鄭雄偉 林晉 林賢東 陸俐麗 力超

福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院，福建省腫瘤醫(yī)院病理科,福建 福州 350014

近年來(lái)，流行病學(xué)、分子生物學(xué)及免疫學(xué)等方面的研究認(rèn)為EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染與多種腫瘤有關(guān)，如胃癌、乳腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤和鼻咽癌等疾?。?］，其中Burkitt’s淋巴瘤和鼻咽癌與EBV的密切相關(guān)性已被公認(rèn)［2］。已有研究表明，EBV感染與霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL）的關(guān)系較為密切，但在不同地區(qū)、性別及不同年齡之間，HL組織中EBV的檢出率存在著差異［3］。本研究采用組織芯片技術(shù)結(jié)合原位雜交方法對(duì)福建地區(qū)74例HL EBV感染的情況進(jìn)行觀察，并了解EBV相關(guān)HL在本地區(qū)的特點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 資料 收集福建省腫瘤醫(yī)院2003年—2009年間經(jīng)病理確診的74例HL石蠟包埋標(biāo)本，所有病例均按WHO2008年淋巴瘤新分類標(biāo)準(zhǔn)分類。

1.2 組織芯片的制作 組織芯片由上海芯超生物科技有限公司、生物芯片上海國(guó)家工程研究中心制備。所有供體組織蠟塊行常規(guī)病理切片后做HE染色，病理專家作2次診斷，并在HE切片上根據(jù)典型病理部位作標(biāo)記。陣列制作利用組織芯片制作儀（Beecher Instruments Inc.）在受體蠟塊（空白蠟塊）上打孔（直徑1.0 mm），然后根據(jù)HE片上精確范圍在供體組織蠟塊相應(yīng)位置獲取所要的1個(gè)組織芯片放入受體蠟塊陣列孔中，并記錄組織編號(hào)，重復(fù)上述步驟制成陣列塊1塊（98點(diǎn)）。采用切片機(jī)（英國(guó)Shandon公司）以4 μm進(jìn)行連續(xù)切片制成組織芯片切片，所得的組織芯片的每個(gè)點(diǎn)都經(jīng)過(guò)病理診斷。

1.3 原位雜交法檢測(cè)病變組織內(nèi)EBER表達(dá)情況 試劑盒采用福建泰普生物科學(xué)有限公司的EBER探針原位雜交檢測(cè)試劑盒（S30173），具體操作步驟參照試劑使用說(shuō)明書(shū)。簡(jiǎn)述如下：切片脫蠟，梯度酒精水化，蛋白酶K消化5 min。蒸餾水洗，梯度酒精脫水，室溫下干燥，加EBER探針，濕盒內(nèi)置55 ℃溫育90 min，轉(zhuǎn)置37 ℃溫育過(guò)夜，PBS沖洗。加過(guò)氧化物酶，室溫溫育10 min，PBS沖洗。加地高辛抗體， 室溫溫育60 min，PBS沖洗。滴加增效劑，室溫溫育20 min，PBS沖洗。滴加辣根過(guò)氧化物酶抗體，室溫溫育30 min，PBS沖洗。然后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡觀察結(jié)果。用試劑盒所附的陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替EBER探針作陰性對(duì)照。

1.4 原位雜交結(jié)果判斷 HL瘤細(xì)胞以雙核或多核瘤巨細(xì)胞為特征，核膜厚，核中央有大的嗜酸性核仁，以雙核面對(duì)面排列的經(jīng)典Reedsternberg細(xì)胞（R-S細(xì)胞）為代表。以腫瘤細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，以整張組織切片中出現(xiàn)5個(gè)以上陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞者為陽(yáng)性病例，少于5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞者為陰性病例。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 11.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特點(diǎn) 在74例淋巴瘤患者中，男性53例，女性21例，年齡8～82歲，平均年齡35.9歲，其中1～14歲10例，15～69歲56例，≥70歲8例，均發(fā)生在淋巴結(jié)內(nèi)（頸部淋巴結(jié)54例，腋窩淋巴結(jié)7例，鎖骨淋巴結(jié)13例）。組織分型：4例為結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型霍奇金淋巴瘤（nodular lymphocyte-predominant HL，NLPHL），70例為經(jīng)典型HL（classical Hodgkin’s lymphoma，CHL），其中LP為17例、MC為28例、NS為18例、LD為7例。

2.2 EBER陽(yáng)性的定位分布 原位分子雜交檢測(cè)EBER被認(rèn)為是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞EBV的金指標(biāo)，EBER陽(yáng)性表達(dá)定位在R-S細(xì)胞核上，呈棕褐色（圖1）。

2.3 不同性別及年齡患者HL與EB病毒感染情況 根據(jù)HL患者的年齡的不同分為3組［1-2］：兒童組（≤14歲）、成人組（＞14～＜70歲）和老年組（≥70歲）；在兒童組中10例有9例EBV表達(dá)陽(yáng)性，老年組中8例有7例EBV表達(dá)陽(yáng)性，與成人組（39.3%，22/56）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.4，P＜0.05）。在55例HD男性患者中，EBER陽(yáng)性病例29例，占男性病例的54.7%；在21例HD女性患者中，EBER陽(yáng)性病例9例，占女性病例的42.7%。男女比例為1.3∶1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，性別間EBER檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.059，P=0.357）。

圖1 EBER原位分子雜交顯示腫瘤性RS細(xì)胞核呈陽(yáng)性Fig.1 EBER in situ hybridization for HL cases showed positive signals in nuclear or nucleolar regions of RS cells (arrow mark).

2.4 HL各組織學(xué)類型EBV感染情況 74例HL中，38例EBER陽(yáng)性病例中，其中LP有5 例（5/17，29.4%）；MC有23例（23/28，82.1%）；NS有5例（5/18，27.8%）；LD有5例（5/7，71.4%）; NLPHL為0例（0）。MC和LD的EBV陽(yáng)性率明顯高于其他類型，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.3，P＜0.05）。

2.5 臨床分期與EB病毒感染情況 在38例EBER陽(yáng)性病例中，其中臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期有11例（陽(yáng)性率33%，11/32），臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期有27例（陽(yáng)性率76%，27/42），Ⅲ～Ⅳ期患者EBV陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.7，P＞0.05）。.

3 討 論

EBV感染與HL的關(guān)系在世界很多地方都有研究，Weiss等［4］首次報(bào)道在HL組織中檢出EBV-DNA，其檢出率為20%～25%，后來(lái)運(yùn)用免疫組化以及更敏感的EBER原位雜交的方法，檢測(cè)到R-S細(xì)胞內(nèi)的EBV病毒的存在，進(jìn)一步證實(shí)了EBV與HL之間的關(guān)系［5］。各國(guó)所報(bào)道的HL中EBV的檢出率有很大的差異，日本為65%，美國(guó)為50%左右［6-7］，我國(guó)報(bào)道為48%～57%［8］。Diepstra等［2］的研究顯示，HL患者EBV陽(yáng)性率與組織分型有關(guān)，在HL各型中MC型明顯高于其他類型。本研究結(jié)果顯示，利用EBER原位雜交技術(shù)HL中EBV的檢出率為52%，說(shuō)明EBV感染在HL的發(fā)生中起著重要的作用。在經(jīng)典型HL各型中EBV的檢出率以LD型和MC型為高，LD病例組中7例有5例為陽(yáng)性，MC病例組中28例有23 例為陽(yáng)性，而NS 病例組中18例只有5例為陽(yáng)性，LP病例組中17只有5例為陽(yáng)性。說(shuō)明本地區(qū)經(jīng)典型HL各型中MC型與EBV關(guān)系最密切，其次是LD型，NS型的感染率最低，而NLPHL幾乎與EBV無(wú)關(guān)。

EBV陽(yáng)性的HL在人群中的分布不均勻，有研究表明男性患者的EBV陽(yáng)性率高于女性患者，兒童與老年HL患者EBV感染比成人HL高［5-6］，我們的研究顯示，男性HL的EBER陽(yáng)性率為54.7%（29/55），女性HL的EBER陽(yáng)性率為42.7%（9/21），男女比例為1.3∶1與文獻(xiàn)結(jié)果相符［6］，Zhou等［8］對(duì)中國(guó)104例兒童HL和52例成人HL的EBV感染進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)89%兒童HL和38%成人HL有EBV感染。本研究利用EBER原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)≤14歲兒童組及≥70歲老年組的EBV陽(yáng)性率很高，在兒童組中10例有9例EBV表達(dá)陽(yáng)性，老年組中8例有7例EBV表達(dá)陽(yáng)性，而成人EBV陽(yáng)性率則為39.3%（22/56），兩者之間存在顯著性差異（P＜0.05）。同時(shí)，兒童和老年組HL患者EBV的感染率顯著高于成年患者，出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因可能是與兒童及老年人免疫能力相對(duì)低下、環(huán)境因素及人體基因易感性有關(guān)［9-10］。

EBV感染與HL患者的臨床分期還存在分歧。Kwon等［9］在韓國(guó)HL患者的研究結(jié)果顯示，Ⅲ～Ⅳ的HL患者EBV陽(yáng)性率為86.7%（13/32）明顯高于Ⅰ～Ⅱ患者（13.3%，2/24）［9］，與我們的研究結(jié)果相一致。同時(shí)他們研究還顯示，EBV陽(yáng)性率患者的生存期較EBV陰性患者而言有縮短的趨勢(shì)。EBV陽(yáng)性率的患者還常伴隨B癥狀。然而，Jarrett等［11］在研究英國(guó)蘇格蘭HL患者對(duì)卻得到相反的結(jié)果。這可能因?yàn)镋BV感染有地域依賴性。

綜上所述，福建地區(qū)HL的發(fā)病與EB病毒的感染有較為密切的關(guān)系，但其致病機(jī)制目前仍不明了，目前研究認(rèn)為EBV的可能致病機(jī)制是［12］：⑴EBV感染使淋巴細(xì)胞染色體發(fā)生突變或易位，導(dǎo)致c-myc癌基因激活和過(guò)度表達(dá)，最終導(dǎo)致淋巴瘤的發(fā)生；⑵由于EBV感染使淋巴細(xì)胞系中Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受抑以及凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)異常，淋巴細(xì)胞凋亡受抑而發(fā)生淋巴瘤，這可能是B細(xì)胞相關(guān)的經(jīng)典HL的主要病因。

［1］ Shah KM,Young LS.Epstein-Barr virus and carcinogenesis：beyond Burkitt’s lymphoma［J］.Clin Microbiol Infect, 2009,15(11)：982-988.

［2］ Diepstra A, van Imhoff GW,Schaapveld M, et al. Latent Epstein-Barr virus infection of tumor cells in classical Hodgkin’s lymphoma predicts adverse outcome in older adult patients［J］.J Clin Oncol, 2009, 27(23)：3815-3821.

［3］ Chang KC, Khen NT,Jones D, et al.Epstein-Barr virus is associated with all histological subtypes of Hodgkin’s lymphoma in Vietnamese children with special emphasis on the entity of lymphocyte predominance subtype［J］.Hum Pathol, 2005, 36(2)：747-755.

［4］ Weiss LM, Strickler JG, Warnke RA, et al.Epstein-Barr viral DNA in tissues of Hodgkin’s disease［J］.Am J Pathol,1987, 129(1)：86-91.

［5］ Wu TC, Mann RB, Charache P, et al.Detection of EBV gene expression in Reed-Sternberg cells of Hodgkin’s disease［J］.Int Cancer, 1990, 46(5)： 801-806.

［6］ Thampson MP, Kurzrock R.Epstein-Barr virus and cancer［J］.Clin Cancer Res, 2004, 10(3)：803-821.

［7］ Gottschalk S, Rooney CM, Heslop HE.Post-transplant lymphoproliferative disorders［J］.Ann Rev Med, 2005,56：29-44.

［8］ Zhou XG, Hamilton-Dutoit SJ, Yan QH, et al.The association between Epstein-Barr virus and Chinese Hodgkin’s disease［J］.Int J Cancer, 1993, 55(3)：359-363.

［9］ Kwon JM, Park YH, Kang JH, et al.The effect of Epstein-Barr virus status on clinical outcome in Hodgkin’s lymphoma［J］.Ann Hematol, 2006, 85(4)：463-468.

［10］ Kandil A,Bazarbashi S,Mourad WA.The correlation of Epstein-Barr virus expression and lymphocyte subsets with the clinical presentation of nodular sclerosing Hodgkin’s disease［J］.Cancer, 2001, 91(3)：1957-1963.

［11］ Jarrett RF, Stark GL, White J, et al.Impact of tumor Epstein-Barr virus status on presenting features and outcome in age-defined subgroups of patients with classic Hodgkin’s lymphoma： A population-based study［J］.Blood, 2005,106(7)：2444-2445.

［12］ 齊宗利, 趙彤, 朱梅剛.EB病毒與霍奇金淋巴瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志, 2002, 17(2)：221-223.