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重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸

2016-04-26 02:19徐友強(qiáng)馬玉岳姜增妍裴疆森
生物加工過程 2016年2期
關(guān)鍵詞:脫羧酶丙氨酸天冬氨酸

徐友強(qiáng),馬玉岳,姚 粟,姜增妍,張 奇,張 露,裴疆森,程 池

(1. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京100015;

2. 山東省富馬酸生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心,山東煙臺265709)

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重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸

徐友強(qiáng)1,馬玉岳2,姚粟1,姜增妍2,張奇1,張露1,裴疆森1,程池1

(1. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京100015;

2. 山東省富馬酸生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心,山東煙臺265709)

摘要:通過克隆來源于睪丸酮叢毛單胞菌的L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因,在一株具有L-天冬氨酸酶生產(chǎn)能力的大腸埃希氏菌CICC 11022S中異源表達(dá),構(gòu)建轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸的重組工程菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn):重組工程菌9 h轉(zhuǎn)化富馬酸產(chǎn)生112.7 g/L的L-丙氨酸,生產(chǎn)速率12.5 g/(L·h),轉(zhuǎn)化率93.8%。富馬酸價(jià)格較低,有效降低L-丙氨酸生產(chǎn)的原料成本。通過構(gòu)建重組工程菌,以富馬酸為底物,高效生產(chǎn)L-丙氨酸,結(jié)果表明該方法具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞:L-丙氨酸;L-天冬氨酸酶;L-天冬氨酸-β-脫羧酶;重組工程菌

L-丙氨酸是一種具有重要價(jià)值的氨基酸,在醫(yī)藥和食品行業(yè)應(yīng)用廣泛。L-丙氨酸甜味柔和,能與谷氨酸鈉制成混合調(diào)味品,可調(diào)制并明顯改善食品風(fēng)味,而不破壞食物原有的風(fēng)格[1];是合成甜味劑阿力甜的主要原料,阿力甜的甜度是蔗糖的2 000倍,目前已在多個(gè)國家和地區(qū)獲準(zhǔn)使用[2-3];是合成維生素B6和L-氨基丙醇(鹽酸左氧氟沙星合成前體)的重要中間體,也是營養(yǎng)劑補(bǔ)糖氨基酸營養(yǎng)輸液的組成成分之一[4-6]。最近,有研究利用L-丙氨酸合成N-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-alanine,用于檢測牛奶中的抗生素氧氟沙星(ofloxacin),極大提高了檢測的靈敏度[7];還有研究將L-丙氨酸與電子自旋共振(electron spin resonance,ESR)聯(lián)合用于癌癥放療劑量的評估,效果顯著[8]。

L-丙氨酸生產(chǎn)技術(shù)包括化學(xué)合成法、蛋白水解提取法和微生物轉(zhuǎn)化法。其中,微生物轉(zhuǎn)化法是現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的L-丙氨酸生產(chǎn)方法。徐虹等[9]選育具有高L-天冬氨酸-β-脫羧酶活力的假單胞菌,以L-天冬氨酸為底物,采用游離細(xì)胞法生產(chǎn)L-丙氨酸,每升培養(yǎng)液可轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸2.0 kg。現(xiàn)有L-丙氨酸生產(chǎn)工藝以L-天冬氨酸作為原料,L-天冬氨酸價(jià)格較高,而且轉(zhuǎn)化過程脫去羧基,造成了碳流失,從而顯著增加了生產(chǎn)成本。L-天冬氨酸微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)是利用微生物產(chǎn)生的L-天冬氨酸酶,轉(zhuǎn)化底物富馬酸和氨水實(shí)現(xiàn)的,其轉(zhuǎn)化生產(chǎn)過程如圖1所示。

圖1   L-天冬氨酸和L-丙氨酸的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)過程Fig.1   Process of L-aspartic acid and L-alanine   transformation by microorganisms

富馬酸價(jià)格僅為L-天冬氨酸的40%左右,可以有效降低原料成本。前期有研究對產(chǎn)L-天冬氨酸酶的菌株和L-天冬氨酸-β-脫羧酶的菌株進(jìn)行固定,利用固定化細(xì)胞以富馬酸和氨水為底物,26 h可以催化生產(chǎn)1.05 mol/L的L-丙氨酸[10];還有研究利用純化的L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脫羧酶催化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸,但是酶的用量較大,同時(shí)生產(chǎn)的效率較低,難于工業(yè)化[11]??寺碓从诓G丸酮叢毛單胞菌的L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因,在攜帶L-天冬氨酸酶基因的大腸桿菌中異源表達(dá),構(gòu)建重組大腸桿菌工程菌,利用雙酶耦合催化,以期實(shí)現(xiàn)以重組工程菌高效轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸的工藝技術(shù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

菌株EscherichiacoliDH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,E.coliCICC 11022S為中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏菌株。組成型質(zhì)粒pETPtac和pETPT7在前期工作中構(gòu)建[12],pETDuet-1購自Novagen公司。

1.1.2酶和試劑

限制性內(nèi)切酶,Thermo Scientific公司。高保真DNA聚合酶Fast Pfu,北京全式金生物技術(shù)有限公司。T4 DNA連接酶,NEB公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒和DNA回收試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司。氨芐青霉素和硫酸卡那霉素,Sigma公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因asd的克隆

根據(jù)PseudomonasdacunhaeATCC 21192的L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因序列(GenBank:AB091385.1)設(shè)計(jì)引物對asd.f(NdeI)/asd.r(XhoI)(表1),正反向引物分別含有核酸內(nèi)切酶NdeI和XhoI,擴(kuò)增asd基因。

PCR反應(yīng)體系:模板DNA(Comamonastestosteroni基因組)(100 ng/μL)0.5 μL,上下游引物(20 μmol/L)各1 μL,dNTPs(10 mmol/L)4 μL,5× Fast Pfu Buffer 10 μL,F(xiàn)ast Pfu DNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL,ddH2O 33.5 μL。總體積50 μL。

PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。

1.2.2組成型重組質(zhì)粒的構(gòu)建

提取載體pETPtac、pETPT7和pETDuet-1,核酸內(nèi)切酶NdeI和XhoI分別處理載體和PCR擴(kuò)增的asd基因,切膠回收,T4 DNA連接酶連接載體和基因片段,構(gòu)建載體pETPtac-asd、pETPT7-asd和pETDuet-asd。

以pETPtac-asd為模板,設(shè)計(jì)引物對Ptac.f(MluI)/asd.r(EcoR I)(表1)擴(kuò)增DNA片段Ptac-asd(PCR體系和條件同asd基因的克隆),核酸內(nèi)切酶MluI和EcoR I處理PCR擴(kuò)增的Ptac-asd,插入載體pETDuet-asd的MluI和EcoR I,替換載體的lacI調(diào)控基因和T7啟動子,構(gòu)建載體pETPtac-asd-PT7-asd,可以不經(jīng)誘導(dǎo),起始下游基因的表達(dá)。

1.2.3培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10。115 ℃滅菌30 min。

LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加20 g/L瓊脂粉。

表1 引物序列

注:f表示正向引物,r表示反向引物;下劃線處為核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。

發(fā)酵液體培養(yǎng)基(g/L):富馬酸10,玉米漿干粉10,MgSO40.2,KH2PO41.0,NaCl 1.5。氨水調(diào)節(jié)pH 6.5~7.5,115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵固體培養(yǎng)基在液態(tài)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加20 g/L瓊脂粉。

1.2.4培養(yǎng)方法

將基因工程菌株劃線到含有100 mg/L氨芐青霉素或者50 mg/L硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上,(37±1) ℃培養(yǎng)(12±2) h。

無菌條件下,挑取平板上的單菌落,接種到含有100 mg/L氨芐青霉素或者50 mg/L硫酸卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中,(37±1) ℃搖床培養(yǎng)(12±2) h,獲得基因工程菌株的菌液。

將菌液以體積分?jǐn)?shù)1.0%接種量接種到含有100 mg/L氨芐青霉素或者50 mg/L硫酸卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中,(37±1) ℃搖床200 r/min培養(yǎng)(12±2)h,獲得基因工程菌株的發(fā)酵液。

E.coliCICC 11022S作為對照,以不加抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.5轉(zhuǎn)化方法

不同菌株轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸:紫外可見分光光度計(jì)600 nm測定發(fā)酵液的吸光度,以無菌生理鹽水統(tǒng)一調(diào)節(jié)E.coliCICC 11022S、E.coli/pETPtac-asd、E.coli/pETPT7-asd和E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd的OD600為7.0。將富馬酸以氨水調(diào)節(jié)pH為8.0,配制富馬酸銨飽和溶液。然后將菌液與富馬酸銨溶液以體積比1∶ 1進(jìn)行混合,調(diào)節(jié)溫度(45±1) ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,進(jìn)行轉(zhuǎn)化,0和12 h分別取樣,高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定富馬酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的濃度。以L-丙氨酸的濃度高低確定最優(yōu)的重組菌株。

不同溫度培養(yǎng)菌體催化生產(chǎn)L-丙氨酸:將活化的菌株以1%接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基,(37±1)℃搖床200 r/min培養(yǎng)(12±2) h,然后將菌液與富馬酸銨溶液以體積比1∶ 1進(jìn)行混合,調(diào)節(jié)溫度(45±1) ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)化,0和12 h分別取樣,HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定富馬酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的濃度。以L-丙氨酸的濃度高低確定最優(yōu)培養(yǎng)溫度。

全細(xì)胞高密度催化生產(chǎn)L-丙氨酸:離心收集菌體,無菌生理鹽水懸浮,制備濃度100 OD的菌懸液,然后以菌懸液與富馬酸銨溶液以體積比1∶ 6混合,調(diào)節(jié)溫度(45±1) ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,0、3、6、9和12 h分別取樣,HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定富馬酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的濃度。

以上催化實(shí)驗(yàn)均通過500 mL三角瓶進(jìn)行,裝液量50 mL。

1.2.6分析方法

1)富馬酸HPLC測定條件。

樣品處理:樣品稀釋合適倍數(shù),0.22 μm濾膜過濾后HPLC檢測。

樣品檢測:色譜柱為Prevail organic acid(5 μm,250 mm × 4.6 mm),紫外檢測器檢測波長210 nm,柱溫30 ℃,流速0.6 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,流動相為0.01 mol/L KH2PO4溶液(H3PO4調(diào)節(jié)pH為2.3)與甲醇(體積比為95∶ 5)。

2)L-天冬氨酸和L-丙氨酸樣品通過異硫氰酸苯酯(PITC)衍生定量檢測。

樣品衍生:樣品400 μL + 0.5 g/L正亮氨酸溶液20 μL + 0.1 mol/L PITC-乙腈溶液200 μL + 1 mol/L三乙胺-乙腈溶液200 μL,渦旋振蕩混勻后室溫放置60 min,然后加入800 μL正己烷,渦旋振蕩1 min,靜置10 min。用注射器吸取下層溶液,0.22 μm濾膜過濾后HPLC檢測。

樣品檢測:色譜柱為ZORBAX SB-C18(5 μm,4.6 mm × 150 mm),紫外檢測器設(shè)定波長為254 nm,柱溫38 ℃,流速設(shè)定為0.6 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,流動相A為0.1 mol/L pH 6.5的乙酸銨-乙腈(體積比97∶3)溶液,流動相B為乙腈溶液。洗脫程序?yàn)?~ 8 min流動相B的比例18%,8~16 min流動相B的比例由18%梯度升高到80%。

2結(jié)果與討論

2.1L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因asd的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

以C.testosteroni基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,電泳分析,得到1條約1.6 kb的條帶,結(jié)果如圖2(a)所示,其大小與L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因(asd)的理論大小一致。將其插入載體pETPtac、pETPT7和pETDuet-1,構(gòu)建表達(dá)載體pETPtac-asd、pETPT7-asd和pETDuet-asd,然后以pETPtac-asd為模板,構(gòu)建asd基因雙拷貝的組成型表達(dá)載體pETPtac-asd-PT7-asd。將載體pETPtac-asd、pETPT7-asd和pETPtac-asd-PT7-asd轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliCICC 11022S,構(gòu)建基因工程菌株E.coli/pETPtac-asd、E.coli/pETPT7-asd和E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd,其單酶切驗(yàn)證如圖2(b)、2(c)、2(d)所示。

(a):M1—DL2000Marker,1—asd基因;(b):M2—DNA Marker,1—Xho I酶切處理pETPtac,2—pETPtac-asd;(c):M2—DNA Marker,1—Xho I酶切處理pETPT7,2—pETPT7-asd;(d):M2—DNA Marker,1—Xho I酶切處理pETDuet-1,2—pETPtac-asd-PT7-asd圖2   asd基因PCR擴(kuò)增,質(zhì)粒pETPtac-asd、pETPT7-asd和pETPtac-asd-PT7-asd單酶切驗(yàn)證Fig.2   PCR amplification of asd,restrication enzyme verification of pETPtac-asd,pETPT7-asd and pETPtac-asd-PT7-asd

2.2菌株E.coliCICC 11022S,E.coli/pETPtac-asd,E.coli/pETPT7-asd和E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd生產(chǎn)L-丙氨酸比較

為了使工程菌株在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中操作更加簡單,構(gòu)建的基因工程菌株均為不經(jīng)誘導(dǎo)操作、起始下游基因表達(dá)的組成型表達(dá)基因工程菌株。不同菌株轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-天冬氨酸和L-丙氨酸結(jié)果如表2所示。

表2 不同菌株轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-天冬氨酸和L-丙氨酸

注:a—細(xì)胞密度OD600為產(chǎn)酶發(fā)酵后的OD值;b—富馬酸質(zhì)量濃度為反應(yīng)體系初始濃度與反應(yīng)完畢殘留濃度的差值。

Takamatsu等[10]研究結(jié)果和表2結(jié)果均表明,組成型表達(dá)的重組菌株可以不經(jīng)誘導(dǎo)操作,有效地進(jìn)行異源基因表達(dá)。重組菌株E.coli/pETPtac-asd,E.coli/pETPT7-asd和E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd均可以轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸。其中,以E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd生產(chǎn)L-丙氨酸的能力最佳,12 h共產(chǎn)生54.76 g/L的L-丙氨酸,生產(chǎn)速率4.56 g/(L·h),同時(shí)還生產(chǎn)了16.01 g/L的L-天冬氨酸。與之相比,出發(fā)菌株不能產(chǎn)生L-丙氨酸,12 h共生產(chǎn)了L-天冬氨酸100.95 g/L。以上結(jié)果表明,成功構(gòu)建得到L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脫羧酶雙酶共表達(dá)的重組菌株,實(shí)現(xiàn)了以富馬酸為底物、生產(chǎn)L-丙氨酸的工藝技術(shù)。該結(jié)果還表明,通過增加L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因的拷貝數(shù),可以提高L-丙氨酸的生產(chǎn)速率。后續(xù)可以開展L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因表達(dá)的系統(tǒng)優(yōu)化,在不影響細(xì)胞生長代謝的條件下,進(jìn)一步提高工程菌的生產(chǎn)效率。

2.3重組菌株E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd不同溫度培養(yǎng)對L-丙氨酸轉(zhuǎn)化的比較

溫度對重組菌株的基因異源表達(dá)影響較大[13],故對重組菌株E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd在不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng),然后同一條件進(jìn)行轉(zhuǎn)化,考察培養(yǎng)溫度對重組菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-丙氨酸的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3   溫度對E. coli/pETPtac-asd-PT7-asd   生產(chǎn)L-丙氨酸的影響Fig.3    Effects of different culture temperature on L-alanine   production by E. coli/pETPtac-asd-PT7-asd

由圖3可知:37 ℃培養(yǎng)E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd,與其他培養(yǎng)溫度相比,所得等體積發(fā)酵液具有最高效的L-丙氨酸轉(zhuǎn)化能力。12 h共產(chǎn)生L-丙氨酸56.66 g/L,略優(yōu)于30 ℃發(fā)酵液(52.77 g/L)。由于大腸桿菌的最適培養(yǎng)溫度為37 ℃,溫度上升,其菌體生長能力下降明顯,故沒有進(jìn)行40 ℃以上培養(yǎng)E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd的實(shí)驗(yàn)。

2.4重組菌株E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd全細(xì)胞高密度轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸

圖4   E. coli/pETPtac-asd-PT7-asd全細(xì)胞   高密度生產(chǎn)L-丙氨酸Fig.4   Production of L-alanine by high cell density of   E. coli/pETPtac-asd-PT7-asd

為進(jìn)一步提高L-丙氨酸生產(chǎn)效率,嘗試了高密度轉(zhuǎn)化方式,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:E.coli/pETPtac-asd-PT7-asd 9 h可以轉(zhuǎn)化154.3 g/L富馬酸產(chǎn)生112.7 g/L L-丙氨酸,生產(chǎn)速率12.5 g/(L·h),轉(zhuǎn)化率93.8%。

3結(jié)論

首次嘗試通過重組菌株雙酶耦合表達(dá),實(shí)現(xiàn)了以富馬酸為底物、轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-丙氨酸的工藝技術(shù),降低了生產(chǎn)的原料成本。全細(xì)胞高密度催化結(jié)果表明,重組菌株9 h可以轉(zhuǎn)化154.3 g/L富馬酸產(chǎn)生112.7 g/L L-丙氨酸,生產(chǎn)速率12.5 g/(L·h),轉(zhuǎn)化率93.8%,表明該重組菌株具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

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(責(zé)任編輯管珺)

Transformation of fumaric acid for the production of L-alanine by recombinantEscherichiacoli

XU Youqiang1,MA Yuyue2,YAO Su1,JIANG Zengyan2,ZHANG Qi1,ZHANG Lu1,PEI Jiangsen1,CHENG Chi1

(1. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China;2. Engineering Technology Research Center of Fumaric Acid Biotransformation in Shandong Province,Yantai 265709,China)

Abstract:The gene coding for L-aspartate-β-decarboxylase from Comamonas testosteroni was cloned and expressed in an Escherichia coli strain CICC 11022S with the capability for L-aspartic acid production. The recombinant strain was used for the synthesis of L-alanine. The recombinant strain produced 112.7 g/L L-alanine from fumaric acid with a rate of 12.5 g/(L·h)and a conversion ratio of 93.8%. Fumaric acid has a low price,which efficiently reduces the substrate cost for L-alanine production. L-alanine was producd from fumaric acid by using the recombinant strain,and the results showed that the technology had industrial application potential.

Keywords:L-alanine;L-aspartase;L-aspartate-β-decarboxylase;recombinant strain

中圖分類號:Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-3678(2016)02-0007-05

作者簡介:徐友強(qiáng)(1986—),男,山東青州人,博士,工程師,研究方向:發(fā)酵工程;程池(聯(lián)系人),教授級高級工程師,E-mail:cheng100027@163.com

基金項(xiàng)目:煙臺市科技發(fā)展計(jì)劃(2014SF151);中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院2015年科技發(fā)展基金(博士專項(xiàng))(2015KJFZ-BS-03)

收稿日期:2015-07-21

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.002

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