喬玉環(huán) 王琳 劉紅彥 郭瑞霞 張孝艷 趙曉麗

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450052

宮頸癌是威脅女性健康的第二大婦科惡性腫瘤，并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。近年來(lái)，表遺傳學(xué)的修飾在腫瘤形成過程中的作用成為目前研究的熱點(diǎn)，主要包括DNA甲基化和組蛋白去乙?；?。DNA甲基化是哺乳動(dòng)物表遺傳學(xué)修飾的一種最重要形式［1］。Ras相關(guān)區(qū)域家族1A（ras associated domain family 1A，RASSF1A） 基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與肺癌、胃癌、乳腺癌及卵巢癌等多種人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)［2］，宮頸癌中RASSF1A基因甲基化的研究國(guó)內(nèi)外亦有相關(guān)報(bào)道，但有關(guān)RASSF1A基因甲基化與RASSF1A蛋白表達(dá)之間關(guān)系的研究甚少。本研究采用甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)15例正常宮頸組織和46例宮頸鱗癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和RASSF1A蛋白的表達(dá)情況，旨在探討RASSF1A基因甲基化與RASSF1A蛋白表達(dá)之間的關(guān)系及其在CSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2008年10月—2009年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科治療的宮頸癌患者手術(shù)切除或門診活檢的新鮮標(biāo)本46例。病理學(xué)類型均為鱗癌；臨床分期（FIGO 2000）：Ⅰ期21例，Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期8例；組織學(xué)分級(jí)：G1～G231例，G315例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5例?；颊咧形荒挲g41歲（25～67歲）。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診，術(shù)前未接受放、化療。另選取同期因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的正常宮頸組織15例作為對(duì)照。將每一份標(biāo)本均分為兩份，一份切下后立即置冰盒中，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存；另一份用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 按常規(guī)酚-氯仿法抽提組織DNA，TE緩沖液溶解后檢測(cè)DNA濃度和純度。A260/A280均介于1.7～2.0之間，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 亞硫酸氫鹽修飾及MSP檢測(cè) 用Chemicon公司的CpGenomeTMDNA Modification Kit（S7820）試劑盒修飾樣品DNA。引物序列設(shè)計(jì)參照參考文獻(xiàn)［3］（表1）。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性9 min，95 ℃變性30 s，退火1 min，72 ℃延伸30 s，循環(huán)37次，72 ℃延伸5 min，產(chǎn)物4 ℃保存。取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。用Sss I 甲基轉(zhuǎn)移酶修飾過的胎盤組織DNA作為甲基化陽(yáng)性對(duì)照，以雙蒸水代替模板DNA作為陰性對(duì)照。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 鼠抗人RASSF1A單克隆抗體（工作液濃度1∶500）購(gòu)自美國(guó)Bioscience公司，ABC試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vecter公司。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用已知的RASSF1A陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4 結(jié)果判定［4］胞質(zhì)著色為棕黃色者為RASSF1A陽(yáng)性，光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。⑴根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度：無(wú)顯色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。⑵根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞＜10%計(jì)1分，10%～＜50%計(jì)2分，50%～＜75%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分。兩者相乘總積分≥4分判為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理。率的比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；多組總體比較后的兩兩比較，采用Bonferroni法對(duì)α進(jìn)行校正，α=0.017。

2 結(jié) 果

2.1 RASSF1A基因的甲基化狀況及其與CSCC臨床病理特征的關(guān)系 15例正常宮頸組織中未見RASSF1A基因甲基化，46例CSCC組織中有20例存在RASSF1A基因甲基化，甲基化陽(yáng)性率為43.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.830，P＜0.05，圖1）。CSCC患者中臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期的RASSF1A基因甲基化率分別為19.0%、58.8%、75.0%，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，Ⅲ～Ⅳ期的RASSF1A基因甲基化率明顯高于Ⅰ期（P＜0.017）；RASSF1A基因甲基化與CSCC的組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05，表2）。

表1 RASSF1A甲基化特異性PCR引物序列、擴(kuò)增片段大小及退火溫度Tab.1 The MSP primers of RASSF1A and PCR parameters

圖1 宮頸鱗癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化Fig.1 The promoter methylation of RASSF1A gene in CSCC

2.2 R A S S F 1 A蛋白的表達(dá)情況及與RASSF1A基因甲基化的關(guān)系 正常宮頸組織中均有RASSF1A蛋白的表達(dá)，而CSCC組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)率僅為41.3%，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.796，P＜0.05，圖2）。CSCC患者中臨床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的RASSF1A蛋白表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)（66.7%→23.5%→12.5%，P＜0.05），前者與后兩者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.017）；RASSF1A蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05，表2）。

表2 RASSF1A基因甲基化及蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between methylation and protein expression of RASSF1A and clinicopathological characteristics[n(%)]

Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，RASSF1A基因甲基化與RASSF1A蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.469，P＜0.05，表3）。

表3 宮頸鱗癌組織中RASSF1A基因甲基化與RASSF1A蛋白表達(dá)的關(guān)系Tab.3 The correlation between methylation of RASSF1A and expression of RASSF1A protein in CSCC(n)

圖2 正常宮頸及宮頸鱗癌組織RASSF1A蛋白的表達(dá)Fig.2 The protein expression of RASSF1A in normal cervical tissues and CSCC

3 討 論

RASSF1A是RAS相關(guān)區(qū)域家族1的主要轉(zhuǎn)錄本之一，位于人染色體3p21.3區(qū)域，其cDNA全長(zhǎng)1 873 bp，編碼340個(gè)氨基酸，該基因在正常組織中均有表達(dá)，而在多種腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)缺失，是一種潛在的腫瘤抑制基因。有關(guān)RASSF1A的確切作用機(jī)制目前尚不明確，可能是通過阻斷細(xì)胞周期發(fā)展、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抗微管解聚等發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用［5］。有研究表明［6］，啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化是RASSF1A基因失活的最主要機(jī)制。甲基化的RASSF1A基因失去了對(duì)細(xì)胞的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，從而使細(xì)胞更容易發(fā)生惡變。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，8株宮頸癌細(xì)胞系中，有3株（37.5%）存在RASSF1A基因的高甲基化［7］。Kim等［8］用巢式MSP法檢測(cè)69例韓國(guó)CSCC標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有21例（30.4%）發(fā)生了RASSF1A基因的異常甲基化。本研究采用MSP技術(shù)檢測(cè)46例CSCC組織中RASSF1A基因的甲基化陽(yáng)性率為43.5%，與上述研究結(jié)果基本一致，這說(shuō)明RASSF1A基因甲基化在CSCC的形成過程中可能起著重要作用，屬于CSCC的一個(gè)頻發(fā)事件，并具有腫瘤特異性。免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15例正常宮頸組織均有RASSF1A蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，而46例CSCC組織中RASSF1A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率僅為41.3%，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另外，甲基化陽(yáng)性的CSCC組織RASSF1A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于甲基化陰性的CSCC組織（15.0% vs 61.5%），統(tǒng)計(jì)分析顯示RASSF1A基因甲基化與RASSF1A蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示RASSF1A異常甲基化可能是導(dǎo)致該基因沉默及蛋白低表達(dá)的主要因素。但在甲基化陰性的26例CSCC組織中有10例表現(xiàn)為RASSF1A蛋白表達(dá)缺失或低表達(dá)，這有可能說(shuō)明甲基化不是導(dǎo)致RASSF1A基因失活的唯一因素，還存在其他分子生物學(xué)機(jī)制如雜合性丟失、純合性缺失等，從而導(dǎo)致該基因的失活。

在本研究中，RASSF1A基因甲基化與CSCC的臨床分期有關(guān)，且Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期的甲基化陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ期，提示RASSF1A基因甲基化發(fā)生在CSCC的早期階段，且在宮頸癌的進(jìn)一步發(fā)展過程中可能起到了重要作用。另外，隨著宮頸癌組織學(xué)分級(jí)的增高或伴有淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，RASSF1A基因甲基化程度也呈增高趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與研究樣本量較小以及臨床病理因素構(gòu)成比例不均衡有關(guān)。綜上所述，RASSF1A基因異常甲基化可能是導(dǎo)致RASSF1A蛋白低表達(dá)的主要機(jī)制之一，是CSCC發(fā)生的早期且頻繁事件，在CSCC的進(jìn)一步發(fā)展中起到了重要作用?；蚣谆c基因突變不同，既具有遺傳性，又具有可逆性。Narayan等［7］用去甲基化藥物5-氮-2’脫氧胞苷（5-2aza-CdR）作用于RASSF1A基因表達(dá)失活的宮頸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)已失活的RASSF1A基因重新恢復(fù)表達(dá)，且抑制了宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。這使得宮頸癌的分子靶向治療成為可能，為探索新的治療方法提供了思路。隨著對(duì)RASSF1A基因細(xì)胞調(diào)控機(jī)制研究的不斷深入以及抑癌作用的逐步明確，其在CSCC診治方面將發(fā)揮更加重要的作用，因此有望成為CSCC早期診斷的分子生物學(xué)指標(biāo)。

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