李士林，王宜君，張薄博，湯朝起，許贛榮

(1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；

2. 上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海200082)

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糊米汁對煙葉發(fā)酵過程中微生物的影響

李士林1，王宜君1，張薄博1，湯朝起2，許贛榮1

(1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；

2. 上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海200082)

摘要：研究了糊米汁對煙葉發(fā)酵過程中微生物種群及種群數(shù)量的變化，初步了解了糊米汁對煙葉微生物的影響。通過添加糊米汁的培養(yǎng)基對煙葉微生物進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)和固態(tài)培養(yǎng)。結(jié)果表明：在糊米汁堆積式發(fā)酵與糊米汁培養(yǎng)基中，糊米汁對煙葉的好氧細(xì)菌、厭氧細(xì)菌都有非常明顯的抑制作用，糊米汁用量越多，抑制作用越明顯；但是在普通培養(yǎng)基中施加糊米汁，卻對霉菌和酵母沒有明顯的抑制作用。糊米汁只在煙葉堆積式固態(tài)發(fā)酵過程中表現(xiàn)出抑制霉菌和酵母的作用，說明糊米汁抑制微生物生長的機(jī)制主要是它具有黏性，施加到煙葉中會(huì)使煙葉相互粘結(jié)，阻礙了O2的傳遞進(jìn)而抑制了霉菌和酵母的生長。

關(guān)鍵詞：糊米汁；煙葉；微生物；發(fā)酵

糊毛煙主要產(chǎn)自四川什邡、廣漢等地，是一種獨(dú)具特色的地方性原料煙葉[1]，主要用于制作雪茄煙[2]，其傳統(tǒng)制作工藝是將收獲、曬制好并進(jìn)行初步堆積發(fā)酵過的煙葉沾上糊米汁，堆積起來進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵所制成的煙葉，俗稱糊毛煙。固態(tài)發(fā)酵后的煙葉吸食品質(zhì)得到了明顯改善。對于糊米汁在煙葉發(fā)酵中所起到的作用鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。煙葉的固態(tài)發(fā)酵，一般是在低水分含量條件下進(jìn)行的，目的是防止煙葉的霉變，而添加糊米汁到煙葉時(shí)，明顯會(huì)增加煙葉的含水量，但糊毛煙在數(shù)月的發(fā)酵過程中，卻可避免煙葉的發(fā)霉，因此從原理上分析，在煙葉中施加糊米汁，有抑制煙葉微生物發(fā)酵霉變的作用。煙葉發(fā)酵主要是煙葉中自帶的微生物與多種復(fù)合酶體系的共同作用。糊米汁是否影響煙葉微生物的代謝活動(dòng)是個(gè)值得研究的課題。本文中，筆者就糊米汁對煙葉自帶微生物的作用進(jìn)行研究，以期為糊米汁煙葉發(fā)酵提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

上部煙葉，由上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司提供，為2012年福建煙葉；FA1004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PL602-S型電子天平，Mettler Toledo儀器上海儀器有限公司；PB-10 pH計(jì)、Sartorius MA-40型紅外線水分測試儀，德國賽多利斯公司；PYX-XHS-405電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)公司。

細(xì)菌液態(tài)培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水1 L，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min[3]。

細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)基：在細(xì)菌液態(tài)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加20 g瓊脂。

霉菌液態(tài)培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L[4]。

霉菌瓊脂培養(yǎng)基：在霉菌液態(tài)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加20 g瓊脂。

酵母液態(tài)培養(yǎng)基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，pH6.0[5]。

酵母瓊脂培養(yǎng)基：在酵母液態(tài)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加20 g瓊脂。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1糊米汁的制作方法

取適量大米放到鐵鍋中炒，先中火炒到大米變黃，再大火炒，當(dāng)大米膨脹成黑色團(tuán)狀時(shí)再中火炒，直到炒到大米粘在一團(tuán)，此過程大約14 min。按料水比1∶ 2.7(g/L)加涼開水，再煮沸10 min，過濾得到糊米汁，其波美度18，pH 3.74[6]。

1.2.2固態(tài)發(fā)酵方法

三角瓶發(fā)酵：稱取30～90 g煙葉，噴灑體積分?jǐn)?shù)40%糊米汁，裝入500 mL三角瓶中，于培養(yǎng)箱中30 ℃發(fā)酵。

框發(fā)酵(模擬堆積式發(fā)酵)：稱取5 kg煙葉，噴灑體積分?jǐn)?shù)20%～40%糊米汁，補(bǔ)充適量水使煙葉的水分為40%，裝入發(fā)酵框中，壓緊，于培養(yǎng)箱中30 ℃發(fā)酵。

1.3分析方法

將上部煙葉剪成碎片，取煙葉碎片10.0 g于盛有100 mL無菌水的三角瓶中，37 ℃振蕩20 min，制成菌懸液。

1.3.1好氧細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法

在超凈臺(tái)中將菌懸液稀釋成一定濃度，取200 μL均勻涂在細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)基平板中，于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2厭氧細(xì)菌雙層平板計(jì)數(shù)法

在超凈臺(tái)中取稀釋一定濃度的菌懸液200 μL，均勻涂在細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)基平板中，再倒入一層40 ℃左右未凝固的細(xì)菌培養(yǎng)基，待冷卻凝固后于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.3酵母和霉菌平板計(jì)數(shù)法

在超凈臺(tái)中取稀釋一定濃度的菌懸液200 μL，均勻涂在霉菌和酵母瓊脂培養(yǎng)基平板中，于培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)2～4 d[7]。

(1)

式中：w—煙葉中水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；5—200 μL菌懸液折算成1 mL的系數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1糊米汁在發(fā)酵上部煙葉過程中對微生物種群數(shù)量的影響

糊毛煙是將煙葉沾取糊米汁后堆積在一起進(jìn)行發(fā)酵而成的，本實(shí)驗(yàn)用框模擬了糊毛煙的發(fā)酵方式，設(shè)計(jì)糊米汁的用量(體積分?jǐn)?shù))為0、20%、40%，對糊米汁發(fā)酵煙葉過程中的霉菌、細(xì)菌和酵母的種群數(shù)量進(jìn)行檢測，以了解糊米汁在發(fā)酵過程中對煙葉微生物的影響。

2.1.1發(fā)酵過程中霉菌種群數(shù)量的變化

糊毛煙由于經(jīng)常翻堆，每次翻堆后煙葉水分會(huì)降低很多，從而避免了煙葉發(fā)霉。本實(shí)驗(yàn)為了探究糊米汁在發(fā)酵過程對霉菌的影響，故沒有進(jìn)行翻堆。當(dāng)發(fā)現(xiàn)煙葉發(fā)霉時(shí)停止發(fā)酵，測定發(fā)酵過程中的霉菌種群數(shù)量，結(jié)果如圖1所示。

圖1　　　糊米汁用量對煙葉發(fā)酵過程中霉菌種群數(shù)量的影響Fig.1　　　Effects of fried-rice leachate content　　　on the amount of mould during　　　tobacoo fermentation

由圖1可見：對照組(0%糊米汁)發(fā)酵第96 h時(shí)煙葉霉變，此時(shí)霉菌的種群數(shù)量是4.3×104CFU/g；糊米汁用量為20%時(shí)，煙葉發(fā)酵到第120 h時(shí)霉變，此時(shí)霉菌的種群數(shù)量是2.9×104CFU/g；糊米汁用量為

40%時(shí)，煙葉發(fā)酵到第168 h時(shí)霉變，此時(shí)霉菌的種群數(shù)量是5.1×104CFU/g?？梢姡?dāng)霉菌的種群數(shù)量達(dá)到104CFU/g時(shí)，煙葉就已經(jīng)霉變(煙葉上霉變達(dá)到肉眼可見程度)。糊米汁在煙葉堆積式固態(tài)發(fā)酵過程中有著明顯的抑制霉菌的作用，糊米汁添加量越多，抑制效果越明顯。(實(shí)驗(yàn)結(jié)果起始霉菌種群數(shù)量為0，只能說明筆者所用檢測方法里沒有檢測出來霉菌種群，不代表煙葉本身沒有霉菌種群。)

2.1.2發(fā)酵過程中細(xì)菌的變化

對糊米汁發(fā)酵煙葉過程中的好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌種群數(shù)量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。

圖2　　　糊米汁用量對煙葉發(fā)酵過程中細(xì)菌種群數(shù)量的影響Fig.2　　　Effects of fried-rice leachate content on the amount of bacteria during tobacoo fermentation

由圖2可見：發(fā)酵過程中煙葉好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌均呈遞減的趨勢，添加糊米汁的發(fā)酵過程中，好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌遞減的幅度均明顯大于對照組，說明糊米汁對煙葉的細(xì)菌有非常明顯的抑制作用，糊米汁用量越多，抑制效果越明顯。

2.1.3發(fā)酵過程中酵母的變化

對糊米汁發(fā)酵煙葉過程中的酵母種群數(shù)量進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示。

表1　糊米汁用量對煙葉發(fā)酵過程中酵母種群數(shù)量的影響

由表1可見，對照組發(fā)酵過程中煙葉酵母的種群數(shù)量迅速增加，添加糊米汁發(fā)酵過程中酵母種群數(shù)量增加很少，說明糊米汁對煙葉中酵母有較明顯的抑制作用，糊米汁用量越多，抑制效果越明顯。(實(shí)驗(yàn)結(jié)果起始酵母種群數(shù)量為0，只能說明筆者所用檢測方法里沒有檢測出來酵母種群，不代表煙葉本身沒有酵母種群。)

2.2糊米汁對煙葉微生物抑制作用的驗(yàn)證

糊米汁在煙葉堆積式固態(tài)發(fā)酵過程中對細(xì)菌、霉菌和酵母有著明顯的抑制作用，為了驗(yàn)證糊米汁是否對微生物有抑制作用，筆者利用三角瓶液態(tài)培養(yǎng)和瓊脂平板培養(yǎng)進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.2.1糊米汁對霉菌的影響

圖3　　　不同糊米汁體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)基對霉菌的影響Fig.3　　　Effects of different diffirent fried-rice leachate content medium on mold number

將發(fā)霉的煙葉用無菌水制備成霉菌孢子懸浮液，吸取等量孢子懸浮液涂于含糊米汁10%、20%、30%和40%的霉菌瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)；吸取等量霉菌孢子懸浮液添加到含0～40%糊米汁的100 mL霉菌液態(tài)培養(yǎng)基中(500 mL三角瓶)，于搖瓶培養(yǎng)箱中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)液過濾烘干后稱菌體質(zhì)量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，不同濃度糊米汁瓊脂培養(yǎng)基中長出的霉菌菌落數(shù)基本一致，說明糊米汁本身在固態(tài)培養(yǎng)中對霉菌沒有明顯的抑制作用。不同濃度糊米汁液態(tài)培養(yǎng)后霉菌菌體量相差很小，說明糊米汁液態(tài)培養(yǎng)對霉菌沒有明顯的抑制作用。

由前面實(shí)驗(yàn)可知，糊米汁在煙葉堆積式發(fā)酵過程中對霉菌有明顯的抑制作用。這可能是糊米汁具有黏性，在堆積式發(fā)酵中會(huì)使煙葉相互黏結(jié)在一起，阻礙了O2的傳遞，從而抑制了霉菌的生長。為了驗(yàn)證這一推論，設(shè)計(jì)不同煙葉填充度進(jìn)行發(fā)酵，稱取30～90 g煙葉，噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%糊米汁，裝入500 mL三角瓶中，于培養(yǎng)箱中30 ℃發(fā)酵，測定了糊米汁發(fā)酵煙葉過程中開始發(fā)霉的時(shí)間，結(jié)果如圖4所示。

圖4　　　填充度對發(fā)酵過程中煙葉開始發(fā)霉時(shí)間的影響Fig.4　　　Effects of different filling degree on　　　moldy time of tobacco leaves

由圖4可見，當(dāng)填充度為30 g時(shí)，糊米汁發(fā)酵與對照組同時(shí)發(fā)霉，說明在物料比較松散的情況下，糊米汁對霉菌沒有抑制作用。當(dāng)填充度為60 g和90 g時(shí)，糊米汁發(fā)酵比對照組發(fā)霉時(shí)間分別延遲1和2 d，說明在物料壓緊的情況下糊米汁對霉菌有明顯的抑制作用。糊米汁在物料壓緊的情況下使煙葉相互黏結(jié)在一起，阻礙了O2的傳遞，進(jìn)而抑制了霉菌的生長。

2.2.2糊米汁對煙葉細(xì)菌的影響

由前面實(shí)驗(yàn)可知，糊米汁對煙葉好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌有明顯的抑制作用，筆者利用糊米汁液態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)來驗(yàn)證糊米汁對好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌的抑制作用，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：不同濃度的糊米汁培養(yǎng)基pH也不同(糊米汁本身的pH在3.8左右)，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)也探究了糊米汁本身的pH是否是抑制細(xì)菌的一個(gè)因素。

圖5　　　不同糊米汁含量對培養(yǎng)基pH的影響Fig.5　　　Effect of diffirent fried-rice leachate　　　 content on medium pH

將上部煙葉剪成碎片，取煙葉碎片10.0 g于盛有100 mL無菌水的三角瓶中，37 ℃振蕩20 min，制成菌懸液，將菌懸液稀釋適當(dāng)倍數(shù)涂布于含有0～25%糊米汁的細(xì)菌培養(yǎng)基平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)；取菌懸液1 mL接種于含0～25%糊米汁的細(xì)菌培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液涂平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),結(jié)果如圖6～7所示。

圖6　　　不同糊米汁含量培養(yǎng)基對好氧細(xì)菌的影響Fig.6　　　Effects of different fried-rice leachate content medium on aerobic bacteria number

圖7　　　不同糊米汁含量培養(yǎng)基對厭氧細(xì)菌的影響Fig.7　　　Effects of different diffirent fried-rice leachate content medium on anaerobic bacteria number

由圖6～圖7可見：糊米汁固態(tài)和液態(tài)培養(yǎng)對煙葉好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌均有非常明顯的抑制作用；自然pH與pH 7.2的糊米汁固態(tài)培養(yǎng)基對煙葉好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌均沒有顯著變化，說明糊米汁的酸性因素在固態(tài)發(fā)酵過程中對煙葉細(xì)菌沒有明顯的抑制作用，自然pH糊米汁液態(tài)培養(yǎng)后煙葉好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌的種群數(shù)量少于pH 7.2的糊米汁液態(tài)培養(yǎng)，說明糊米汁的酸性因素在液態(tài)培養(yǎng)中對煙葉細(xì)菌有一定的抑制作用，但pH 7.2時(shí)的糊米汁對細(xì)菌的抑制作用仍然隨著糊米汁含量的增加而加強(qiáng)，說明糊米汁除了pH因素外，還有其他因素對細(xì)菌有抑制作用。

2.2.3糊米汁抑制酵母的研究

圖8　　　不同糊米汁含量培養(yǎng)基對酵母的影響Fig.8　　　Effects of different diffirent fried-rice leachate content medium on yeast number

煙葉中只發(fā)現(xiàn)一種呈紅色的酵母。將該酵母接種于盛有100 mL酵母液態(tài)培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h制成酵母種子液，種子液稀釋適當(dāng)倍數(shù)分別涂布于含0～40%糊米汁酵母瓊脂培養(yǎng)基平板中，30 ℃培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)；取種子液1 mL接種于含0～40%糊米汁液態(tài)培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，分別涂布于含0～40%糊米汁酵母瓊脂培養(yǎng)基平板中，30 ℃培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù),結(jié)果如圖8所示。由圖8可見，糊米汁固態(tài)和液態(tài)培養(yǎng)對煙葉酵母均沒有明顯的抑制作用，這與2.1.3節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不一致的。糊米汁在堆積式發(fā)酵中對酵母的抑制作用原理可能與抑制霉菌的原理是一樣的。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步設(shè)計(jì)不同煙葉填充度進(jìn)行發(fā)酵，稱取30～90 g煙葉，噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%糊米汁，裝入500 mL三角瓶中，于培養(yǎng)箱中30 ℃發(fā)酵96 h后測定酵母的種群數(shù)量，結(jié)果如圖9所示。

圖9　　　不同填充度發(fā)酵過程中煙葉酵母種群數(shù)量的影響Fig.9　　　Effects of different filling degree on　　　yeast number on the tobacco leaves

由圖9可見，填充度越高，酵母的種群數(shù)量越少，說明O2的傳遞會(huì)明顯的影響酵母的生長。在相同填充度條件下，糊米汁發(fā)酵比水發(fā)酵的酵母種群數(shù)量明顯少。這可能是由于糊米汁的黏性，使煙葉相互黏結(jié)在一起，使物料間O2的傳遞比對照組(加水)慢，從而更加抑制了酵母的生長。

2.3結(jié)論

通過研究糊米汁框發(fā)酵和糊米汁培養(yǎng)過程中煙葉微生物的變化，初步確定了糊米汁對煙葉微生物的作用：糊米汁對煙葉的好氧細(xì)菌、厭氧細(xì)菌有非常明顯的抑制作用，糊米汁用量越多，抑制作用越明顯；糊米汁本身對霉菌和酵母沒有明顯的抑制作用，但在堆積式固態(tài)發(fā)酵過程中卻表現(xiàn)出了抑制霉菌和酵母的作用，這主要是糊米汁具有黏性，可以使煙葉相互黏結(jié)，阻礙了O2的傳遞進(jìn)而抑制了霉菌和酵母的生長。

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(責(zé)任編輯管珺)

Effect of roasted-rice leachate on tabacco microorganismsduring fermentation process

LI Shilin1,WANG Yijun1,ZHANG Bobo1,TANG Zhaoqi2,XU Ganrong1

(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2. Shanghai Tobacco Group Co. Ltd.,Shanghai 200082,China)

Abstract：Microbial changes in tobacco leaves during roasted-rice leachate fermentation were studied,to reveal the impact of roasted-rice leachate on tobacco microbial fermentation, both in liquid culture and solid-state culture. Roasted-rice leachate inhibited aerobic and anaerobic bacteria. The more roasted-rice leachate used,the more inhibition observed. Roasted-rice leachate itself did not inhibit mold and yeast,but it showed to suppress the growth of mold and yeast during stacked solid state fermentation process. The phenomenon might be caused by the extraordinary viscosity of fried-rice leachate,which could hinder the oxygen transfer and thus inhibit the growth of aerobic molds.

Keywords：roasted-rice leachate;tobacco leaves;microorganism;fermentation

中圖分類號(hào)：Q93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2016)02-0041-06

作者簡介：李士林(1987—)，男，山東臨沂人,研究方向：發(fā)酵工學(xué)；許贛榮(聯(lián)系人)，教授，E-mail:grxu123@126.com

基金項(xiàng)目：上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目(SZBCW201000744)

收稿日期：2014-02-26

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.008