ITUZE KUBANA Marie Claudine，喬郅鈉，徐美娟，陳旭升，楊套偉，張顯，邵明龍，饒志明

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫，214122)

ε-聚賴氨酸是一種L-賴氨酸均聚物，主要由鏈霉菌屬和一些絲狀真菌分泌產(chǎn)生[1-2]。由于ε-聚賴氨酸具備易被生物降解、可食用、對(duì)人體和環(huán)境無毒無害等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[3-5]。近幾年，人們對(duì)ε-聚賴氨酸的研究也越來越多，但大多都是針對(duì)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化(包括培養(yǎng)基優(yōu)化[6]、營養(yǎng)物質(zhì)流加[7]、pH調(diào)控[8]等)和菌株育種改造(物理和化學(xué)誘變[9-10]、核糖體工程[11]、等離子誘變和基因組改組[12])等策略來改善ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量。利用白色鏈霉菌直接進(jìn)行發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)是最為常用的方法，如REN等利用發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和兩階段pH控制策略，對(duì)Streptomycessp.M-Z18進(jìn)行5 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵192 h，其ε-聚賴氨酸產(chǎn)量高達(dá)54.7 g/L[8]。雖然其ε-聚賴氨酸產(chǎn)量很高，但發(fā)酵周期長，且發(fā)酵液成分復(fù)雜，不利于ε-聚賴氨酸的分離純化。

利用全細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)已成為一種趨勢(shì)，這種方法成本低、易操作，而且副產(chǎn)物少、有利于分離純化。目前，ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)菌株大多是白色鏈霉菌，白色鏈霉菌是非食品安全性菌株，而ε-聚賴氨酸主要用于食品和醫(yī)藥行業(yè)，故其產(chǎn)品安全性問題令人堪憂[13-14]?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)是一種經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的GRAS菌株，常用作細(xì)胞工廠進(jìn)行重組蛋白、氨基酸和化學(xué)品等的生產(chǎn)[15-16]，且目前僅有一項(xiàng)研究是利用Bacillussubtilis進(jìn)行ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)，其產(chǎn)量僅達(dá)76.3 mg/L[17]。

考慮到ε-聚賴氨酸產(chǎn)品的安全性問題，本研究克隆了經(jīng)密碼子優(yōu)化的白色鏈霉菌Streptomycesalbulus來源的ε-聚賴氨酸合酶編碼基因pls，成功實(shí)現(xiàn)了ε-聚賴氨酸合酶在食品安全性菌株Bacillussubtilis168中的異源表達(dá)，獲得了B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株。針對(duì)B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株全細(xì)胞催化生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的催化體系進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，在L-賴氨酸產(chǎn)量為0.5 g/L, 初始pH和溫度分別為3.0和30 ℃條件下，轉(zhuǎn)化4 h，ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量達(dá)到195.1 mg/L，遠(yuǎn)高于已報(bào)道的B.subtilis直接發(fā)酵生產(chǎn)的ε-聚賴氨酸產(chǎn)量。本研究構(gòu)建的全細(xì)胞催化體系為食品級(jí)ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)提供了一種新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究中所用到的菌株EscherichiacoliJM109、Bacillussubtilis168、MycobacteriumneoaurumVKM Ac-1815D以及質(zhì)粒pMA5，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏；pET28a-pls質(zhì)粒，蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

NdeI、BamH I限制性內(nèi)切酶和10 000 bp核酸marker等，大連寶生物公司；高保真酶、同源重組酶克隆試劑盒，南京諾維贊生物科技有限公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；L-賴氨酸和ε-聚賴氨酸，Sigma公司；二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、洗滌劑NP-40和BHI培養(yǎng)基，上海阿拉丁有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與緩沖液

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，固體培養(yǎng)基則加入1.5%～2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉，根據(jù)需要加入相應(yīng)濃度的抗生素。

M3G發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60、酵母提取物10.5、(NH4)2SO415、K2HPO23.5、MgSO4·7H2O 1.25、ZnSO4·7H2O 0.1和FeSO4·7H2O 0.02。

BHI培養(yǎng)基：根據(jù)配方說明,按照36.5 g/L進(jìn)行配置。

緩沖液A：100 mmol/L Tris-HCl，20%甘油(體積分?jǐn)?shù))，2 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，0.2 mol/L NaCl和5 mmol/L DTT，pH 8.0。

緩沖液B：50 mmol/L Tris-HCl，20% 甘油(體積分?jǐn)?shù)), 1 mol/L NaCl和 5 mmol/L DTT，pH 8.0。

緩沖液C：10 mmol/L 三羥甲基甲胺基丙磺酸(N-[Tris(hydroxymethyl)metyl]-3-aminopropanesulfonic acid,TAPS)-NaOH， 5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L 腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)， 0.1 mmol/L DTT，2 g/L NP-40， 10%甘油(體積分?jǐn)?shù))，pH 8.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ε-聚賴氨酸合酶編碼基因pls的克隆

將NCBI數(shù)據(jù)庫查詢到的S.albulus來源的ε-聚賴氨酸合酶編碼基因pls序列提交至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行合成，并進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以利于其在B.subtilis168的異源表達(dá)。

以公司提供的pET28a-pls重組質(zhì)粒為模板，以pls-F:aaaaggagcgatttacatatgatgagtagtccgctgctggaga和pls-R:gagctcgactctagaggatccttatgctgctgcgccaccctcg為引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，獲得含同源臂的pls基因片段。

1.2.2 重組菌株的構(gòu)建

將膠回收純化的pls基因片段與經(jīng)NdeI、BamH I限制性快切酶酶切且膠回收獲得的pMA5線性化質(zhì)粒在37 ℃下同源重組連接30 min，獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布至含質(zhì)量濃度50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)8～12 h。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送蘇州金唯智有限公司進(jìn)行測序分析，SnapGene 2.3.2軟件分析測序結(jié)果，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pMA5-pls。

將重組質(zhì)粒pMA5-pls轉(zhuǎn)化B.subtilis168感受態(tài)細(xì)胞，涂布至含質(zhì)量濃度50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)8～12 h。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組菌株命名為B.subtilis168/pMA5-pls。

1.2.3 ε-聚賴氨酸合酶的表達(dá)

首先，將凍干管保存的B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株在含質(zhì)量濃度50 μg/mL卡那霉素的LB平板上劃線活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接10 mL的LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)8～12 h后，按10%接種量轉(zhuǎn)接50 mL的M3G發(fā)酵培養(yǎng)基(含質(zhì)量濃度50 μg/mL卡那霉素)，30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)72 h，以誘導(dǎo)ε-聚賴氨酸合酶的表達(dá)。之后，在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，細(xì)胞菌體用10 mL緩沖液A清洗懸浮后，4 ℃、10 000 r/min下離心20 min，棄去上清液。再換用等量緩沖液B清洗懸浮，4 ℃、8 000 r/min下離心5 min，棄去上清液。最后，將細(xì)胞菌體懸浮于5 mL緩沖液C中并用超聲破碎儀進(jìn)行破碎，破碎液在4 ℃下離心20 min，收集上清，用于后續(xù)的酶活測定，蛋白濃度測定采用Bradford法[18-19]。對(duì)照菌株B.subtilis168按照同樣的方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.4 酶活測定

ε-聚賴氨酸合酶的酶活測定體系[20-22]：100 nmol/L、pH 8.5的TAPS-NaOH，990 mmol/LL-賴氨酸，5 mmol/L MgCl2，5 mmol/L ATP，1 mmol/L DTT，20%甘油(體積分?jǐn)?shù))，2 g/L NP-40和占總體積10%的酶溶液。

首先，將不含粗酶液的反應(yīng)混合物在30 ℃下孵育10 min，然后加入反應(yīng)總體系10%的粗酶液啟動(dòng)酶反應(yīng)，反應(yīng)10 min后，在酶反應(yīng)體系中加入質(zhì)量濃度150 g/L三氯乙酸溶液以終止反應(yīng)。

配置不同質(zhì)量濃度的ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(25～200 mg/L)，各取1 mL不同濃度的ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到2.8 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mmol/L、pH 7.0)中，再添加120 μL臺(tái)盼藍(lán)溶液(1 mg/mL)，充分混合并在37 ℃下孵育60 min，測定A580[23]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照同樣的操作方法，將1 mL轉(zhuǎn)化液加入到2.8 mL 磷酸鹽緩沖液(0.1 mmol/L、pH 7.0)中，并添加120 μL臺(tái)盼藍(lán)溶液(1 mg/mL)，充分混合并在37 ℃下孵育60 min，測定A580。酶活定義為1 min生成1 μmol的ε-聚賴氨酸所需的酶量為1 U。ε-聚賴氨酸含量的計(jì)算則通過將測得的A580代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程來確定。

1.2.5 ε-聚賴氨酸的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析

將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析，以確定轉(zhuǎn)化液中是否生成ε-聚賴氨酸，并將所得數(shù)據(jù)利用MassLynx 4.1 SCN 562/SCN 568軟件計(jì)算ε-聚賴氨酸的分子質(zhì)量[24-26]，并判斷產(chǎn)物ε-聚賴氨酸的聚合狀態(tài)。

1.2.6 全細(xì)胞催化生產(chǎn)ε-聚賴氨酸

將凍干管保存的B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株首先在含質(zhì)量濃度50 μg/mL卡那霉素的LB平板上劃線活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接10 mL的LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)8～12 h后，轉(zhuǎn)接250 mL的M3G發(fā)酵培養(yǎng)基(含質(zhì)量濃度50 μg/mL卡那霉素)，30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)72 h，4 ℃、10 000 r/min下離心10 min以收集菌體細(xì)胞。取25 mg的L-賴氨酸投加至50 mL緩沖液C中使轉(zhuǎn)化體系中L-賴氨酸終質(zhì)量濃度為0.5 g/L，然后再在轉(zhuǎn)化體系中投加5 g細(xì)胞菌體并充分混合，最后，于30 ℃、200 r/min下連續(xù)轉(zhuǎn)化4 h，測定轉(zhuǎn)化液中ε-聚賴氨酸的含量。

1.2.7 抗菌活性檢測

將大腸桿菌(E.coliJM109)和新生分枝桿菌(MycobacteriumneoaurumVKM Ac-1815D)分別接種到LB和BHI培養(yǎng)基中，分別置于37 ℃和30 ℃下培養(yǎng)12 h。將取適量獲得的菌液分別涂布于LB和BHI固體平板，并在平板中間加入含有200 μL的重組菌株B.subtilis168/pMA5-pls轉(zhuǎn)化液，最后，分別置于37 ℃培養(yǎng)24 h和30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察有無明顯抑菌圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 B. subtilis 168/pMA5-pls重組菌株的構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，白色鏈霉菌來源的基因GC偏高，這可能不利于其在其他宿主細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)[27]。于是，我們對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫查詢到的白色鏈霉菌S.albulus來源的ε-聚賴氨酸合酶編碼基因pls(GenBank: AB385841.1)的GC含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明其GC含量高達(dá)75%。因此，在pls基因合成過程中，對(duì)其密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，使其GC含量降低為58.21%，以期能夠成功實(shí)現(xiàn)在B.subtilis168中的異源表達(dá)。

如圖1所示，以pls-F和pls-R為引物，以pET28a-pls質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增獲得的pls基因片段，回收后的pls基因片段與pMA5線性化質(zhì)粒進(jìn)行同源重組連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109。重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證成功的送蘇州金唯智有限公司進(jìn)行測序分析，SnapGene 2.3.2軟件分析測序結(jié)果，測序正確的菌株命名為E.coliJM109/pMA5-pls。重組質(zhì)粒pMA5-pls轉(zhuǎn)化B.subtilis168感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證正確的重組菌株命名為B.subtilis168/pMA5-pls。

M，10 000 bp核酸Marker；A中泳道1～2，pMA5-pls重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證結(jié)果；B中泳道1～6，重組菌株B. subtilis168/pMA5-pls轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果A-雙酶切驗(yàn)證；B-菌落PCR驗(yàn)證

2.2 ε-聚賴氨酸合酶的表達(dá)與酶活測定

將B.subtilis168對(duì)照菌株與B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株按照1.2.3所述的方法進(jìn)行ε-聚賴氨酸合酶的誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)胞破碎離心收集的粗酶液進(jìn)行酶活測定，酶活測定結(jié)果顯示，B.subtilis168對(duì)照菌株中未檢測到ε-聚賴氨酸合酶酶活，而B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株中檢測到ε-聚賴氨酸合酶酶活，通過計(jì)算得出，ε-聚賴氨酸合酶的比酶活為71 U/mg，即ε-聚賴氨酸合酶在B.subtilis168中成功實(shí)現(xiàn)了功能性表達(dá)。

2.3 ε-聚賴氨酸的MALDI-TOF-MS分析

ε-聚賴氨酸的抑菌譜很廣，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌以及一些病毒都有較好的抑菌效果，而ε-聚賴氨酸的抑菌活性與L-賴氨酸的聚合度有關(guān)。當(dāng)L-賴氨酸的聚合度低于9時(shí)，ε-聚賴氨酸幾乎沒有抑菌活性，只有當(dāng)L-賴氨酸的聚合度高于9時(shí)，特別是聚合度為25～35，ε-聚賴氨酸具有較強(qiáng)的抑菌活性[2, 28]。

為了鑒定酶反應(yīng)產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物ε-聚賴氨酸，并確定ε-聚賴氨酸的聚合狀態(tài)和相對(duì)分子質(zhì)量。采用MALDI-TOF-MS對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖2所示，B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生成的ε-聚賴氨酸的相對(duì)分子質(zhì)量分布在3 605～4 502 Da，且主要集中于4 118 Da。根據(jù)賴氨酸的分子質(zhì)量，可知其對(duì)應(yīng)聚合度為25～30，主要為28，進(jìn)一步驗(yàn)證了ε-聚賴氨酸合酶在B.subtilis168中成功實(shí)現(xiàn)了功能性表達(dá)。

A-ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品;B-轉(zhuǎn)化液樣品

2.4 B. subtilis 168/pMA5-pls重組菌株全細(xì)胞催化生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的條件優(yōu)化

2.4.1 溫度對(duì)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)的影響

溫度主要通過影響酶活性進(jìn)而影響產(chǎn)物的生成。通過將5 g的B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株的菌體投入到添加質(zhì)量濃度0.5 g/L底物L(fēng)-賴氨酸的50 mL緩沖液C中，分別置于20、25、30、35、40、45和50 ℃，200 r/min下轉(zhuǎn)化4 h，檢測ε-聚賴氨酸含量，以確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化溫度。如圖3所示，在20～30 ℃，ε-聚賴氨酸含量隨著溫度的升高而升高，最優(yōu)溫度為30 ℃，ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到181.6 mg/L；但當(dāng)溫度超過30 ℃時(shí)，溫度越高，ε-聚賴氨酸含量不斷下降，特別是溫度為45 ℃時(shí)，ε-聚賴氨酸含量較35 ℃時(shí)的ε-聚賴氨酸下降了56.9%。由此可知，B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株全細(xì)胞催化生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的最優(yōu)溫度為30 ℃。

圖3 溫度對(duì)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)的影響

2.4.2 初始pH對(duì)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)的影響

將5 g的B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株的菌體投入到添加質(zhì)量濃度0.5 g/L底物L(fēng)-賴氨酸的不同pH的50 mL緩沖液C中，pH分別設(shè)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，于30 ℃、200 r/min下反應(yīng)4 h，檢測不同pH條件下ε-聚賴氨酸的含量。由圖4結(jié)果分析可知，pH為3.0時(shí)，ε-聚賴氨酸的含量最高，為185.9 mg/L。當(dāng)pH高于3.0時(shí)，ε-聚賴氨酸的含量不斷下降，pH為7.0時(shí)，ε-聚賴氨酸的含量僅為109.4 mg/L。由此可知，B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株全細(xì)胞催化生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的最優(yōu)pH為3.0。

圖4 初始pH對(duì)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)的影響

2.4.3 底物濃度對(duì)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)的影響

首先在pH 3.0的緩沖液C中投加不同質(zhì)量濃度的L-賴氨酸(0.1～1.0 g/L，質(zhì)量濃度間隔為0.1 g/L)，之后分別投加5 g的B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株的菌體，于30 ℃、200 r/min下反應(yīng)4 h，檢測不同L-賴氨酸質(zhì)量濃度下ε-聚賴氨酸的含量。由圖5可知，L-賴氨酸質(zhì)量濃度在0.1～0.5 g/L時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的升高，ε-聚賴氨酸的含量上升緩慢，但當(dāng)L-賴氨酸質(zhì)量濃度上升至0.5 g/L時(shí)，ε-聚賴氨酸的含量上升迅速，達(dá)到195.1 mg/L。而L-賴氨酸質(zhì)量濃度繼續(xù)提高時(shí)，ε-聚賴氨酸的含量卻不斷降低。由此可知，B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株全細(xì)胞催化生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的最優(yōu)底物質(zhì)量濃度為0.5 g/L。

圖5 不同L-賴氨酸質(zhì)量濃度對(duì)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)的影響

2.5 ε-聚賴氨酸的抗菌活性檢測

為了驗(yàn)證B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株全細(xì)胞催化L-賴氨酸產(chǎn)生的ε-聚賴氨酸是否具有抗菌活性。本研究以大腸桿菌E.coli和分枝桿菌M.neoaurumVKM Ac-1815D為研究對(duì)象，測試了反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌E.coli和分枝桿菌M.neoaurumVKM Ac-1815D的生長是否有影響。測試結(jié)果如圖6所示，E.coli形成的抑菌圈直徑約為13 mm，M.neoaurumVKM Ac-1815D形成的抑菌圈直徑約為12 mm。結(jié)果表明，全細(xì)胞催化生成的ε-聚賴氨酸能夠抑制E.coliJM109和M.neoaurumVKM Ac-1815D的生長，進(jìn)一步證實(shí)了ε-聚賴氨酸合酶成功實(shí)現(xiàn)了在B.subtilis168中的功能性表達(dá)，利用B.subtilis168/pMA5-pls重組菌株全細(xì)胞催化L-賴氨酸產(chǎn)生的ε-聚賴氨酸具有良好的抑菌效果。

A-ε-聚賴氨酸對(duì)E. coli JM109的抑菌效果;B-ε-聚賴氨酸對(duì)M.neoaurum VKM Ac-1815D的抑菌效果

3 討論

ε-聚賴氨酸是一種由25～35個(gè)L-賴氨酸通過異形肽鍵連接而成的較為特殊的陽離子氨基酸聚合物，由于其具備易降解、可食用、對(duì)人體和環(huán)境無毒無害等特性而廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[3-5]。盡管目前通過對(duì)白色鏈霉菌菌種選育結(jié)合發(fā)酵條件優(yōu)化策略，ε-聚賴氨酸產(chǎn)量已達(dá)到較高水平，但是，非GRAS菌株產(chǎn)生的ε-聚賴氨酸的安全性問題卻令人堪憂，這可能會(huì)限制其在食品和醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用[13-14]。SHIMA等曾通過14C放射性同位素標(biāo)記技術(shù)對(duì)L-賴氨酸進(jìn)行標(biāo)記，證實(shí)了L-賴氨酸是ε-聚賴氨酸生產(chǎn)的前體物質(zhì)[29]。然而，目前未有將ε-聚賴氨酸合酶異源表達(dá)，利用全細(xì)胞催化實(shí)現(xiàn)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)的相關(guān)研究、本文首次實(shí)現(xiàn)了ε-聚賴氨酸合酶在GRAS菌株B.subtilis168中的異源表達(dá)，并將其作為細(xì)胞工廠，全細(xì)胞催化實(shí)現(xiàn)了ε-聚賴氨酸的生物合成。

雖然本研究獲得的ε-聚賴氨酸的含量未達(dá)到較高水平，但是卻為食品級(jí)ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)提供了一種新策略。下一步，將會(huì)針對(duì)ε-聚賴氨酸合酶進(jìn)行理性改造，提高其催化活性，以進(jìn)一步改善ε-聚賴氨酸產(chǎn)量。