程繼榮 徐虓 王淑琴 祖木熱提·穆沙江

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤中心，新疆 烏魯木齊 830011

腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤新生血管形成［1］，腫瘤組織的微血管密度（microvessel density，MVD）不僅可定量地反映腫瘤血管生長情況，還能預(yù)示腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)趨勢［2］。不同微血管標(biāo)記物在肺癌組織中的表達(dá)情況報(bào)道不一致，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測3種微血管標(biāo)記物即CD31、CD34及CD105在65例肺癌組織和30例癌旁組織的表達(dá)，比較它們標(biāo)記的MVD的差異及其與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，以尋找較合適的肺癌組織微血管標(biāo)記物。

1 資料和方法

1.1 研究對象及標(biāo)本來源 收集我院1995年1月—2003年12月因肺癌行手術(shù)切除的原發(fā)性肺癌患者65例，其中男性58例，女性7例，年齡38～77歲，平均年齡（62.5±5.3）歲，所有病例術(shù)前均未接受放療或化療。組織類型：鱗癌34例，腺癌14例，細(xì)支氣管肺泡癌17例。分化程度：高分化23例，中分化18例，低分化24例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。TNM分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期20例，Ⅲ期22例。對照組為30例癌旁組織。所有標(biāo)本用10%中性甲醛溶液固定4～8 h，然后常規(guī)石蠟包埋，切片厚3 μm。

1.2 試劑 鼠抗人CD31單克隆抗體購自美國Millipore公司，鼠抗人CD34單克隆抗體、鼠抗人CD105單克隆抗體及免疫組化SABC試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3 CD31、CD34及CD105免疫組化染色 免疫組化染色步驟按說明書進(jìn)行。CD31工作液濃度為1∶100，CD34和CD105均為即用型抗體。PBS代替一抗作陰性對照，陽性對照為已知陽性的乳腺癌組織。

1.4 結(jié)果判斷 CD31、CD34及CD105的陽性染色均為棕（黃）色，均在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，MVD計(jì)數(shù)法參照Weidner校正方法［3］。任何被抗體染色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，不管是否形成管腔，只要與周圍的微血管、腫瘤細(xì)胞和其他連接組織有清楚界限，都認(rèn)為是一個(gè)可計(jì)數(shù)的微血管。腫瘤內(nèi)硬化區(qū)及腫瘤交界處軟組織內(nèi)的微血管不計(jì)數(shù)，有平滑肌壁及管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管也排除在外。每一個(gè)標(biāo)本先低倍鏡（×10）下選3個(gè)微血管數(shù)最多的區(qū)域即“熱點(diǎn)”，在每一個(gè)區(qū)域中計(jì)數(shù)一個(gè)高倍鏡（×40）下的微血管數(shù)，取其平均值為MVD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理 用SPSS 12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以±s 表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 CD31、CD34及CD105的表達(dá) CD34和CD105在肺癌及癌旁組織均有表達(dá)，肺癌組織CD34表達(dá)豐富，標(biāo)記的血管數(shù)量多、血管結(jié)構(gòu)大多數(shù)較完整，可呈圓形、類圓形、長條形等；CD105標(biāo)記的血管稀疏，血管結(jié)構(gòu)不甚完整，管腔不規(guī)則，甚至呈條索狀或點(diǎn)狀。CD31在肺癌及癌旁組織均不表達(dá)（圖1～3）。

圖1 CD31在肺癌組織的陰性表達(dá)Fig.1 Negative expression of CD31 in tissue of lung cancer(IHC, ×400)

2.2 CD34-MVD及CD105-MVD的比較 肺癌組織（n=65）的CD34-MVD和CD105-MVD均高于癌旁組織（n=30），分別為24.5±6.5 vs 9.6±5.2和8.2±3.0 vs 2.1±0.9（t分別為10.89和10.88，P均＜0.05）。肺癌組織CD34-MVD（24.5±6.5）高于CD105-MVD（8.2±3.0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.19，P＜0.05）。因CD31無表達(dá)，故在后續(xù)的結(jié)果中不再記錄及分析CD31-MVD。

圖2 CD34在肺癌組織的表達(dá)Fig.2 Positive expression of CD34 in tissue of lung cancer(IHC, ×400)

2.3 CD34-MVD及CD105-MVD與臨床指標(biāo)的關(guān)系 CD34-MVD及CD105-MVD在腫瘤大小、不同組織學(xué)類型、不同分化程度之間的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；它們均隨TNM分期的逐漸增高而升高（F值分別為17.07和9.85，P均＜0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CD34-MVD及CD105-MVD高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（t值分別為4.57和4.70，P均＜0.05）（表1）。相關(guān)分析結(jié)果顯示，CD34-MVD及CD105-MVD與TNM分期的相關(guān)系數(shù)分別為0.32和0.54，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)系數(shù)分別為0.30和0.58。

圖3 CD105在肺癌組織的表達(dá)Fig.3 Positive expression of CD105 in tissue of lung cancer(IHC, ×400)

3 討 論

大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持MVD可作為乳腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤生物學(xué)行為的重要指標(biāo)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度及分期有關(guān)［4-6］。本試驗(yàn)選擇CD31，CD34和CD105標(biāo)記肺癌組織微血管，發(fā)現(xiàn)CD31在肺癌及癌旁組織無表達(dá)，而CD34和CD105在肺癌及癌旁組織均有表達(dá)。

CD31即血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（又稱PECAM-1），被認(rèn)為參與介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞。當(dāng)腫瘤細(xì)胞與血小板結(jié)合后，血小板可通過CD31與內(nèi)皮細(xì)胞的連接來促使腫瘤細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的接觸，穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附［7］。本試驗(yàn)顯示肺癌及癌旁組織CD31表達(dá)陰性，由此推測由血小板介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞黏附作用在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中作用較小，或由于CD31在肺癌組織中表達(dá)不穩(wěn)定所致，也可能由實(shí)驗(yàn)誤差引起。Wang等［8］用CD31和CD105單抗對乳腺癌組織作免疫組化染色時(shí)發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織內(nèi)的血管與CD105反應(yīng)十分強(qiáng)烈，而CD31卻僅有微弱表達(dá)甚至不表達(dá)。但國內(nèi)有關(guān)于CD31表達(dá)強(qiáng)度隨肺癌TNM分期增高而增高［9］及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［10］的報(bào)道。

表1 65例肺癌組織CD34-MVD及CD105- MVD與臨床指標(biāo)的關(guān)系Tab.1 Relationship between CD34-MVD/CD105-MVD and clinical indices in lung cancer tissue(±s)

表1 65例肺癌組織CD34-MVD及CD105- MVD與臨床指標(biāo)的關(guān)系Tab.1 Relationship between CD34-MVD/CD105-MVD and clinical indices in lung cancer tissue(±s)

SCC: Squamous cell carcinoma; ADC: Adenocarcinoma; BAC: Bronchialalveolar carcinoma.

Factor n CD34-MVD t/F P CD105-MVD t/F P Tumor size/cm 1.36 0.18 0.75 0.46＜3 31 23.5±4.9 6.5±3.0≥3 34 25.3±5.7 7.0±2.4 Histological type 0.82 0.45 1.07 0.35 SCC 34 23.2±4.9 7.4±2.3 ADC 14 25.2±5.2 7.6±3.2 BAC 17 24.1±5.4 8.5±2.7 TNM stage 17.07 0.00 9.85 0.00Ⅰ stage 23 21.5±3.6 5.3±3.5Ⅱ stage 20 24.9±4.3 7.3±2.7Ⅲ stage 22 28.2±3.6 9.1±2.5 Differentiation 0.46 0.63 0.12 0.88 High 23 23.9±6.5 7.8±3.2 Middle 18 24.7±5.8 7.9±3.5 Low 24 25.5±4.8 8.2±1.3 Lymphoid metastasis 4.57 0.00 4.70 0.00 Yes 40 27.4±5.6 9.5±2.9 No 25 20.5±6.4 6.2±2.4

CD34是泛血管內(nèi)皮標(biāo)記物之一，應(yīng)用廣泛，被認(rèn)為是重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、較成熟的血管內(nèi)皮標(biāo)記物，作為常規(guī)指標(biāo)應(yīng)用于多種惡性腫瘤的免疫組化檢測。CD105是一種新生血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，僅在處于增殖狀態(tài)的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)［11］，如腫瘤組織、愈合中的傷口、胚胎組織等，而在正常組織的血管中則很少表達(dá)。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示肺癌組織CD34-MVD和CD105-MVD高于癌旁組織，且CD34-MVD高于CD105-MVD，說明肺癌組織的血管供應(yīng)比癌旁組織豐富，且用CD34比用CD105標(biāo)記腫瘤血管更敏感。本試驗(yàn)還顯示CD34-MVD和CD105-MVD隨TNM分期進(jìn)展而增高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CD34-MVD及CD105-MVD高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明TNM分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤組織的血供關(guān)系密切，符合腫瘤生長與轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤新生血管形成的學(xué)說［1］。相關(guān)分析顯示CD34-MVD及CD105-MVD與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且CD105的相關(guān)系數(shù)大于CD34，提示CD105與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系更密切。關(guān)于CD105與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)的證據(jù)已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，CD34和CD105都可作為肺癌微血管標(biāo)記物，CD34比CD105敏感，但CD105與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系更密切，而CD31不適合作為肺癌微血管標(biāo)記物。

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