王志純

(福建省種子管理總站，福建福州350003)

DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物品種鑒定[1－3]、農(nóng)作物種子純度鑒定[4－5]與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測等[6－8].實(shí)驗(yàn)室樣品制備與DNA提取等前處理對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性影響較大，但是，在現(xiàn)成的水稻等植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測方法與水稻種質(zhì)純度等標(biāo)準(zhǔn)中[5，9－10]，對實(shí)驗(yàn)室樣品制作與DNA提取純化等處理只有籠統(tǒng)的表述，而樣品前處理直接影響DNA提取的質(zhì)量與產(chǎn)量，繼而決定PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[11－13].植物材料通常采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)裂解緩沖液在65℃恒溫下常規(guī)溫育，進(jìn)行樣品前處理，作者曾研究過樣品顆粒細(xì)度與CTAB細(xì)胞裂解緩沖液溫育時間對DNA提取與轉(zhuǎn)基因成分熒光PCR檢測靈敏度的影響[11－13].超聲波振蕩處理能使樣品與CTAB細(xì)胞裂解緩沖液充分作用，能提高生物DNA提取的產(chǎn)量與純度[14－15]，但在超聲波環(huán)境中以CTAB裂解緩沖液65℃溫育提取水稻種子DNA，迄今未見報道.

為提高水稻種子DNA提取效率，在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，縮短DNA提取時間，本研究以3種不同顆粒細(xì)度的水稻種子粉末樣品為實(shí)驗(yàn)材料，對影響水稻種子特異物種成分(GOS基因)檢測的主要前處理因素，DNA提取過程中的CTAB裂解緩沖液在65℃恒溫常規(guī)溫育與超聲波溫育處理效果進(jìn)行比較分析，以期篩選出優(yōu)化的前處理措施，提高水稻種子實(shí)時熒光PCR檢測效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性，為建立水稻種子鑒定的快速檢測方法提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻“汕優(yōu)63”種子由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供.

1.2 試劑

TE緩沖液(pH 8.0)、超純水、蛋白酶K、RNA分解酶為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品;GoTaq Probe qPCR Master Mix(2×)(含CXR Reference Dye)試劑盒為Promega公司產(chǎn)品;水稻內(nèi)源基因(GOS)擴(kuò)增用的引物與探針[6]由大連寶生物科技公司合成(表1).其他試劑藥品均為國產(chǎn)分析純.

表1 熒光定量PCR引物/探針序列Table 1 The primer/probe sequence of fluorescence PCR

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 稱取200 g稻谷樣品，烘干后研磨成粉末，分別過50目(濾過顆粒＜270 μm)與100目(濾過顆粒＜150 μm)圓振篩，制成顆粒細(xì)度＜50目、50－100目、＞100目3個細(xì)度范圍的樣品.

1.3.2 DNA提取 采用CTAB法[6]提取DNA，稱取500 mg樣品粉末于50 mL離心管中，加入5 mL質(zhì)量濃度為20 g·L－1的CTAB裂解緩沖液，于65℃恒溫數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE型，500 W、40KHZ)中(使用功率100%)振蕩溫育處理10、30和60 min，同時在65℃恒溫水浴鍋中常規(guī)溫育10 min、30 min、60 min、4 h和8 h為對照處理，共8個處理，最后將獲得的DNA溶于200 μL的0.1×TE緩沖液(pH 8.0)中，充分渦旋后，測定DNA溶液的D260nm/D280nm值與質(zhì)量濃度(ng·μL－1).每份樣品重復(fù)提取2份DNA.

1.3.3 熒光PCR測試 每份DNA樣本做2個實(shí)時熒光PCR測試，反應(yīng)溫度循環(huán)程序?yàn)?步法:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性35 s，60℃退火及延伸60 s，45個循環(huán).閾值設(shè)定原則[16]根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線略高于正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn).

1.3.4 熒光PCR反應(yīng)體系 熒光PCR單管反應(yīng)體積為20 μL，引物與探針等試劑加樣量如表2.

1.3.5 樣品前處理對水稻內(nèi)源基因 GOS的熒光PCR 檢測的影響 按照 1.3.1 和 1.3.2 節(jié)設(shè)置的 3 種顆粒細(xì)度與8種CTAB恒溫溫育與超聲波溫育處理時間，共24種前處理，各提取2份DNA，每份DNA做2次熒光PCR反應(yīng)，即每個水稻種子粉末樣品做4次水稻內(nèi)源基因(GOS)的PCR測試，取平均值，每次(96孔板)實(shí)驗(yàn)都設(shè)置大豆陰性對照與雙蒸水(ddH2O)空白對照各1個.

表2 熒光PCR反應(yīng)體系Table 2 Fluorescence PCR reaction systems

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖，對不同處理條件下樣品DNA質(zhì)量濃度與水稻內(nèi)源基因(GOS)的實(shí)時熒光PCR檢測結(jié)果(Ct值)的差異顯著性進(jìn)行方差分析，并估算邊際均值條形圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 CTAB的常規(guī)溫育與超聲波溫育處理對DNA提取效果比較

3種不同顆粒細(xì)度的樣品進(jìn)行6種CTAB溫育處理，每個處理重復(fù)2次取平均值，共獲得18個DNA溶液樣本的質(zhì)量濃度平均值見表3.各個組合樣品的DNA溶液D260nm/D280nm值為1.7－2.0，符合PCR檢測要求.

由表3可知，在相同的樣品顆粒細(xì)度下，不論恒溫65℃常規(guī)溫育處理還是超聲波溫育處理，提取的DNA質(zhì)量濃度分別隨著DNA提取過程中CTAB溫育時間的延長而提高，提取的DNA濃度最高的是超聲波溫育處理60 min，其余依次為超聲波溫育溫育30 min與溫育10 min處理.不論樣品顆粒細(xì)度(目)如何，在溫育時間相同下，超聲波處理獲得的DNA質(zhì)量濃度明顯高于溫育時間相同的相應(yīng)的常規(guī)處理.溫育處理措施相同的情況下，樣品顆粒細(xì)度越小，提取的DNA質(zhì)量濃度越高，這與作者先前研究結(jié)果[13]一致.Mi-crosoft Office Excel 2003無重復(fù)雙因素方差分析表明，樣品顆粒細(xì)度與CTAB溫育處理(含常規(guī)、超聲波處理與處理時間)對樣品 DNA 質(zhì)量濃度的影響分別達(dá)到顯著(F=4.57，F(xiàn)0.05=3.44，P＜0.05)與極顯著水平(F=24.46，F(xiàn)0.01=11.26，P＜0.01).不論樣品顆粒細(xì)度多大，CTAB 溫育時間多少，超聲波溫育處理獲得的DNA質(zhì)量濃度均明顯高于常規(guī)溫育處理(圖1－A、B、C)，單因素方差分析結(jié)果表明2種處理獲得的DNA質(zhì)量濃度差異達(dá)到極顯著水準(zhǔn)(F=8.79，F(xiàn)0.01=8.53，P＜0.01)，說明超聲波處理可以明顯提高 DNA 提取質(zhì)量濃度，與其它材料的研究結(jié)果[14－15]一致.

表3 超聲波溫育處理與常規(guī)溫育處理水稻種子樣品提取的DNA質(zhì)量濃度Table 3 The DNA concentration of rice seed samples extracted by ultrasonic incubating treatment and conventional incubating treatment ng·μL－1

圖1 CTAB超聲波溫育處理與常規(guī)溫育處理對水稻種子DNA質(zhì)量濃度影響的比較Fig.1 Comparison of the DNA concentration of rice seed samples extracted by ultrasonic and conventional treatments incubating in hexadecyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)lysis buffer

2.2 CTAB常規(guī)溫育與超聲波溫育處理對熒光PCR檢測效果的影響

用18種不同處理各2個DNA溶液樣本(共計36個)進(jìn)行水稻種子內(nèi)源GOS基因的熒光PCR測試，各做2次PCR重復(fù)，每個處理獲得4個Ct值(表4).

由表4可知，在相同的樣品顆粒細(xì)度下，不論恒溫65℃常規(guī)溫育還是超聲波溫育處理，熒光PCR測試獲得的CT值均隨著DNA提取過程中CTAB溫育時間的延長而降低，趨勢與表3中的DNA濃度趨勢一致.超聲波處理中，溫育60 min Ct值都是最小的，其次為溫育30 min處理，最大的是溫育10 min處理.不論樣品顆粒細(xì)度(目)與溫育時間如何，超聲波溫育處理熒光PCR獲得的Ct值明顯小于相應(yīng)的常規(guī)溫育處理，即超聲波溫育處理后，樣品與緩沖液充分作用，提高了DNA的提取效果，進(jìn)而提高了熒光PCR的檢測靈敏度.

表4 CTAB的常規(guī)溫育與超聲波溫育處理對水稻種子內(nèi)源GOS基因熒光PCR Ct值的影響比較Table 4 Comparison of the fluorescent RT-PCR results(Ct value)of GOS gene based on ultrasonic and conventional treatments for rice samples incubated in hexadecyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)lysis buffer

Microsoft Office Excel 2003無重復(fù)雙因素方差分析表明，樣品顆粒細(xì)度對樣品熒光PCR檢測Ct值的影響達(dá)到顯著水平(F=5.04，F(xiàn)0.05=3.44，P＜0.05)，而 CTAB 溫育處理(含常規(guī)與超聲波)的影響達(dá)到極顯著水平(F=33.72，F(xiàn)0.01=11.26，P＜0.01)，分析結(jié)果與 DNA 濃度完全一致.不論樣品顆粒細(xì)度多大，CTAB 溫育時間多少，超聲波溫育處理獲得的熒光PCR檢測Ct值均明顯低于常規(guī)溫育處理(圖2－A、B、C)，無重復(fù)單因素方差分析表明，CTAB超聲波溫育處理與常規(guī)溫育處理獲得的內(nèi)源基因GOS熒光PCR檢測的Ct值有極顯著差異(F=11.17，F(xiàn)0.01=8.53，P＜0.01).在各樣品顆粒細(xì)度中，CTAB 溫育時間相同，超聲波溫育處理獲得的Ct值均低于相應(yīng)常規(guī)溫育處理(圖2－A、B、C)，其中超聲波溫育30與60 min(表4、圖2－B與 C)都達(dá)到顯著水準(zhǔn)(F30min=8.10，F(xiàn)1h=10.47，F(xiàn)0.05=7.71，P＜0.05)，超聲波溫育 10 min 處理(表 4、圖 2－A)未達(dá)到顯著水準(zhǔn)(F10min=0.89，F(xiàn)0.05=7.71，P＞0.05).

圖2 CTAB超聲波溫育處理與常規(guī)溫育處理對水稻種子GOS內(nèi)源基因Ct值影響的比較Fig.2 Comparison of the Ct values of endogenous GOS gene from rice seed samples incubated in hexadecyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)lysis buffer by ultrasonic and conventional treatments

2.3 DNA提取方法的比較與優(yōu)化

2.2中CTAB超聲波溫育處理30與60 min對水稻內(nèi)源GOS基因的熒光PCR檢測有顯著性影響，因此選這兩個處理與先前研究[13]優(yōu)化的常規(guī)溫育4 h與8 h處理的結(jié)果進(jìn)行比較.表5可知，DNA質(zhì)量濃度常規(guī)溫育8 h處理與超聲波處理60 min比較接近，均高于常規(guī)溫育4 h處理與超聲波溫育處理30 min.圖3表明，樣品顆粒細(xì)度越小，所提的DNA質(zhì)量濃度越高，與先前研究結(jié)果一致[13].樣品顆粒細(xì)度＜50目時，4種處理的DNA質(zhì)量濃度差異不大;樣品顆粒細(xì)度在50－100目時，超聲波溫育處理1 h的DNA質(zhì)量濃度最高，其余的DNA質(zhì)量濃度從高到底依次是常溫溫育8 h、4 h與超聲波溫育處理30 min;樣品顆粒細(xì)度＞100目時，4種處理的DNA質(zhì)量濃度均較高，常規(guī)溫育處理8 h與超聲波處理60 min的DNA質(zhì)量濃度差異不大，均高于常溫溫育4 h與超聲波溫育處理30 min.

表5 優(yōu)化的超聲波處理與常規(guī)溫育處理提取的DNA質(zhì)量濃度Table 5 The DNA concentration of rice seed samples extracted by optimized ultrasonic treatment and conventional incubation treatment ng·μL－1

圖3 溫育超聲波處理30 min、60 min與常規(guī)處理4 h、8 h的DNA濃度比較Fig.3 Comparison of the DNA concentration of rice seed samples extracted by ultrasonic treatment incubating for 30 min，60 min and conventional treatment for 4 h，8 h in hexadecyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)lysis buffer

從水稻內(nèi)源GOS基因的熒光PCR檢測的Ct值來看，表4與表6可知，Ct值較小即PCR檢測靈敏度較高的是常溫溫育8 h、4 h與超聲波溫育處理30、60 min 4個處理，樣品靈敏度越細(xì)，Ct值越小(圖4)，但4 個處理間差異單因素(僅考慮溫育處理)方差分析 F 檢驗(yàn)不顯著(F=1.33，F(xiàn)0.05=4.06，P＞0.05).各種處理兩兩單因素(溫育處理)方差分析發(fā)現(xiàn):超聲波溫育處理60 min與常規(guī)溫育8 h對GOS基因的熒光PCR檢測的Ct值的影響，與其他處理比較，具有差異顯著性的最多，其次是超聲波溫育30 min處理(表7).可見超聲波溫育處理30與60 min可以達(dá)到常規(guī)溫育8 h的效果(圖4)，說明超聲波溫育處理大幅度縮短了DNA提取時間，只需30－60 min，至少可節(jié)省7 h，且能保證熒光PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，提高了水稻種子物種成分的檢測效率.

表6 超聲波溫育處理30 min、60 min與CTAB的常規(guī)溫育4 h、8 h獲得的水稻種子內(nèi)源GOS基因熒光PCR Ct值比較Table 6 Comparison of the fluorescent RT-PCR results(Ct value)of GOS gene based of rice samples on ultrasonic incubating for 30 min，60 min and conventional incubating for 4 h，8 h in hexadecyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)lysis buffer

圖4 溫育超聲波處理30 min、60min與常規(guī)處理4 h、8 h獲得的GOS熒光PCR Ct值比較Fig.4 Comparison of the Ct values of endogenous GOS gene from rice seed samples incubated in hexadecyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)lysis buffer by ultrasonic treatment incubating for 30 min，60 min and without ultrasonic treatment for 4 h，8 h

表7 不同溫育處理對GOS基因Ct值影響顯著性的F檢驗(yàn)1)Table 7 F test for the effect of various incubating treatments on Ct values of GOS gene

3 結(jié)論

作者曾研究65℃恒溫CTAB溫育時間與樣品顆粒細(xì)度等前處理對水稻種子DNA提取效果與熒光PCR檢測靈敏度的影響，發(fā)現(xiàn)不管樣品顆粒細(xì)度如何，CTAB溫育時間對水稻種子DNA提取效果與熒光PCR檢測靈敏度有顯著或極顯著影響，且最佳組合是CTAB溫育時間＞8 h(過夜)與樣品顆粒細(xì)度＞100目[13].由于溫育時間＞8 h(過夜)費(fèi)時太長，于是作者又進(jìn)行了本研究.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在超聲波蕩溫育處理30－60 min，使得樣品與CTAB裂解緩沖液快速、充分反應(yīng)，能夠達(dá)到溫育時間＞8 h的DNA提取與熒光PCR檢測(水稻內(nèi)源GOS基因)效果，該方法比DNA提取效果最好的常規(guī)溫育8h處理節(jié)省了至少7 h，在保證熒光PCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，建立了更快速的DNA提取方法，與其他試驗(yàn)材料研究結(jié)果一致[14－15]，具有廣泛的推廣應(yīng)用前景.

利用超聲波振蕩溫育處理，建立的DNA提取方法最佳步驟:稱取500 mg樣品粉末(＞50目)于50 mL離心管中，加入5 mL質(zhì)量濃度為20 g·L－1的CTAB裂解緩沖液，于65℃恒溫數(shù)控超聲波清洗器(500 W、40 KHZ)中(使用功率100%)振蕩溫育處理30 min－1，其余步驟按文獻(xiàn)[6]，最后將獲得的DNA溶于200 μL 的0.1 × TE 緩沖液(pH 8.0)中，充分渦旋后，測定DNA 溶液的D260nm/D280nm值與質(zhì)量濃度(ng·μL－1)，當(dāng)天使用的放置于4℃冰箱中備用，隔天使用，放置于－20℃下冷凍保存.

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