王婷婷，鄧子新,2，陳文青

(1. 武漢大學藥學院組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點實驗室，湖北武漢430072；

2. 上海交通大學 生命科學技術學院，上海200240)

?

抗生素生物合成基因簇克隆策略的研究進展

王婷婷1，鄧子新1,2，陳文青1

(1. 武漢大學藥學院組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點實驗室，湖北武漢430072；

2. 上海交通大學 生命科學技術學院，上海200240)

摘要：抗生素是一類具有多種生物活性的微生物次級代謝產(chǎn)物，自然界中60%以上的抗生素由放線菌所產(chǎn)生?？寺】股厣锖铣苫虼乜蔀殛U明其生物合成機制，結構改造，產(chǎn)量提高提供重要信息。在后基因組時代，新的抗生素基因簇克隆策略不斷涌現(xiàn)，大大提高了微生物重要次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的克隆效率，并縮短了抗生素的發(fā)現(xiàn)周期。本文綜述了抗生素生物合成基因簇克隆策略的研究進展,包括近年來發(fā)展的后基因組的克隆策略。

關鍵詞：抗生素;次級代謝產(chǎn)物;生物合成基因簇;克隆策略;后基因組時代

抗生素是重要的微生物次級代謝產(chǎn)物，而微生物次級代謝產(chǎn)物指“微生物在一定的時期以初級代謝產(chǎn)物為底物，所合成的對生物體無明確功能的物質(zhì)”。放線菌、芽胞桿菌、藍細菌、黏細菌及真菌等是產(chǎn)生重要次級代謝產(chǎn)物的微生物種類，其中放線菌以產(chǎn)生60%以上的重要抗生素而著稱[1]。

由于自然界遞減規(guī)律的制約，新型抗生素發(fā)現(xiàn)的可能性大為降低，與此同時，抗生素耐藥性菌不斷涌現(xiàn)，甚至出現(xiàn)了超級耐藥菌，這一切要求我們必須對現(xiàn)有的抗生素進行結構改造以期提高其生物活性，同時也要求我們加大對具有更高生物活性抗生素的篩選力度。原核生物來源的抗生素生物合成基因簇一般位于染色體上一段連續(xù)的區(qū)域，大小一般在20～200 kb，含有與抗生素合成相關的結構基因、調(diào)控基因、抗性基因和轉(zhuǎn)運蛋白基因，只有克隆其生物合成基因簇，闡明其生物合成機制，才能為應用組合生物合成策略創(chuàng)造出更高生物活性“非天然的天然化合物”[2]和以代謝工程手段定向提高抗生素產(chǎn)量奠定理論基礎[3]。令人振奮的是，隨著“后基因組時代”的到來，基因組掃描(genome scanning)[4]及基因組挖掘(genome mining)[5]等策略的應用使微生物重要次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的克隆效率大為提高，這同時也提高了新藥發(fā)現(xiàn)的預期，并縮短其發(fā)現(xiàn)周期。

1抗生素生物合成基因簇的傳統(tǒng)克隆策略

早在1990年，Chater等[6]總結了抗生素生物合成基因簇的克隆策略，近年來由于技術的進步，抗生素生物合成基因簇的克隆策略在此基礎上有了更大發(fā)展，故本節(jié)將二者一并歸結為傳統(tǒng)策略。

1.1互補克隆策略

首先獲得抗生素產(chǎn)生菌的阻斷突變株，然后隨機克隆一些野生型DNA大片段到該阻斷突變株，篩選目標抗生素產(chǎn)生能力恢復的克隆子，從而克隆出與目標抗生素生物合成的相關基因。早期，天藍色鏈霉菌中放線紫紅素[7]及十一烷基靈菌紅素[8]的合成基因，灰色鏈霉菌產(chǎn)生的鏈霉素生物合成基因簇[9]均使用此策略所克隆。可以說抗生素的生物合成基因簇都可以用這種方法獲得。

1.2突變克隆策略

此策略率先由英國John Innes Center的Chater教授所建立，將野生型DNA片段隨機克隆到來源于一個放線菌噬菌體的特定載體上，含有紫霉素抗性基因，但不含有噬菌體的整合位點，因此在紫霉素的抗性篩選下，只有發(fā)生同源重組的克隆才能存活，然后從存活的克隆子中篩選目標抗生素阻斷突變株，再以出發(fā)載體為探針，克隆出目標抗生素的生物合成基因簇。天藍色鏈霉菌中次甲基霉素[10]生物合成基因的克隆即采用此策略。

1.3異源表達克隆策略

抗生素產(chǎn)生菌來自不同的種屬，不同種屬的基因組源自于不同的進化過程，即為基因的異源性。將整個或部分抗生素生物合成基因轉(zhuǎn)入與其生產(chǎn)菌不同源(即異源)的宿主菌中,使其功能得到表達并產(chǎn)生該抗生素或其部分結構的過程,稱為異源表達。該策略的使用前提是必須擁有高效的模式表達宿主，如S.lividans；此外還必須具有高效靈敏的檢測手段，通過對基因產(chǎn)物的檢測，從而確定抗生素的基因簇位置。Jones等[11]早期利用此方法在變鉛青鏈霉菌中隨機克隆到與放線菌素生物合成有關的基因。

1.4利用抗性基因為探針的克隆策略

一些抗生素產(chǎn)生菌產(chǎn)生的抗生素對產(chǎn)生菌本身也有抑制作用，所以抗生素產(chǎn)生菌必須具備完善的自我保護基因——抗性基因?？剐曰蛞话闩c生物合成基因連鎖，所以克隆到抗性基因即意味著克隆到抗生素的生物合成基因簇。在紅霉素生物合成基因簇的克隆上，先克隆紅霉素抗性基因(eryE)，而紅霉素抗性基因是紅霉素生物合成所必需的，從此基因出發(fā)通過染色體走外走的方法實現(xiàn)紅霉素生物合成基因簇[12-13]的克隆。

1.5利用同源片段進行雜交的克隆策略

早期克隆到放線紫紅素的生物合成基因后，利用含其生物合成基因的DNA大片段為探針克隆到角多霉素[14]等的基因簇。對于聚酮類抗生素而言，由于他們的生物合成模式相似，因此，此克隆策略被廣泛運用于聚酮類化合物生物合成基因簇的克隆。如利用含有編碼紅霉素PKS的DNA片斷為探針，成功地從南昌鏈霉菌中克隆出梅嶺霉素[15]和南昌霉素[16]的生物合成基因簇。尼可霉素(Nikkomycin)與多氧霉素(Polyoxin)的核苷骨架相似，其中基因nikO(GenBank登錄號：AJ251438)是負責Nikkomycin核苷骨架生物合成的關鍵基因，2009年，Chen等[17]以nikO的片斷作為探針從S.cacaoi菌中克隆到多氧霉素的基因簇。

1.6利用PCR方法的克隆策略

在實際的克隆實踐中，由于核苷酸同源性較低，應用同源片段進行雜交往往信號太弱以致無法鑒定，故利用此策略存在諸多限制；而PCR方法可擺脫此約束，該方法利用同源基因中某些結構域氨基酸的高度保守性，從這些氨基酸出發(fā)，反向設計簡并引物或特異性引物，然后以野生型抗生素產(chǎn)生菌的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，以期擴增到目標同源基因作為探針。目前此方法被廣泛應用于抗生素生物合成基因簇的克隆，烯二炔類抗生素C-1027[18]生物合成基因簇利用此策略克隆，先克隆到sgcAB基因，結果顯示它們是C-1027生物合成必須的基因，通過PCR方法從sgcAB所在的位置測序了87 kb大小的DNA，通過敲除實驗確定邊界，最終獲得C-1027生物合成基因簇。

2“后基因組時代”抗生素生物合成基因簇的克隆策略

2.1基因組掃描(genome scanning)

有些結構新穎的抗生素，其生物合成基因簇無法采用傳統(tǒng)的克隆策略進行克隆，而抗生素生物合成基因簇大小在20～200 kb范圍內(nèi)，其產(chǎn)生菌的基因組大小為8.0 Mb左右。基因組掃描策略是指運用鳥槍法隨機克隆并測序一定數(shù)量特定大小的野生型基因組序列標簽(genome sequence tags,GSTs)，然后進一步分析以期鑒定出參與目標抗生素的基因組序列標簽。由于克隆的隨機性，因此在一定數(shù)目的基因組序列標簽中應該包含目標抗生素的部分生物合成基因[19]。利用該策略目前已克隆的抗生素生物合成基因簇有Maduropeptin[20]及Epothilone[21]等。

2.2基因組挖掘(genome mining)

通?？股厣锖铣苫虼氐目寺∈菑漠a(chǎn)物出發(fā)，然后克隆目標抗生素的生物合成基因簇，而基因組挖掘則是通過基因組信息出發(fā)，鑒定出未知抗生素?；蚪M挖掘最開始由David Hopwood和他的合作者發(fā)現(xiàn)，這個概念已經(jīng)發(fā)展成熟為一門學科。2002年，第一個抗生素產(chǎn)生菌天藍色鏈霉菌全基因組測序工作完成。通過對天藍色鏈霉菌基因組進行挖掘并結合生物信息學分析，Lautru等[5]從天藍色鏈霉菌基因組中鑒定了非核糖體肽(non-ribosomal peptide)化合物，結合體內(nèi)遺傳學分析和體外化學手段，從天藍色鏈霉菌代謝產(chǎn)物中分離到新的鐵載體(siderophore)化合物Coelichelin。

2.3Red/ET重組克隆策略

天然產(chǎn)物生物合成途徑，尤其是I型聚酮合成酶/非核糖體多肽合成酶(PKS/NRPS)基因簇比較大，是很難利用傳統(tǒng)的基因工程技術的；在大腸桿菌中,基于體內(nèi)同源重組,Red/ET重組[22]使之成為可能，Red/ET重組不受限制位點和DNA片段大小的影響。它是將生物合成基因簇重組到通用的載體中，在適合的宿主中異源表達，從而研究未知的生物合成基因簇或者產(chǎn)生一定藥理活性的衍生物。這種重組技術依賴線性和線性的DNA分子同源重組(linear-plus-linear homologous recombination,LLHR)(圖1)，主要在大腸桿菌中通過短的同源臂重組，由兩個同等的噬菌體蛋白對催化，一個是λ噬菌體的Redα/Redβ蛋白，一個是位于E.coliK12染色體上的Rac前噬菌體的RecE/RecT蛋白。Syringolins是一類新的蛋白酶體抑制劑，是從植物致病菌Pseudomonassyringaepv.syringaeB301D-R中分離的，主要成分是Syringolin A，還有少量成分Syringolin B～F，他們的生物合成是由包含NRPS-PKS組合的大合成酶催化的，其中基因sylC編碼含有單個的C、A、T模塊的NRPS，基因sylD編碼包含典型的NRPS和PKS模塊的雜合蛋白，基因sylE負責Syringolin的泵出。直接從酶切的基因組DNA中克隆到19 kb大小的sylCDE基因，在大腸桿菌中進行LLHR，而后在E.coliGB05-MtaA中表達，最終檢測到Syringolin G和Syringolin H[23]。Luminmycin A和Luminmide A/B[24]的生物合成基因簇同樣是利用此策略獲得。這種方法比傳統(tǒng)的構建基因組文庫然后篩選目標基因簇更簡單，直接克隆也會減少很多突變，并且能夠獲得更大的DNA片段(10～52 kb)。Red/ET重組不僅極大地促進了大且復雜的生物合成途徑的基因工程的改造，也用于從復雜的DNA源到質(zhì)粒的基因簇克隆。這種有效克隆大生物合成基因簇方法的建立也推動了基因挖掘和組合生物的發(fā)展。

2.4利用TAR方法的克隆策略

圖1　　　Red/ET重組克隆和異源表達示意圖Fig.1　　　Red/ET recombineering and heterologous expression

微生物的基因組能夠合成大量的特殊化合物，然而由于缺乏將基因和分子關聯(lián)起來的有效方法，到目前僅有一小部分次級代謝產(chǎn)物被開發(fā)出來。TAR(transformation-associated recombination)克隆是利用天然的體內(nèi)同源重組優(yōu)勢，精確捕捉感興趣的基因簇位置。TAR策略需先構建一個由三部分組成的載體，酵母部分可以直接克隆和進行遺傳操作、大腸桿菌部分可以用于基因的保留和遺傳操作，放線菌部分能夠用于整合和異源表達(圖2)。利用TAR的基因平臺，直接克隆、重構、異源表達沉默的生物合成通路，從而獲得新的抗生素。2013年， Yamanaka等[25]利用此策略從海洋放線菌Saccharomonosporasp. CNQ-490中直接捕獲、激活并表達了1個67 kb大小的非核糖體肽合成酶(NRPS)的生物合成基因簇，發(fā)現(xiàn)了脂肽抗生素Taromycin A。這種即插即用的方法有效獲取罕見的合成途徑，為新的天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和藥物的發(fā)展開辟了方向。

圖2　　　TAR克隆策略和表達的示意圖Fig.2　　　Design and strategy of TAR-cloning and expression

3展望

由于傳統(tǒng)抗生素篩選方法的制約，微生物新藥發(fā)現(xiàn)呈遞減趨勢，而且抗生素耐藥菌的不斷涌現(xiàn)，如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌和萬古霉素抗性的乳酸腸球菌，這一切對微生物新藥的發(fā)現(xiàn)提出了更迫切的要求。從已發(fā)現(xiàn)的抗生素出發(fā)，結合基因組測序技術的發(fā)展，更高效快捷地找到抗生素的生物合成基因簇；當然，從已克隆的抗生素生物合成基因出發(fā)，以特定保守的關鍵酶基因作為誘餌可以鑒定出新的隱性抗生素及其生物合成基因簇。從基因信息出發(fā)來鑒定抗生素的研究策略改變了傳統(tǒng)的微生物新藥發(fā)現(xiàn)與抗生素生物合成基因簇克隆的模式與途徑，這無疑極大地推動了抗生素生物合成基因簇的克隆和微生物來源的新藥發(fā)現(xiàn)。未來后基因組時代必將經(jīng)過一個輝煌的發(fā)展歷程，基因組挖掘，基因組掃描、定向克隆，重組克隆等技術結合，真核生物基因與原核生物基因的重組可衍生一些新的方法，將大大推動后基因組克隆技術的發(fā)展，從而獲得更多的抗生素生物合成基因簇。

參考文獻：

[1]CHATER K F.David Hopwood and the emergence ofStreptomycesgenetics[J].Int Microbiol,1999,2(2):61-68.

[2]HOPWOOD D A.Genetic contributions to understanding polyketide synthases[J].Chem Rev,1997,97(7):2465-2498.

[3]CHALLIS G L.Mining microbial genomes for new natural products and biosynthetic pathways[J].Microbiology,2008,154(6):1555-1569.

[4]ZAZOPOULOS E,HUANG K,STAFFA A,et al.A genomics-guided approach for discovering and expressing cryptic metabolic pathways[J].Nat Biotechnol,2003,21(2):187-190.

[5]LAUTRU S,DEETH R J,BAILEY L M,et al.Discovery of a new peptide natural product byStreptomycescoelicolorgenome mining[J].Nat Chem Biol,2005,1(5):265-269.

[6]CHATER K F.The improving prospects for yield increase by genetic engineering in antibiotic-producingStreptomycetes[J].Biotechnology(N Y),1990,8(2):115-121.

[7]MALPARTIDA F,HOPWOOD D A.Molecular cloning of the whole biosynthetic pathway of aStreptomycesantibiotic and its expression in a heterologous host[J].Nature,1984,309:462-464.

[8]FEITELSON J S,MALPARTIDA F,HOPWOOD D A.Genetic and biochemical characterization of the red gene cluster of StreptomycescoelicolorA3(2)[J].J Gen Microbiol,1985,131(9):2431-2441.

[9]OHNUKI T,IMANAKA T,AIBA S.Self-cloning inStreptomycesgriseusof anstrgene cluster for streptomycin biosynthesis and streptomycin resistance[J].J Bacteriol,1985,164(1):85-94.

[10]CHATER K F,BRUTON C J.Mutational cloning inStreptomycesand the isolation of antibiotic production genes[J].Gene,1983,26(1):67-78.

[11]JONES G H,HOPWOOD D A.Molecular cloning and expression of the phenoxazinone synthase gene fromStreptomycesantibioticus[J].J Biol Chem,1984,259(22):14151-14157.

[12]CORTES J,HAYDOCK S F,ROBERTS G A,et al.An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase ofSaccharopolysporaerythraea[J].Nature,1990,348:176-178.

[13]DONADIO S,STAVER M J,MCALPINE J B,et al.Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis[J].Science,1991,252:675-679.

[14]HAN L,YANG K,RAMALINGAM E,et al.Cloning and characterization of polyketide synthase genes for jadomycin B biosynthesis inStreptomycesvenezuelaeISP5230[J].Microbiology,1994,140(Pt 12):3379-3389.

[15]SUN Y H,ZHOU X F,TU G Q,et al.Identification of a gene cluster encoding meilingmycin biosynthesis among multiple polyketide synthase contigs isolated fromStreptomycesnanchangensisNS3226[J].Arch Microbiol,2003,180(2):101-107.

[16]SUN Y H,ZHOU X F,DONG H,et al.A complete gene cluster fromStreptomycesnanchangensisNS3226 encoding biosynthesis of the polyether ionophore nanchangmycin[J].Chem Biol,2003,10(5):431-441.

[17]CHEN W Q,HUANG T T,HE X Y,et al.Characterization of the polyoxin biosynthetic gene cluster fromStreptomycescacaoiand engineered production of polyoxin H[J].J Biol Chem,2009,284(16):10627-10638.

[18]LIU W,CHRISTENSON S D,STANDAGE S,et al.Biosynthesis of the enediyne antitumor antibiotic C-1027[J].Science,2002,297(5584):1170-1173.

[19]LIU W,AHLERT J,GAO Q,et al.Rapid PCR amplification of minimal enediyne polyketide synthase cassettes leads to a predictive familial classification model[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(21):11959-11963.

[20]VAN LANEN S G,SHEN B.Microbial genomics for the improvement of natural product discovery[J].Curr Opin Microbiol,2006,9(3):252-260.

[21]SANTI D V,SIANI M A,JULIEN B,et al.An approach for obtaining perfect hybridization probes for unknown polyketide synthase genes:a search for the epothilone gene cluster[J].Gene,2000,247(1-2):97-102.

[22]ZHANG Y,BUCHHOLZ F,MUYRERS J P,et al.A new logic for DNA engineering using recombination inEscherichiacoli[J].Nat Genet,1998,20(2):123-128.

[23]BIAN X Y,HUANG F,STEWART F A,et al.Direct cloning,genetic engineering,and heterologous expression of the syringolin biosynthetic gene cluster inE.colithrough Red/ET recombineering[J].ChemBioChem,2012,13(13):1946-1952.

[24]FU J,BIAN X Y,HU S B,et al.Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting[J].Nat Biotechnol,2012,30(5):440-446.

[25]YAMANAKA K,REYNOLDS K A,Kersten R D,et al.Direct cloning and refactoring of a silent lipopeptide biosynthetic gene cluster yields the antibiotic taromycin A[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(5):1957-1962.

(責任編輯荀志金)

Progress in strategies for cloning of antibiotics biosynthetic gene clusters

WANG Tingting1,DENG Zixin1,2,CHEN Wenqing1

(1.Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery of the Ministry of Education,School of Pharmaceutical Sciences,Wuhan University,Wuhan 430072,China; 2. School of Life Sciences and Biotechnology,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240，China)

Abstract：Antibiotics are microbial secondary metabolites with diverse bioactivities,and more than 60% of important antibiotics are produced by Actinomycetes. Cloning of antibiotics biosynthetic gene clusters offers pivotal information for elucidating their biosynthetic mechanism,structural modification and yield improvement. In post-genomic era,the efficiency for the cloning of important secondary metabolites gene clusters is significantly enhanced,and reduced the time for new antibiotics. We reviewed recent-progress in cloning strategies of antibiotics biosynthetic gene clusters，in particular， recently-developed cloning technology of the post-genomic era.

Keywords：antibiotics;secondary metabolites;biosynthetic gene cluster;cloning strategy;post genomic era

中圖分類號：Q781

文獻標志碼：A

文章編號：1672-3678(2016)02-0070-05

作者簡介：王婷婷(1989—)，女，湖北隨州人，研究方向：抗生素基因簇克隆；陳文青(聯(lián)系人)，副教授，E-mail：wqchen@whu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(31270100)

收稿日期：2015-04-09

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.013