王鵬胤，高　遠，高浩峰，胡　南

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800)

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M.hydrocarbonoclasticusNY4中N2OR的酶活測定及環(huán)境因素對酶活力的影響

王鵬胤，高遠，高浩峰，胡南

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800)

摘要：氧化亞氮(N2O)是一種主要的溫室氣體，其生物學減量控制已經成為研究熱點。在自然環(huán)境中，氧化亞氮還原酶(N2OR)是唯一能將N2O還原成N2的酶。以1株能在高鹽條件下進行厭氧及好氧反硝化作用的海桿菌Marinobacter hydrocarbonoclasticus NY4為研究對象，建立了一種穩(wěn)定的N2OR酶活檢測方法，考察了pH、鹽質量分數以及碳氮比(C/N)等環(huán)境因素對N2OR酶活力的影響。結果發(fā)現：當pH為7時、鹽質量分數為6%～8%、C/N為8時，N2OR呈現出了最高的酶活。本實驗結果豐富了對N2OR酶學特征的了解，為N2O生物減量控制提供了部分參考。

關鍵詞：pH；鹽濃度；C/N；N2OR

氧化亞氮(N2O)是6種主要的溫室氣體之一，由它產生的溫室效應為CO2的320倍[1]。超過2/3的N2O源于土壤生態(tài)圈的氮素循環(huán)過程[2-3]，

氧化亞氮還原酶(N2OR)是唯一能將N2O還原成N2的生物酶，在很多具有反硝化功能的微生物中都證實了它的存在[4-6]。關于氧化亞氮還原酶的酶學性質，目前研究甚少，其中Ferrettl等[7]和Dell′Acqua等[8-9]分別從Alcaligenesxylosoxidans和Marinobacterh￣y￣d￣r￣o￣c￣a￣r￣b￣o￣n￣o￣c￣l￣a￣s￣t￣i￣c￣u￣s617的細胞培養(yǎng)物中直接分離出了N2OR，并對其生化性質進行了研究，他們提出反應體系中銅離子的存在及銅離子價態(tài)差異對酶活性有重大影響；Liu等[10]將源于GeobacillusthermodenitrificansNG80-2的N2OR編碼基因在大腸桿菌中實現了外源表達，但酶活較低；Shen等[11]將PseudomonasstutzeriZoBellATCC 14405中的N2OR編碼基因導入了煙草植物，發(fā)現植入N2OR編碼基因的植株具有更好的N2O還原能力。

筆者所在實驗室成員從鹽城市新灘鹽場分離到了1株高效的反硝化細菌海桿菌M.h￣y￣d￣r￣o￣c￣a￣r￣b￣o￣nocla￣s￣t￣i￣c￣u￣sNY4，發(fā)現其能在厭氧及好氧條件下完成快速的反硝化反應，反硝化終端產物均為N2，而其底物生長范圍廣泛，能在1%～15%的鹽濃度條件下生長，因此該菌具有重要的理論研究價值和應用前景[12]。擬考慮到環(huán)境中影響N2O排放的主要因素是C/N和pH[13-14]以及M.hydrocarbonoclasticusNY4是一種耐鹽的海洋微生物，因此，本實驗考察了碳氮比(C/N)、pH以及鹽濃度對N2OR酶活力的影響,并建立以細胞裂解液測定N2OR酶活的方法。

1材料與方法

1.1材料

菌株M.hydrocarbonoclasticusNY4篩選自江蘇省鹽城市的新灘鹽場。

活化培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏 5，蛋白胨 10，NaCl 80，KCl 5，MgSO4·7H2O 2.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，CuSO4·5H2O 0.2。

1.2N2OR粗酶液制備

將NY4菌種從凍存管中取出，在活化培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后按1%的接種量(體積分數)轉接到100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)12 h，將獲得的M.h￣y￣d￣r￣o￣c￣a￣r￣b￣o￣n￣o￣c￣l￣a￣s￣t￣i￣c￣u￣sNY4菌液靜置24 h，離心收集菌體，重懸于5 mL濃度為20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，超聲波法進行細胞破碎(振幅25%、頻率10 Hz、10 min)，高速離心后取上清，即得粗酶液5 mL。粗酶液用0.45 μm的水系過濾后，保存在充滿氣體He的西林瓶中。

1.3N2OR酶活的測定

酶活測定方法在文獻[9]的基礎上進行改進，向容量為3.5 mL的比色皿中加入20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)1.5 mL、10 mmol/L的甲基紫精溶液0.2 mL，酶液0.1 mL，比色皿密封后反復進行抽真空和充He處理，用少量的704硅膠封住針孔，以確保比色皿在測定過程中維持厭氧狀態(tài)。用微量注射器向比色皿中注入適量現配濃度為50 mmol/L的連二亞硫酸鈉溶液，后者與甲基紫精形成藍色中間體，使得混合反應液在600 nm處的吸光值(A600值)保持在1.0～1.2，相對穩(wěn)定。向比色皿中注入0.1 mL的N2O飽和溶液，啟動酶催化反應，在N2OR的催化作用下，甲基紫精與連二亞硫酸鈉的藍色中間體作為電子供體向N2O提供還原性電子，同時褪去藍色，混合反應液的A600值也隨之降低，A600斜率降低幅度反映了N2OR酶催化反應的速率。分光光度計記錄5 min內每隔10 sA600的變化(加入前1 min與加入后4 min)，繪制A600值的變化曲線，并計算斜率，前1 min內的曲線斜率在-0.02～0.01之間為有效數據，后4 min的斜率為這段時間的平均斜率，在數值上，酶活力=(-斜率)/11.4。N2O飽和溶液采用N2O氣體向雙蒸水中持續(xù)鼓泡0.5 h的方法獲得[15]。甲基紫精的消光系數為11.4 mmol/(L·cm)[16]。

1.4環(huán)境因素對N2OR酶活的影響

配制不同環(huán)境條件下的發(fā)酵培養(yǎng)基，按1%的接種量將活化后的菌株NY4分別接入其中，在30 ℃轉速為200 r/min的條件下過夜培養(yǎng)。然后，分別取1 mL菌液，在波長為600 nm處測定吸光值A600，作為細菌生長量的參考。剩余的菌液按照酶活測定方法，測定N2OR酶活。

1.4.1pH對N2OR酶活的影響

配制5份100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，用HCl和NaOH調節(jié)其pH分別為6、7、8、9和10。此時，鹽質量分數為2%，C/N為10。

1.4.2鹽質量分數對N2OR酶活的影響

配制6份NaCl質量分數分別為0、2%、4%、6%、8%和10%的發(fā)酵培養(yǎng)基各100 mL。此時pH為7，C/N為10。

1.4.3C/N對N2OR酶活的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中的總氮為3 000 mg/L，化學需氧量(COD)為30 g/L，C/N為10，通過添加NaNO3作為無機氮調節(jié)培養(yǎng)基的C/N分別至3、4、5、6、7、8、9和10，每份配制100 mL。此時的pH為7，鹽質量分數為2%。

2結果與討論

2.1海桿菌NY4的N2OR酶活測定

根據實驗方法制取菌株 NY4的粗酶液，以不具有N2OR酶活的大腸桿菌作為陰性對照。反應過程中的A600值變化曲線如圖1所示。由圖1可知：在5 min的測定過程中，含有N2OR酶活的NY4粗酶液使甲基紫精與連二亞硫酸鈉形成的藍色中間體褪色明顯，在反應的第1～2 min內尤為劇烈，表明此時大量的還原性電子從藍色中間體傳遞至N2O并將后者還原成N2，而不含有N2OR酶的大腸桿菌細胞裂解液幾乎不能催化N2O的還原反應。根據擬合直線的斜率計算出酶活：0.1 mL粗酶液的酶活為0.05 U，依此推算，5 mL粗酶液(100 mL菌液)中N2OR的總酶活為2.50 U。

圖1　　　測定N2OR酶活時A600的變化Fig.1　　　Changes of A600 in the assaying　　　of N2OR activity

N2OR對O2極為敏感，反應體系在整個測定過程中均要求維持厭氧狀態(tài)，包括混合溶液中的溶解氧也要去除干凈，因此，N2OR的酶活測定相對困難，Dell′acquq等[9]采用厭氧手套箱完成整個測定過程，由于常規(guī)分光光度計難以放置在實驗室小型厭氧手套箱內，因此筆者改進了測定方法，采用向封閉比色皿中混合溶液反復沖加氣體He的策略，有效地維持了其厭氧狀態(tài)，從而對N2OR的酶活進行了準確測定。

2.2pH對N2OR酶活性的影響結果

實驗設置了5個pH梯度，但當pH為6時，M.hydrocarbonoclasticusNY4生長狀況極差，因此沒有進行后續(xù)的酶活測定及分析。從圖2可以看出，菌體生長量及N2OR酶活在pH為7時均為最大，并隨著pH值的上升呈現同步下降現象，相對于菌體生長，酶活下降則更為明顯，尤其當pH為10時，N2OR酶活急劇下降。Dell′acquqa等[9]在研究中指出，N2OR對pH變化是敏感的，在堿性條件下能獲得更高的酶活。而在實驗結果中，酶活在pH為7的中性條件下達到最高，隨著堿性提高，N2OR酶活損失明顯，這與土壤環(huán)境中N2O的釋放規(guī)律是一致的，研究表明自然環(huán)境中N2O的排放通常與環(huán)境pH呈正相關關系[17]。

圖2　　　pH對菌體生長及N2OR酶活的影響Fig.2　　　Effects of pH on the cell growth　　　and N2OR activity

2.3鹽質量分數對N2OR酶活性的影響結果

M.hydrocarbonoclasticusNY4是一種海洋微生物，鹽質量分數對其生長代謝及反硝化能力都有影響[12]，結果如圖3所示，由圖3可知：菌體的最適生長鹽質量分數為2%，當鹽質量分數為8%時，菌體表現出最高的總氮去除能力。隨著鹽質量分數的增加，N2OR的酶活呈現上升趨勢。當鹽質量分數大于6%時，即使細胞生長受到抑制，但N2OR酶活穩(wěn)定在2.50 U左右，而當鹽質量分數低于4%時，酶活顯著降低，這個結果也部分解釋了前期實驗中發(fā)現的高鹽條件下獲得更高總氮去除率的現象。推測的原因有二：一是較高鹽條件下，N2OR編碼基因的轉錄表達量增加；二是高鹽條件下， N2OR具有更高的底物催化效率。具體原因有待后續(xù)實驗證實。

圖3　　　鹽質量分數對菌體生長及N2OR酶活的影響Fig.3　　　Effects of salinity on the cell growth　　　and N2OR activity

2.4C/N對N2OR酶活性的影響結果

N2OR的電子競爭力較弱，足夠的還原性電子有利于N2O的還原，而還原力是由碳源提供的，因此，C/N對N2OR的活性及N2O的排放有較大影響[13]。本實驗采用固定碳源改變氮源的方式研究C/N對N2OR酶活的影響，結果如圖4所示。由圖4可知：C/N對菌體生長影響較小，尤其是當C/N為4～9時，菌體生長平穩(wěn)；但C/N的變化對N2OR酶活影響明顯，當C/N小于8時，N2OR酶活隨著C/N的升高而增加，當C/N為8時酶活力達到峰值。

圖4　　　C/N對菌體生長及N2OR酶活的影響Fig.4　　　Effects of C/N on the cell growth　　　and N2OR activity

3結論

N2O的排放及減量控制受到了環(huán)境工作者越來越多的關注，而氧化亞氮還原酶是自然環(huán)境中唯一能直接將N2O還原為N2的生物酶。本實驗以一株源自海洋具備處理含鹽含氮廢水能力的細菌M.h￣y￣d￣r￣o￣c￣a￣r￣b￣o￣n￣o￣c￣l￣a￣s￣t￣i￣c￣u￣sNY4為研究對象，建立了氧化亞氮還原酶的酶活測試方法，考察了幾種主要的環(huán)境因素對N2OR酶活力的影響，結果表明，當pH 7時、鹽質量分數為6%～8%以及 C/N為8時，菌體細胞表現出了最大的N2OR活力。研究結果對M.hydrocarbonoclasticusNY4中N2OR的酶活及影響因素進行了真實的評價，也為這一類型反硝化細菌的后續(xù)應用提供了有力參考。

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(責任編輯周曉薇)

Determination and characterization of nitrous oxide reductase inMourinobacterhydrocarbonoclasticusNY4

WANG Pengyin,GAO Yuan,GAO Haofeng,HU Nan

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Abstract：Nitrous oxide (N2O) is a major greenhouse gas,and its biological reduction has become a hot topic. Nitrous oxide reductase (N2OR) is the only enzyme that can reduce N2O to N2 in natural environments. Marinobacter hydrocarbonoclasticus NY4,a halophilic bacterium with the ability of anaerobic and aerobic denitrification，was used in this study.We established a stable method to determine the activity of N2OR,and studied the influence of key environment factors on the activity of N2OR including pH value,salt concentration and carbon/nitrogen ratio (C/N). When pH was at 7,the salinity was 6% and C/N was 8,strain NY-4 exhibited the highest N2OR activity. The experimental data enriched the knowledge of the characteristics of N2OR,and provided some references for the biological reduction of N2O.

Keywords：pH; salinity; C/N; N2OR

中圖分類號：X701

文獻標志碼：A

文章編號：1672-3678(2016)02-0047-04

作者簡介：王鵬胤(1989—)，女，江蘇常州人，研究方向：分子微生物學；胡南(聯系人)，副教授，E-mail:hunan@njtech.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(31270162)

收稿日期：2015-04-13

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.009