范曉燕，林方興，湯 瑩，楊勇驥

（第二軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)部生物物理學(xué)教研室暨電鏡中心，上海 200433）

電子顯微鏡從誕生之日起就受到世人矚目，經(jīng)過七十多年的發(fā)展，電子顯微鏡技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各科研、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對(duì)科研的發(fā)展及疾病的治療做出了極為重要的貢獻(xiàn)。電鏡室的工作人員主要負(fù)責(zé)電鏡制樣及觀察工作，但是取材必須是由研究生和科研人員親自操作，標(biāo)本取好、固定后送至電鏡室。在生物樣品的取材過程中容易出現(xiàn)的問題最多，取材不當(dāng)，會(huì)直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此，取材是整個(gè)樣品制備過程中的關(guān)鍵步驟之一。作為一名電鏡實(shí)驗(yàn)室的教師，指導(dǎo)學(xué)生正確取材的方法及培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手操作的能力是尤為重要的。

1 取材實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于透射電鏡實(shí)驗(yàn)所用試劑昂貴，費(fèi)用較大，實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)較長(zhǎng)，因此，周全的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是必不可少的。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，實(shí)驗(yàn)者首先需要明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，然后選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑，備齊實(shí)驗(yàn)器具，合理安排實(shí)驗(yàn)流程，并做好預(yù)實(shí)驗(yàn)工作，以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)性。實(shí)驗(yàn)時(shí)，還必須嚴(yán)格設(shè)立對(duì)照組。不僅要有正常對(duì)照，有時(shí)還應(yīng)設(shè)立和實(shí)驗(yàn)組相同條件的對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的動(dòng)物必須在相同條件下取材，在時(shí)間上盡量同步，采用相同的緩沖和固定液，取材部位完全相同，以增加實(shí)驗(yàn)的可靠性。此外，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還應(yīng)該具有一定的數(shù)量，得出的結(jié)論才較為可靠及有利于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析［1］。

1.2 器械及試劑的準(zhǔn)備

取材前應(yīng)準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)器械及試劑：直彎剪各一把、大小鑷子各一把、止血鉗若干、雙面刀片、卡片紙或玻璃皿、冰臺(tái)、青霉素小瓶、各種預(yù)冷的緩沖液及固定液等。

不同的電鏡技術(shù)所需試劑是不同的。如緩沖液的使用，常規(guī)電鏡技術(shù)一般使用磷酸緩沖液；電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)一般使用二甲砷酸鹽緩沖液［2］。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并在有資格認(rèn)定的部門購(gòu)買，同時(shí)應(yīng)飼養(yǎng)在和其品級(jí)相應(yīng)條件的環(huán)境下，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能得不到承認(rèn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還應(yīng)避免從遠(yuǎn)處運(yùn)來因外界環(huán)境因素的改變而發(fā)生的生理狀態(tài)的變化。

2 取材時(shí)的注意事項(xiàng)

2.1 取材的要點(diǎn)

取材是電鏡生物樣品制備的第一步，也是十分重要的一步。為了保證取材位置的準(zhǔn)確性，取材必須由每個(gè)實(shí)驗(yàn)者親自操作。取材時(shí)需要注意的要點(diǎn)是：快、冷、小、凈、準(zhǔn)、避免機(jī)械損傷［2］。

快：取材應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血流還未停止時(shí)就快速取材。因?yàn)榻M織一旦缺血，細(xì)胞就會(huì)處于缺氧狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)的溶酶體會(huì)釋放一些酶使細(xì)胞自溶，從而破壞細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。因此，組織一旦離體就應(yīng)立刻固定。最好在1min之內(nèi)浸泡于固定液中。

冷：為了降低酶活性，減少細(xì)胞自溶，取材的環(huán)境溫度應(yīng)盡量保持低溫。組織離體后，需在冰臺(tái)上切小塊，冰臺(tái)上需覆蓋一層厚卡紙或玻璃皿，以避免組織與冰直接接觸，造成冰晶的形成，影響后續(xù)電鏡觀察。操作時(shí)所用固定液和緩沖液需要預(yù)冷為4°。

小：由于固定液滲透速度緩慢的影響，組織塊需切成小于1mm3的立方體小塊或截面為1mm2長(zhǎng)方體。通常情況下，無方向性的組織，如肝臟、腎臟、肺臟等，切成立方體小塊，有方向性的組織，如皮膚、腸、神經(jīng)、肌肉等，切成長(zhǎng)方體小塊。

凈：盡量避免將血液或組織液帶入固定液中，影響固定液的濃度及Ph值。沖洗組織塊可用緩沖液或生理鹽水，忌用自來水直接沖洗。

準(zhǔn)：取材部位一定要精確。電鏡制樣要求組織塊很小，電鏡觀察的視野更小，因此，要根據(jù)需要觀察的內(nèi)容，選擇具體的取材部位。比如腎臟中皮質(zhì)和髓質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)是不同的，若要觀察腎小球的結(jié)構(gòu)就必須取皮質(zhì)部分的組織。

避免機(jī)械損傷：取材時(shí)，動(dòng)作要輕柔，刀片要鋒利，切割時(shí)避免來回牽拉，以防止發(fā)生機(jī)械損傷。避免由于人為因素造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假象。

2.2 取材的具體過程

將預(yù)冷的固定液滴在冰臺(tái)上的卡紙或玻璃皿上，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行麻醉或頸椎脫臼。打開胸腔或腹腔，暴露所需器官，在血流未完全停止前剪取需要的組織塊，用預(yù)冷的緩沖液或生理鹽水將血液及組織液沖洗凈，迅速放在卡紙或玻璃皿上的固定液中，用雙面刀片將剪刀和鑷子剪過或夾過的部分切掉，然后按要求切成小塊移入裝有固定液的小瓶中，貼好標(biāo)簽，置于4°保存。一些特殊樣品的取材方法：如腦、脊髓、視網(wǎng)膜組織需要灌流固定后再取材；懸浮細(xì)胞及菌類收集到離心管中，以1500rpm／min的速度離心5min，然后加入固定液重懸后4°固定；在收集貼壁培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，如使用胰酶消化細(xì)胞，將會(huì)使細(xì)胞鏈打開，細(xì)胞骨架將會(huì)發(fā)生改變。因此需使用細(xì)胞刮子將細(xì)胞輕輕從培養(yǎng)皿中刮下后，用吸管收集到離心管中進(jìn)行固定。

3 提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力

通過帶領(lǐng)學(xué)生參觀實(shí)驗(yàn)室，觀摩了解醫(yī)學(xué)生物樣品的前期準(zhǔn)備、中期制備、后期觀察等一系列的電鏡生物樣品制備過程；鼓勵(lì)學(xué)生課后多查文獻(xiàn)，而后組織學(xué)生在帶教教師的指導(dǎo)下，開展實(shí)踐性的實(shí)驗(yàn)課，自己動(dòng)手，進(jìn)行實(shí)際操作，增強(qiáng)學(xué)生的感性認(rèn)知。最后，小組間學(xué)生相互討論，系統(tǒng)總結(jié)。實(shí)驗(yàn)操作中的真實(shí)感受可使學(xué)生興趣大增，而且看到了生物電子顯微鏡相關(guān)研究的廣闊應(yīng)用前景，更能夠激發(fā)學(xué)生強(qiáng)烈的探索欲望［3］。

科研離不開實(shí)驗(yàn)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)者來說，動(dòng)手能力更是不可缺少的素質(zhì)之一。動(dòng)手能力不只是實(shí)驗(yàn)操作能力，還包括對(duì)所用實(shí)驗(yàn)方法及儀器的原理的掌握、實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)等能力。理解掌握實(shí)驗(yàn)方法的原理和所用儀器的原理是最基本的，只有熟悉這些原理，才能更好地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，更靈活地使用儀器，甚至更好地開發(fā)儀器的功能。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，不斷完善實(shí)驗(yàn)方案，這些工作也有助于不斷強(qiáng)化動(dòng)手能力［4］。由于電鏡生物樣品取材所包含的操作技能特別多，要求又特別精細(xì)。為了真正做到培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作技能，實(shí)驗(yàn)課應(yīng)讓他們?nèi)巳藙?dòng)手，個(gè)個(gè)過程都要參與體會(huì)。在實(shí)驗(yàn)過程中，教師要求學(xué)生邊解剖邊思考不同的組織器官在取材時(shí)的特點(diǎn)及存在的差別。讓學(xué)生在問題中尋找答案，在思考中進(jìn)行動(dòng)手操作。每到取材的關(guān)鍵之處，教師要給與精心指導(dǎo)，并嚴(yán)格把關(guān)。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，出現(xiàn)的錯(cuò)誤都必須及時(shí)給予糾正。總結(jié)出在取材過程中出現(xiàn)的一些問題，及解決問題的方案。

4 提高教師的業(yè)務(wù)素質(zhì)及指導(dǎo)水平

教師的業(yè)務(wù)素質(zhì)和指導(dǎo)水平對(duì)于學(xué)生的培養(yǎng)起著不可忽視的作用。因此，教師需要不斷地學(xué)習(xí)新知識(shí)、新技術(shù)，不斷地完善自己的知識(shí)結(jié)構(gòu)。教師自我素質(zhì)的提高、知識(shí)更新，有利于提高教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)高素質(zhì)的醫(yī)學(xué)人才。在實(shí)驗(yàn)課教學(xué)時(shí)，一位優(yōu)秀的教師除了自己具備較強(qiáng)的技術(shù)操作能力外，還要注意加強(qiáng)指導(dǎo)能力和方法的訓(xùn)練［4］。在指導(dǎo)學(xué)生取材時(shí)，要因材施教，做到以學(xué)生為主，鼓勵(lì)學(xué)生主動(dòng)思考，教師從旁協(xié)助，在關(guān)鍵地方給予引導(dǎo)。

總之，生物樣品的取材是透射電鏡樣品制備的第一步，標(biāo)本的質(zhì)量好壞，直接影響到電鏡觀察的效果和臨床病理診斷的正確性。如果實(shí)驗(yàn)者設(shè)計(jì)不合理，操作不規(guī)范，將直接導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作是徒勞的，并造成實(shí)驗(yàn)費(fèi)用和時(shí)間上的浪費(fèi)。因此在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，教師應(yīng)注重把學(xué)生的能力培養(yǎng)放在首位，樹立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，提高每位學(xué)生的動(dòng)手能力，掌握取材的正確方法，才能做到萬無一失，達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果。

［1］曲淑賢，呂廣艷，高船舟，等.指導(dǎo)研究生電鏡取材的體會(huì)［J］.醫(yī)學(xué)信息，2010，23（1）：48－49.

［2］楊勇驥.醫(yī)學(xué)生物電子顯微鏡技術(shù)［M］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2012：73－75.

［3］晉若冰，湯 瑩，范曉燕，等.生物醫(yī)學(xué)電鏡技術(shù)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)初探［J］.解剖學(xué)雜志，2012，35（6）853－854.

［4］湯 瑩，金 嬋，沈亞峰，等.淺談生物技術(shù)專業(yè)本科生科研能力的培養(yǎng)［J］.西北醫(yī)學(xué)教育，2011，19（3）469－470.