張　超，王　靜，唐　波，李奇建

(1. 山東建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南250101；2. 濟(jì)南太和生物工程有限公司，

山東濟(jì)南250013； 3. 江蘇聯(lián)海生物科技有限公司，江蘇海門226133)

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同步糖化發(fā)酵菊芋生產(chǎn)酒精

張超1，王靜2，唐波3，李奇建2

(1. 山東建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南250101；2. 濟(jì)南太和生物工程有限公司，

山東濟(jì)南250013； 3. 江蘇聯(lián)海生物科技有限公司，江蘇海門226133)

摘要：以黑曲霉A-15 形成的菌絲球作為載體對(duì)釀酒酵母C-15進(jìn)行固定化，研究各種因素對(duì)黑曲霉A-15菌絲球吸附率的影響。結(jié)果表明：在40 ℃、80 r/min、菌種個(gè)數(shù)混合比例為1∶ 10時(shí)，菌絲球?qū)湍傅奈娇蛇_(dá)到66.9%；以菊粉為底物，利用混合菌絲球進(jìn)行同步糖化與發(fā)酵，30 ℃發(fā)酵48 h，發(fā)酵醪酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12.8%，并且混合菌絲球可以耐受19%的酒精。

關(guān)鍵詞：菌絲球；載體發(fā)酵；乙醇；同步糖化發(fā)酵

燃料乙醇最早采用玉米為原料發(fā)酵制成，但這一過程使用玉米量較大，對(duì)國家糧食安全構(gòu)成了威脅[1-2]。菊芋(俗稱洋姜、姜不辣、鬼子姜)主要成分是菊粉，是最簡(jiǎn)單的一類果聚糖，含糖量為其干質(zhì)量的 60%～70%。 菊芋水解比淀粉質(zhì)原料容易，不需要高溫液化，直接用菊粉酶水解即可獲得可發(fā)酵性糖，工藝流程簡(jiǎn)單，能耗低，與目前人們普遍關(guān)注的以農(nóng)作物秸稈為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)相比，更易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。菊芋耐貧瘠、耐寒、耐旱、種植簡(jiǎn)易、產(chǎn)量高，可在沙漠、鹽堿地或?yàn)┩康胤N植[3-5]，是一種極具潛力的非糧乙醇發(fā)酵原料[6-8]。

以菊芋為原料制備乙醇的生物發(fā)酵所用菌種一般為酵母菌，因?yàn)榫沼蟛荒苤苯永?，需要先糖化，所以發(fā)酵方法有同步糖化發(fā)酵和先糖化后發(fā)酵。同步糖化發(fā)酵可以使發(fā)酵醪中水解下來的可發(fā)酵性糖被及時(shí)發(fā)酵為乙醇，在過程中不積累，防止糖積累而抑制菊粉酶分泌，避免底物抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，可以有效防止雜菌污染，提高乙醇收率，但是目前國內(nèi)以菊芋為原料酒精發(fā)酵技術(shù)水平低，菊糖利用率不高，損失較大[9-10]。另外，菌種游離存在菌種難以回收的問題，造成生產(chǎn)成本過高、環(huán)境污染，而固定化細(xì)胞技術(shù)能很好地解決這一問題。在乙醇制備中，將酵母固定化會(huì)大大提高酶促反應(yīng)效率，因此具有很好的應(yīng)用前景。但是目前公開的酵母固定化技術(shù)成本高、固定技術(shù)單一[11-12]。此外，提高酵母菌的酒精耐受力、解除高濃度酒精的抑制作用也是人們的研究熱點(diǎn)[13-14]。

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，筆者提出了一種載體發(fā)酵技術(shù)。在采用產(chǎn)菊粉酶的黑曲霉和釀酒酵母作為菌種同步糖化發(fā)酵制備乙醇的基礎(chǔ)上，根據(jù)菊芋需要先糖化再發(fā)酵的特性，將黑曲霉和釀酒酵母進(jìn)行混合培養(yǎng)，形成了黑曲霉吸附釀酒酵母的菌種混合體，該菌種混合體將釀酒酵母吸附在黑曲霉中，使釀酒酵母固定，并進(jìn)行同步糖化發(fā)酵制備乙醇，以期簡(jiǎn)化工藝，提高酵母細(xì)胞對(duì)于乙醇的耐受性和乙醇產(chǎn)率。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株及材料

黑曲霉A-15(CMCC98003)保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室；釀酒酵母C-15，安琪酵母股份有限公司。

酵母膏，上海生化技術(shù)公司；蛋白胨、NaCl，中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海試劑公司；pHS-3型酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；721型可見光分光光度計(jì)，北京光學(xué)儀器廠。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20;自然pH。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：菊芋粉25，(NH4)2SO45，蛋白胨10 ，KH2PO46，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001;pH 5，0.1 MPa滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：菊粉200，蛋白胨5，酵母膏5，(NH4)2SO42，KH2PO42，玉米漿5;pH 5.0，0.1 MPa滅菌15 min。

YPD固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、瓊脂20;自然pH。

1.2方法

1.2.1菌體培養(yǎng)

將釀酒酵母菌種按照5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,在30 ℃、100 r/min的搖床中培養(yǎng)30 h，發(fā)酵液在5 000 r/min離心5 min，收集酵母細(xì)胞。

將黑曲霉用無菌水配成孢子懸浮液，按照4%的接種量接種到裝有100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30 ℃、40 r/min的搖床中培養(yǎng)30 h，至形成菌絲球，過濾收集菌絲球。

1.2.2吸附試驗(yàn)

用100 mL蒸餾水懸浮酵母細(xì)胞，裝入250 mL三角瓶中，每瓶加入5 g(濕質(zhì)量)的菌絲球，在搖床上不同溫度、轉(zhuǎn)速和不同菌種的混合比例下吸附2 h，然后過濾，用分光光度計(jì)測(cè)定濾液中剩余的菌濃度并計(jì)算吸附率，見式(1)。

吸附率(R)=(吸附前菌液OD600值-吸附后

(1)

1.2.3發(fā)酵試驗(yàn)

1)普通同步糖化按照菌體培養(yǎng)方法收集酵母細(xì)胞和黑曲霉孢子懸浮液，將兩者按一定比例混合，混合菌過濾后按照10%的接種量倒入含有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中， 在30 ℃、40 r/min的搖床中進(jìn)行同步糖化發(fā)酵48 h生產(chǎn)乙醇。

2)吸附同步糖化將酵母細(xì)胞和黑曲霉按照不同的菌種個(gè)數(shù)比混合后，在搖床上恒定溫度、恒定轉(zhuǎn)速下吸附2 h，制得混合菌絲球，過濾后按照10%的接種量倒入含有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在30 ℃、40 r/min的搖床中進(jìn)行同步糖化發(fā)酵48 h生產(chǎn)乙醇。

1.2.4混合菌絲球回用技術(shù)的穩(wěn)定性

當(dāng)一次發(fā)酵結(jié)束時(shí)，將發(fā)酵液在1 000 r/min無菌離心 15 min 后傾出上清液，菌體用無菌生理鹽水洗滌后離心，全部轉(zhuǎn)接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、40 r/min的搖床中進(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.5混合菌絲球酒精耐受能力檢測(cè)

向已經(jīng)滅菌的YPD固體培養(yǎng)基中加入不同體積的無水酒精，調(diào)整體積分?jǐn)?shù)分別為12%、14%、16%、18%、19%和20%，將初篩的菌株分別接種至不同酒精體積分?jǐn)?shù)的平板上，標(biāo)記靜置10 min后，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h。

1.2.6分析方法

酵母菌計(jì)數(shù)：使用血球計(jì)數(shù)板。

霉菌計(jì)數(shù)：參照細(xì)菌總數(shù)菌落計(jì)數(shù)方法。

酒精濃度的測(cè)定[15-16]：離心發(fā)酵醪，除去細(xì)胞，取 100 mL 上清液，加入100 mL蒸餾水后蒸餾出100 mL冷凝液，測(cè)量餾出液酒精濃度。

還原糖的檢測(cè)：采用DNS法，用果糖作標(biāo)樣繪制DNS顯色的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總糖含量測(cè)定：取1 mL待測(cè)溶液，加入50 mL體積分?jǐn)?shù) 2.8%的H2SO4溶液，80 ℃水浴酸解1 h。冷卻至室溫，用 2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH至中性，并定容至 100 mL。采用DNS 法測(cè)定其中還原糖濃度，將測(cè)定出的數(shù)值放大100 倍即為總糖濃度。

菊粉酶酶活的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]的方法測(cè)定。其中，酶活力的定義為在pH5.4、溫度55 ℃的條件下，每分鐘水解底物生成1 μmol還原糖所需的最少酶量為一個(gè)酶活力單位，U/mL。

酶活的計(jì)算，見式(2)。

(2)

式中：180—葡萄糖的相對(duì)分子質(zhì)量；10—反應(yīng)時(shí)間(min)；1 000—單位換算系數(shù)。

乙醇得率的計(jì)算，見式(3)。

(3)

化學(xué)需氧量(COD)的測(cè)定采用重鉻酸鉀法。

2結(jié)果與討論

2.1溫度對(duì)吸附率的影響

選擇溫度作為變化參數(shù)，將5 g(濕質(zhì)量)的菌絲球加到100 mL酵母菌菌懸液中，分別在不同的溫度下(25、30、35、40、45和50 ℃)振蕩(100 r/min)吸附2 h，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，在40 ℃時(shí)，菌絲球?qū)湍妇奈娇蛇_(dá)到62.3%以上，故選擇40 ℃作為菌絲球的吸附溫度。

圖1　　　溫度對(duì)菌絲球吸附酵母菌的影響Fig.1　　　Effect of temperature on the adsorption　　　ratio of yeast

2.2轉(zhuǎn)速對(duì)吸附率的影響

選擇轉(zhuǎn)速作為變化參數(shù)，將5 g(濕質(zhì)量)的菌絲球加到100 mL的酵母菌菌懸液中，分別在不同的轉(zhuǎn)速下(40、60、80、100和120 r/min)振蕩吸附2 h，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，在轉(zhuǎn)速為80 r/min時(shí)，菌絲球?qū)湍傅奈娇蛇_(dá)到65.1%，故在實(shí)驗(yàn)中選擇80 r/min作為菌絲球的吸附轉(zhuǎn)速。

圖2　　　轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲球吸附酵母菌的影響Fig.2　　　Effect of rotation speed on the　　　adsorption ratio of yeast

2.3不同的菌種混合比例對(duì)發(fā)酵效果的影響

按照黑曲霉和釀酒酵母的菌種個(gè)數(shù)比分別為1∶ 1、1∶ 3、1∶ 6、1∶ 10、1∶ 12進(jìn)行混合，最終吸附率如圖3所示。

圖3　　　混合比例對(duì)菌絲球吸附酵母菌的影響Fig.3　　　Effects of mixed proportion on the adsorption　　　ratio of yeast

由圖3可知，混合菌絲球的形成對(duì)兩種菌個(gè)數(shù)的比例有要求，混合比例過低或過高均會(huì)影響到混合菌絲球的吸附效果。由圖3可見，菌種之間最佳混合比例為1∶ 10，菌絲球?qū)湍傅奈娇蛇_(dá)到66.9%。

2.4不同發(fā)酵方式對(duì)發(fā)酵效果的影響

不同發(fā)酵方式對(duì)發(fā)酵效果的影響如表1所示。由表1可知：吸附后形成混合菌絲球的發(fā)酵方式比傳統(tǒng)的同步糖化發(fā)酵方式具有更高的乙醇濃度和更低的殘?zhí)菨舛龋徊⑶?，廢水COD的測(cè)定表明發(fā)酵液酒精精餾后產(chǎn)生廢糟液的COD從現(xiàn)有酒精發(fā)酵工藝的54 612 mg/L降低到了27 641 mg/L，有利于實(shí)現(xiàn)污染物源頭減廢。

表1　不同發(fā)酵方式的比較

2.5混合菌絲球回用技術(shù)的穩(wěn)定性

考察混合菌絲球回用技術(shù)的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。由圖4可看出，當(dāng)混合菌絲球回用至第10次時(shí)，酒精產(chǎn)量仍然穩(wěn)定在較高的水平，說明該技術(shù)使用壽命長(zhǎng)且能反復(fù)使用，操作方便粗放，成本低廉，具有很好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。

圖4　　　回用細(xì)胞次數(shù)對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.4　　　Effect of recycle times on the fermentation results

2.6混合菌絲球酒精耐受能力檢測(cè)

Hayashida等[16]研究發(fā)現(xiàn)：酵母菌對(duì)酒精的耐受能力不僅僅是由于酵母細(xì)胞自身對(duì)不同水平的酒精耐受的內(nèi)在能力，而且與酵母原生質(zhì)膜的脂類組成及功能、發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)狀況、環(huán)境參數(shù)、碳水化合物底物補(bǔ)充方式等因素有密切關(guān)系。臨界酒精濃度導(dǎo)致質(zhì)膜磷脂裂解，如果菌株質(zhì)膜本身或發(fā)酵時(shí)具備相當(dāng)營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境條件適宜等，酵母就對(duì)酒精毒性有所適應(yīng)和抵抗，特別是溫度尤為明顯。隨著溫度的不斷提高，酵母質(zhì)膜的磷脂量很快降低，以維持質(zhì)膜的流動(dòng)性和維持細(xì)胞活性。由于黑曲霉菌絲體中富含有脂蛋白，這種物質(zhì)已經(jīng)被證明可以改善酵母原生質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)，從而顯著提高酵母的發(fā)酵活力和耐酒精能力。筆者采用黑曲霉結(jié)合釀酒酵母的發(fā)酵方式，可以顯著提高釀酒酵母的酒精耐受能力，結(jié)果如表2所示。

表2　混合菌絲球的酒精耐受性

注：“+++”表示菌株生長(zhǎng)良好；“++”表示菌株能生長(zhǎng)；“+”表示菌株生長(zhǎng)較困難；“-”表示菌株不能生長(zhǎng)。

由表2可知，隨著酒精體積分?jǐn)?shù)的增大，酵母菌和黑曲霉的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，但如果利用載體發(fā)酵技術(shù)，其制備的混合菌絲球?qū)凭哪褪苣芰訌?qiáng)，可耐受19%的酒精。

3結(jié)論

筆者將同步糖化發(fā)酵工藝和微生物固定化技術(shù)進(jìn)行了結(jié)合，以黑曲霉A-15 形成的菌絲球作為載體對(duì)釀酒酵母C-15進(jìn)行固定化，研究各種因素對(duì)黑曲霉A-15菌絲球吸附率的影響。結(jié)果表明：在40 ℃、80 r/min、菌種個(gè)數(shù)混合比例為1∶ 10時(shí)，菌絲球?qū)湍傅奈娇蛇_(dá)到66.9%；以菊粉為底物，利用混合菌絲球進(jìn)行同步糖化與發(fā)酵，30 ℃發(fā)酵48 h，發(fā)酵醪酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12.8%，并且混合菌絲球可以耐受19%的酒精。這一工藝思路具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)載體發(fā)酵技術(shù)邊產(chǎn)酶邊糖化，使發(fā)酵醪中水解下來的可發(fā)酵性糖被及時(shí)發(fā)酵為乙醇，在過程中不積累，防止糖積累而抑制菊粉酶分泌，避免底物抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，可以有效防止雜菌污染，提高乙醇收率。2)本技術(shù)采用菌絲球作為固定化手段，降低了固定化成本。3)本研究利用黑曲霉對(duì)釀酒酵母實(shí)現(xiàn)了固定化，不用額外的載體，節(jié)約了細(xì)胞固定化成本，釀酒酵母從發(fā)酵系統(tǒng)中容易回收，使用壽命長(zhǎng)且能反復(fù)使用，操作方便粗放，成本低廉，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。4)由于將釀酒酵母包裹在黑曲霉中形成菌絲球，黑曲霉菌絲體富含能提高酵母活力和耐酒精能力的脂蛋白，使固定化后釀酒酵母細(xì)胞所處的微環(huán)境改變，釀酒酵母細(xì)胞對(duì)于乙醇的耐受性增強(qiáng)。5)利用菊芋作為乙醇發(fā)酵底物，具有更強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)性。菊芋與目前國內(nèi)外普遍關(guān)注的以農(nóng)作物秸稈為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)原料和常規(guī)的淀粉質(zhì)原料相比，既不需要技術(shù)難度大、糖分損耗高的預(yù)處理技術(shù)，也不需要成本昂貴的酶制劑。由于菊粉的聚合度低，菊芋原料的水解比淀粉質(zhì)原料還容易，不需要高溫液化，同步菊粉酶水解就可以獲得可發(fā)酵性糖，工藝流程簡(jiǎn)單，能耗低。由此可見，菊芋不論是農(nóng)學(xué)形狀，還是加工轉(zhuǎn)化特征，都是替代糧食類淀粉質(zhì)原料的理想選擇。

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(責(zé)任編輯管珺)

Production of ethanol from Jerusalem artichoke flour by simultaneoussaccharification and fermentation

ZHANG Chao1， WANG Jing2，TANG Bo3，LI Qijian2

(1. School of Municipal and Environmental Engineering,Shandong Jianzhu University,Jinan 250101,China;2. Jinan Taihe Bioengineering Co. Ltd.,Jinan 250013,China;3. Jiangsu Lianhai Biological Technology Co. Ltd.,Haimen 226133,China)

Abstract：Mycelial pellets formed by Aspergillus niger A-15 were used to immobilize the alcohol producing yeast Saccharomyces cerevisiae C-15. The operated factors, such as agitation speed, temperature and mixed proportion of strains were studied. The optimal adsorption 66.9% was obtained when speed was 80 r/min, temperature was 40 ℃ and mixed proportion was 1∶ 10. With Jerusalem artichoke flour as substrate,12.8% (V/V) of ethanol was produced within 48 h of fermentation by simultaneous saccharification and fermentation using mycelial pellets at 30 ℃. And mycelial pellets could tolerate 19%(volume fraction) alcohol.

Keywords：mycelial pellet；carrier fermentation；alcohol;simultaneous saccharification and fermentation

中圖分類號(hào)：X172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2016)02-0012-05

作者簡(jiǎn)介：張超(1978—)，男，山東濟(jì)南人，講師，研究方向：發(fā)酵工學(xué)，E-mail:zhangmeili8292@sina.com

基金項(xiàng)目：山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(M2012-14)；濟(jì)南市引進(jìn)海內(nèi)外高層次人才創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(2011044)；山東省住房城鄉(xiāng)建設(shè)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目計(jì)劃(KY007)

收稿日期：2015-09-25

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.003