得到的菌株進行初步鑒定。

1.2.4?16S rDNA鑒定

取搖瓶培養(yǎng)7 d后的菌液，采用基因組提取試劑盒提取基因組DNA，并采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將得到的16S rDNA序列與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬的序列進行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5?高效液相色譜產(chǎn)量測定

高效液相色譜（HPLC）采用國標法（GB/T 5009.124）進行：C18柱，流動相為8%乙腈，流速為0.4 mL/min，檢測波長為215 nm，進樣體積 為20 μL，溫度為40 ℃。

1.2.6?菌株生物量測定

采用干質(zhì)量法測定菌株生物量（DCW）。每隔12 h取5 mL發(fā)酵液樣品，在7 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，沉淀（即菌絲體）經(jīng)蒸餾水洗滌3次后放入干燥清潔且已知質(zhì)量的培養(yǎng)皿中，于60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量得菌體干質(zhì)量。重復測定3次，取平均值。

1.2.7?發(fā)酵產(chǎn)物的分子量分析

使用凝膠滲透色譜確定發(fā)酵液中ε-PL分子量大小。參考色譜條件：凝膠柱為TSK-gelG2000SWXL;檢測溫度為35 ℃，檢測波長為210 nm，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL;流動相，乙腈 ∶水=20 ∶80（體積比），含三氟乙酸1 mL/L[15，23-24]。

1.2.8?最小抑制濃度的確定

以鄭州拜納佛生物工程股份有限公司生產(chǎn)的ε-PL為對照，從wzj5發(fā)酵液提取得到的ε-PL固體粉末作為試驗樣品，按0～250 μg/mL不同的9個濃度梯度添加到培養(yǎng)基中，將稀釋了適當倍數(shù)的大腸桿菌BW25113菌液涂在平板上，驗證ε-PL的抑菌效果。

2?結(jié)果與分析

2.1?產(chǎn)ε-PL菌株的初篩

2.1.1?ε-PL耐受菌株和產(chǎn)ε-PL菌株篩選

以往的研究經(jīng)驗表明，目標物的生產(chǎn)菌株通常對目標物具有一定的耐受性，依據(jù)這一特性，本研究嘗試通過篩選ε-PL的耐受菌株來獲得產(chǎn)ε-PL的菌株。將從ε-PL耐受平板上篩選出的菌落接種至含0.003%亞甲基藍的SG平板上，篩選出wzj1、wzj2菌株。圖1為通過該原理篩選出的2株在含亞甲基藍的SG培養(yǎng)基上形成透明圈的菌株wzj1、wzj2，根據(jù)菌落長出的時間與其濕潤、黏稠、易挑起的形態(tài)特征初步判斷可能是細菌。

2.1.2?復合抗生素抑菌劑平板篩選

將從復合抗生素抑菌劑平板上篩選出的菌落接種至含0.003%亞甲基藍的SG平板上，篩選出wzj3、wzj4、wzj5等3株透明圈較大的菌株（圖2），其中wzj5菌株形成的透明圈明顯大于其他2株菌株。從形態(tài)特征上看，這3株菌株不同于wzj1、wzj2菌株，其菌落干燥，質(zhì)地緊密而不蔓延，不易挑起，初步判斷可能是真菌或者放線菌。

2.2?產(chǎn)ε-PL菌株的復篩

據(jù)文獻報道，ε-PL在酸性（pH值為2～5）條件下能夠與DR試劑發(fā)生特異性反應生成橘紅色沉淀（BiI3）（ε-PL·HI）[25]。本試驗結(jié)果（圖3）表明，wzj1、wzj2、wzj3、wzj4、wzj5菌株的發(fā)酵液均能夠與DR試劑發(fā)生反應生成橘紅色沉淀。其中，wzj1、wzj2菌株的發(fā)酵液與DR試劑反應產(chǎn)生的沉淀偏少，而wzj3、wzj4、wzj5菌株的發(fā)酵液與DR試劑反應產(chǎn)生的沉淀較多。

2.3?ε-PL產(chǎn)生菌的鑒定

2.3.1?生理生化鑒定

傳統(tǒng)微生物分類鑒定的主要依據(jù)是微生物的形態(tài)學特征、生理生化反應特征等，可初步判定其種屬。5株菌株在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖4-a，它們在顯微鏡下的個體形態(tài)如圖4-b所示，形態(tài)特征描述與生理生化試驗結(jié)果見表1。根據(jù)試驗結(jié)果推測，菌株wzj1、wzj2歸屬于芽孢桿菌屬;wzj3、wzj4、wzj5歸屬于鏈霉菌屬。

2.3.2?16S rDNA鑒定

從Gen Bank數(shù)據(jù)庫中通過Blast查找與5株菌株相似的16S rDNA序列，并通過MEGA軟件與菌株wzj1、wzj2、wzj3、wzj4、wzj5的16S rDNA序列進行比對，構(gòu)建以16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖5）表明，菌株wzj1為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），wzj2為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），wzj3屬于鏈霉菌（Streptomyces sp，未鑒定到種），wzj4為糖多孢菌（Saccharopolyspora sp），wzj5為白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）。

2.4?ε-PL產(chǎn)量測定

2.4.1?搖瓶發(fā)酵

圖6顯示了5株菌株在搖瓶發(fā)酵過程中ε-PL濃度的變化，可以看出，wzj1、wzj2均在發(fā)酵42 h時達到其最高ε-PL產(chǎn)量，wzj1產(chǎn)量為0.06 g/L，wzj2產(chǎn)量為0.08 g/L，在發(fā)酵42 h后，ε-PL濃度緩慢遞減;wzj3在搖瓶發(fā)酵108 h時，ε-PL濃度最高，為0.70 g/L;wzj4在發(fā)酵84～108 h時快速積累ε-PL，在108 h達到0.82 g/L;wzj5發(fā)酵產(chǎn)生的ε-PL含量明顯高于其他4株菌株，且在搖瓶發(fā)酵96 h時ε-PL產(chǎn)量達到最大值，為1.56 g/L。

2.4.2?發(fā)酵罐發(fā)酵

選取搖瓶發(fā)酵中ε-PL產(chǎn)量較高的wzj4菌株和wzj5菌株進行發(fā)酵罐發(fā)酵。發(fā)酵調(diào)控采取2階段法：第1階段為菌體生長階段，初始pH值為6.8;第2階段為ε-PL合成階段，pH值維持4.0不變。

圖7-a是wzj4菌株發(fā)酵罐發(fā)酵過程的參數(shù)變化情況，可以看出，第1階段（0～96 h）菌體濃度與條件呈負相關(guān)關(guān)系，菌體濃度大幅度增長，同時菌體吸收葡萄糖代謝產(chǎn)酸導致pH值不斷下降。第2階段（96～168 h），維持pH值為4.0。此時在酸性條件下菌體生長受到抑制，菌體濃度逐漸趨于穩(wěn)定，胞內(nèi)積累的ATP不再主要是用于菌體生長，而是被用于ε-PL 合成酶功能的發(fā)揮，有利于ε-PL的積累。從132 h開始，ε-PL產(chǎn)量增長速度變慢，在156 h時ε-PL產(chǎn)量達2.54 g/L。

圖7-b給出了wzj5在發(fā)酵過程中各參數(shù)的變化趨勢，其中0～60 h為菌體的生長階段，在產(chǎn)ε-PL的第2階段（60～168 h）中，在發(fā)酵96～120 h時ε-PL積累速率較高，并在發(fā)酵120 h時達到最大積累量6.99 g/L。

2.5?平均分子量大小的確定

參照韓岱等的ε-PL提取方法[26]，對發(fā)酵液中的ε-PL進行提取。以鄭州拜納佛生物工程股份有限公司的ε-PL作為對照，對從wzj5菌株發(fā)酵液中提取的ε-PL樣品進行凝膠滲透色譜比較分析。結(jié)果（圖8）表明，對照在保留時間 為6.9 min 時有最大峰，且樣品在此處也存在最大峰，因此確定發(fā)酵液中存在與對照分子量大小相近的ε-PL。

2.6?最小抑菌濃度

由圖9可知，從wzj5發(fā)酵液中提取的ε-PL具備與對照品基本相近的抑菌能力，最小抑菌濃度為0.25 mg/mL。

3?結(jié)論與討論

ε-PL是一種新型的天然高效生物防腐劑，其菌種選育一直受到研究者的廣泛關(guān)注。本研究采用不同的方法篩選獲得5株不同類型的產(chǎn)ε-PL菌株，其中2株芽孢桿菌分別是Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus cereus，ε-PL產(chǎn)量分別是0.06 g/L和0.08 g/L。前期有文獻報道，芽孢桿菌產(chǎn)ε-PL的搖瓶產(chǎn)量為0.036～0.083 g/L[5，27]，且已有研究者對產(chǎn)ε-PL芽孢桿菌的發(fā)酵條件作了初步研究[28]。芽孢桿菌具有發(fā)酵周期短，易培養(yǎng)的優(yōu)點，對于ε-PL生產(chǎn)來說，仍具有一定的開發(fā)潛力。此外，本研究還篩選到一株糖多孢菌屬的菌株wzj4，其搖瓶最大產(chǎn)量為0.82 g/L，發(fā)酵罐發(fā)酵最大產(chǎn)量為2.54 g/L，該結(jié)果為本研究首次報道。

ε-PL產(chǎn)生菌主要集中在鏈霉菌屬[5，29]，包括灰橙鏈霉菌[30]、禾栗鏈霉菌[31]、稠李鏈霉菌[32]等。本研究篩選獲得2株鏈霉菌屬菌株，其中wzj3的搖瓶最大產(chǎn)量為0.70 g/L，wzj5的搖瓶最大產(chǎn)量為1.56 g/L，其發(fā)酵罐發(fā)酵最大產(chǎn)量為6.99 g/L，具有較好的產(chǎn)ε-PL潛力。菌株wzj5的ε-PL產(chǎn)量較高，因此提取其發(fā)酵液中ε-PL進行凝膠色譜分析，結(jié)果表明，ε-PL的分子量大小與鄭州拜納佛生物工程股份有限公司生產(chǎn)的ε-PL對照品一致，最小抑菌濃度為250 μg/mL。

ε-PL作為一種新型高效安全的天然防腐保鮮劑，具有廣闊的應用前景，但與其他生物防腐劑相比，目前ε-PL的生產(chǎn)成本和市場價格仍然偏高，后期可采用分子生物學和發(fā)酵調(diào)控優(yōu)化等手段，進一步提高ε-PL的產(chǎn)量和得率;另外，ε-PL是聚合度在25～30范圍內(nèi)的混合物，其提取與分離工藝比較復雜，仍有較大的技術(shù)提升空間。本研究聚焦在產(chǎn)聚賴氨酸菌株的篩選上，并在發(fā)酵、產(chǎn)物提取分離和產(chǎn)物性能檢測方面進行了初步研究，可為后期進一步的菌株改良、發(fā)酵條件優(yōu)化、提取工藝優(yōu)化等研究奠定實踐基礎(chǔ)。

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