趙海燕 吳共發(fā) 王雅娟 韓慧霞

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 廣州 510515

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一 ，在美國已經(jīng)成為腫瘤死亡的首因；在上海也逐漸超過胃癌成為第二常見的惡性腫瘤［1］。以往研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與了惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移， SNAI1通過抑制E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達觸發(fā)EMT的發(fā)生，導(dǎo)致癌細胞喪失上皮特性，富于侵襲和轉(zhuǎn)移特性，是惡性腫瘤所必需的［2］。關(guān)于SNAI1的研究已經(jīng)多見報道，但是尚無采用配對方法比較結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中SNAI1表達的研究。在本研究中，我們通過免疫組織化學(xué)法檢測85例結(jié)直腸癌患者的癌旁正常黏膜組織、結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中SNAI1的表達情況，采取多種分組和多種統(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)進行詳細分析比較，探討SNAI1在結(jié)直腸癌中的意義。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源 收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院病理科2007年1月1日—2008年3月1日存檔的85例結(jié)直腸癌患者（高分化腺癌26例、中分化腺癌23例、低分化腺癌36例；Dukes A+B 45例，Dukes C+D 40例）的137個蠟塊，癌旁正常黏膜組織22例（距癌灶15 cm以上）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織30例均來自于85例結(jié)直腸癌患者?；颊吣挲g23～85歲（平均57.2歲），術(shù)前均未接受化療、放療。所有組織4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚切片，采用免疫組織化學(xué)二步法進行檢測。

1.2 試劑 SP法檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉公司；SNAI1兔抗人多克隆抗體購自美國Bioworld公司。

1.3 SP法檢測SNAI1的表達 免疫組織化學(xué)方法按試劑盒說明書操作。SNAI1抗體的工作濃度為1∶200，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，SP法檢測試劑盒，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。PBS取代一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準 胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，⑴強度分數(shù)標(biāo)準：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。⑵隨機選擇10個高倍視野，每個視野計算100個腫瘤細胞，共計數(shù)1 000個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分率：1%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，50%～＜75%為3分，≥75%為4分。兩項得分相乘，4～7分為“+”，8～11分為“++”，滿12分為“+++”，“+～+++”為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理，多組比較采用Kruskal-Wallis檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗，雙變量相關(guān)分析采用Spearman和Kendall’s tau-b檢驗，雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SNAI1在正常結(jié)直腸組織、癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中的表達 免疫組化結(jié)果顯示，SNAI1表達主要定位在細胞核內(nèi)（圖1）。多組比較顯示，SNAI1在正常結(jié)直腸黏膜組織、原發(fā)癌灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達明顯不同，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=50.496，P=0.000），以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達最強。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，SNAI1在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織中的表達顯著高于正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達（Z=-6.018，P=0.000）；低分化癌組織的表達顯著高于高中分化癌組織（Z=-2.467，P=0.014），SNAI1在Dukes A+B與Dukes C+D分期中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-0.975，P=0.330）。雙變量相關(guān)分析顯示組織類別（即正常結(jié)直腸黏膜組織、高分化癌組織、中分化癌組織、低分化癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織）與SNAI1的表達呈顯著正相關(guān)（Kendall’s tau-b相關(guān)系數(shù)r=0.532＞0.5，P=0.000；Spearman’s 相關(guān)系數(shù)r=0.595＞0.5，P=0.000，表1）。

2.2 SNAI1在高、中、低分化癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的對比表達 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織的表達顯著高于原發(fā)性結(jié)直腸癌組織（Z=-3.446，P=0.001，表1），但剔除無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性結(jié)直腸癌后，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性結(jié)直腸癌組織與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織的表達差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.785，P=0.188，表2）。

2.3 SNAI1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)分析 雙變量相關(guān)分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與SNAI1的表達呈顯相關(guān)（Kendall’s tau-b 相關(guān)系數(shù)r=0.209＜0.5，P=0.01；Spearman’s 相關(guān)系數(shù)r=0.221＜0.5，P=0.009）。

圖1 SNAI1在不同組織中的表達Fig.1 Expression of SNAI in different tissues(SP, ×200)

表1 SNAI1在正常結(jié)直腸組織、結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達情況Tab.1 Expression of SNAI in normal colorectal epithelium, colorectal carcinoma and lymph node metastases

表2 SNAI1在高、中、低分化癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的對比表達情況Tab.2 Comparison of SNAI1 in well, moderately, poorly differentiated carcinoma and paired lymphatic metastasis

3 討 論

SNAI1是鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，這個家族成員還有E12/E47、ZEBl、SIPl和Slug等，其家族具有相似的結(jié)構(gòu)，由一個高度保守的羧基末端及一個高度可變的氨基末端構(gòu)成，其家族成員結(jié)構(gòu)上的差異主要表現(xiàn)在中間P-S富集區(qū)域［3］。SNAI1是一個能誘導(dǎo)EMT的鋅指轉(zhuǎn)錄因子［4］，可以促進癌細胞在早期發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。SNAI1在上皮細胞的表達能促進在基因表達層面的成纖維表型的出現(xiàn)，這種表型具有侵襲和遷移的潛能和特性［6］。 最重要的是，SNAI1能夠直接抑制E-cadherin的表達，而E-cadherin是負責(zé)細胞上皮表型如細胞極性、細胞和基質(zhì)的黏附能力的主要成分［7］。SNAI1通過與E-cadherin啟動子區(qū)域的E-box結(jié)合，直接抑制E-cadherin表達，破壞上皮細胞之間的連接，使癌細胞松散，易于發(fā)生遷移，促進EMT的發(fā)生，與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)［8］。Larue等［9］描述，在中胚層與神經(jīng)嵴的前體中，SNAI1通過下調(diào)E-cadherin而觸發(fā)上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變。E-cadherin表達丟失被認為是EMT最顯著的特征［10-11］。EMT是細胞喪失上皮特征例如細胞極性，細胞連接和獲得間質(zhì)特性如增加運動性的一種形態(tài)學(xué)過程［12］。它最初在胚胎發(fā)育過程中如原腸胚形成階段，腎器官發(fā)育及神經(jīng)嵴形成中被描述［13］，大量的研究表明EMT被認為是腫瘤演進及轉(zhuǎn)移的基本過程，是良性腫瘤向高侵襲性腫瘤轉(zhuǎn)換所必需的過程［14］。由此可以看出，SNAI1確實是腫瘤惡性的標(biāo)志。在本研究中，免疫組化結(jié)果顯示，SNAI1在正常結(jié)直腸黏膜、原發(fā)癌灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達明顯不同，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的表達最強。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，SNAI1在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織中的表達顯著高于正常結(jié)直腸組織中的表達（P＜0.05）；低分化癌組織的表達顯著高于高中分化癌組織（P＜0.05），SNAI1在Dukes A+B與Dukes C+D分期中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），且雙變量相關(guān)分析顯示組織類別與SNAI1的表達呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r＞0.5，P＜0.05），相關(guān)關(guān)系非常密切。據(jù)此推斷，SNAI1可以作為結(jié)直腸癌惡性程度的評估指標(biāo)。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織的表達顯著高于原發(fā)性結(jié)直腸癌組織 （P＜0.05），這個結(jié)果與高維哲等［15］的研究結(jié)果一致。但剔除無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性結(jié)直腸癌病例后，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性結(jié)直腸癌組織與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織的表達差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。我們認為，這種將來自同一個患者的原發(fā)癌灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌進行比較的方法更具可比性和嚴謹性。我們由此推測，在結(jié)直腸癌中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的癌細胞惡性程度并不比原發(fā)癌灶的強，但這需要進一步的分子生物學(xué)方面的研究。

我們將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和SNAI1這兩個變量進行雙變量相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩者顯著正相關(guān)（P＜0.05），即SNAI1表達水平越高則淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移概率也越大。根據(jù)以往研究［15］，在結(jié)直腸癌中，SNAI1表達弱者轉(zhuǎn)移的發(fā)生率低，表達強者其轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。出現(xiàn)這種聯(lián)系的原因應(yīng)該是SNAI1通過直接抑制E-cadherin的表達，促進EMT，使癌細胞具有轉(zhuǎn)移能力［8］。綜上所述，我們認為在臨床中，通過檢測結(jié)直腸癌的SNAI1水平，可能可以作為患者是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的預(yù)測指標(biāo)。

SNAI1 在結(jié)直腸癌中表達與EMT及轉(zhuǎn)移等關(guān)系的分子生物學(xué)機制已經(jīng)有報道［8，16-17］。另外，有研究指出拮抗SNAI1作用逆轉(zhuǎn)調(diào)控EMT及腫瘤的體外轉(zhuǎn)移潛能［18］。在此基礎(chǔ)上有望尋找出一種結(jié)直腸癌防治的新方法。

［1］ 廉朋,蔡國響,徐燁,等.PRL-3基因在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的表達及其臨床意義［J］.中國癌癥雜志,2006,16(10)：823-827.

［2］ Olmeda D, Moreno-Bueno G, Flores JM, et al.SNAI1 is required for tumor growth and lymph node metastasis of human breast carcinoma MDA-MB-231 cells ［J］.Cancer Res,2007,67(24)：11721-11731.

［3］ Ikenouchi J, Matsuda M, Furuse M, et al.Regulation of tight junctions during the epithelium-mesenchyme transition： direct repression of the gene expression of claudins/occludin by Snail［J］.J Cell Sci,2003,116(Pt 10)：1959-1967.

［4］ Nieto MA.The snail superfamily of zinc-finger transcription factors ［J］.Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3(3)：155-166.

［5］ Peinado H, Olmeda D, Cano A.Snail, Zeb and bHLH factors in tumour progression： an alliance against the epithelial phenotype? ［J］.Nat Rev Cancer,2007,7(6)：415-428.

［6］ Guaita S, Puig I, Franci C, et al.Snail induction of epithelial to mesenchymal transition in tumor cells is accompanied by MUC1 repression and ZEB1 expression ［J］.J Biol Chem,2002,277(42)：39209-39216.

［7］ Perez-Moreno M, Jamora C, Fuchs E.Sticky business：orchestrating cellular signals at adherens junctions ［J］.Cell,2003,112(4)：535-548.

［8］ Cano A, Pérez-Moreno MA, Rodrigo I, et al.The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression ［J］.Nat Cell Biol,2000,2(2)：76-83.

［9］ Larue L, Bellcosa A.Epithelial-mesenchymal transition in development and cancer： role of phosphatidylinositol 3’kinase/AKT pathways ［J］.Oncogene,2005,24(50)：7443-7454.

［10］ Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression ［J］.Nat Rev Cancer,2002,2(6)：442-454.

［11］ Kang Y, Massagué J.Epithelial-mesenchymal transitions： twist in development and metastasis ［J］.Cell,2004,118(3)：277-279.

［12］ Berx G, Raspe E, Christofori G, et al.Pre-EMTing metastasis?Recapitulation of morphogenetic processes in cancer ［J］.Clin Exp Metastasis,2007,24(8)：587-597.

［13］ Shook D, Keller R.Mechanisms, mechanics and function of epithelial-mesenchymal transitions in early development［J］.Mech Dev,2003,120(11)：1351-1383.

［14］ Duband JL, Monier F, Delannet M, et al.Epitheliummesenchyme transition during neural crest development［J］.Acta Anat(Basel),1995,154(1)：63-78.

［15］ 高維哲,李建明,楊發(fā)達,等.鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail在結(jié)直腸癌中的表達及其意義［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2008,28(2)：162-165.

［16］ 楊發(fā)達,李建明,周軍,等.人大腸癌細胞PRL-3基因啟動子Snai1結(jié)合位點的初步研究［J］.南方醫(yī)科大學(xué)校報,2007,27(4)：401-405.

［17］ Pe?a C, García JM, Larriba MJ, et al.SNAI1 expression in colon cancer related with CDH1 and VDR downregulation in normal adjacent tissue ［J］.Oncogene,2009,28(49)：4375-4385.

［18］ 張阿麗,王全勝,鐘亞華,等.轉(zhuǎn)錄因子Snai1調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型及對腫瘤轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)作用［J］.癌癥,2005,24(11)：1301-1305.