嚴(yán)鳳好 鐘展華 曾少麗 陳媛

(惠州市中心血站 檢驗(yàn)科 廣東 惠州 516003)

ELISA 測(cè)定中影響結(jié)果的因素較多，其中溫育時(shí)間是影響測(cè)定結(jié)果的最關(guān)鍵因素，本研究對(duì)加酶前、加酶后、顯色等步驟的溫育時(shí)間進(jìn)行對(duì)比分析，旨在探討ELISA 法檢測(cè)不同強(qiáng)弱程度HBsAg 陽性標(biāo)本的部分影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料 陽性對(duì)照、陰性對(duì)照(試劑盒自帶)，0.5 IU/ml質(zhì)控血清(康徹思坦生物有限公司提供)，HBsAg 陽性標(biāo)本36 份，其中HBsAg 弱陽性標(biāo)本12 份、HBsAg 中陽性標(biāo)本12 份、HBsAg 強(qiáng)陽性標(biāo)本12份，HBsAg 陰性標(biāo)本32 份(均來自本站自愿無償獻(xiàn)血者，并經(jīng)過新創(chuàng)公司和梅里埃公司試劑檢測(cè))。

1.2 試劑與儀器 HBsAg 檢測(cè)試劑盒(上海梅里埃生物工程有限公司生產(chǎn))，STAR 全自動(dòng)加樣儀(瑞士HAMILTON)，F(xiàn)AME 全自動(dòng)酶免分析儀(瑞士HAMILTON)，340RT 酶標(biāo)儀(瑞士ANTHON)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 嚴(yán)格按照試劑說明書操作，實(shí)驗(yàn)步驟:①加稀釋液25 μl，加標(biāo)本或陰陽對(duì)照及質(zhì)控品75 μl。②37 ℃溫育60 min。③加酶標(biāo)記物50 μl。④37 ℃溫育30 min。⑤洗板5 次，加顯色劑100 μl，室溫(25 ℃)溫育30 min。⑥加終止液，酶標(biāo)儀讀數(shù)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)Ⅰ 加酶前溫育時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響:其他步驟不變，第②步溫育時(shí)間分別延長(zhǎng)至75 min(實(shí)驗(yàn)A)和90 min(實(shí)驗(yàn)B)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)Ⅱ 加酶后溫育時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響:其他步驟不變，第④步溫育時(shí)間分別延長(zhǎng)至40 min(實(shí)驗(yàn)C)和45 min(實(shí)驗(yàn)D)。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)Ⅲ 顯色時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響:其他步驟不變，第⑤步溫育時(shí)間分別延長(zhǎng)至40 min(實(shí)驗(yàn)E)和45 min(實(shí)驗(yàn)F)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)所得數(shù)據(jù)的S/CO 值，采用SPSS 17.0 軟件，按α =0.05 檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行方差分析、F 檢驗(yàn)和配對(duì)t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)Ⅰ結(jié)果 延長(zhǎng)加酶前溫育時(shí)間對(duì)強(qiáng)陽性和弱陽性標(biāo)本影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，強(qiáng)陽性標(biāo)本吸光度明顯下降，弱陽性明顯加強(qiáng)，并與延長(zhǎng)的時(shí)間密切相關(guān)。

2.2 實(shí)驗(yàn)Ⅱ結(jié)果 延長(zhǎng)加酶后溫育時(shí)間對(duì)各標(biāo)本吸光度(陰性除外)影響最明顯。

2.3 實(shí)驗(yàn)Ⅲ結(jié)果 延長(zhǎng)顯色時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 陰性標(biāo)本結(jié)果 延長(zhǎng)各反應(yīng)步驟溫育時(shí)間對(duì)HBsAg 陰性標(biāo)本吸光度影響差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、2。

表1 延長(zhǎng)不同實(shí)驗(yàn)步驟溫育時(shí)間對(duì)HBsAg 酶免實(shí)驗(yàn)S/CO 值的影響(±s)

表1 延長(zhǎng)不同實(shí)驗(yàn)步驟溫育時(shí)間對(duì)HBsAg 酶免實(shí)驗(yàn)S/CO 值的影響(±s)

標(biāo)本 對(duì)照 實(shí)驗(yàn)A 實(shí)驗(yàn)B 實(shí)驗(yàn)C 實(shí)驗(yàn)D 實(shí)驗(yàn)E 實(shí)驗(yàn)F陰性 0.20 ±0.03 0.20 ±0.04 0.23 ±0.01 0.19 ±0.02 0.22 ±0.03 0.19 ±0.02 0.23 ±0.03強(qiáng)陽性 76.68 ±0.69 69.95 ±1.29 62.40 ±1.17 71.15 ±0.62 66.15 ±1.00 76.45 ±0.68 76.05 ±1.27中陽性 7.31 ±0.10 7.30 ±0.19 7.33 ±0.17 7.52 ±0.16 7.73 ±0.12 7.17 ±0.04 7.28 ±0.09弱陽性 1.61 ±0.04 1.71 ±0.12 1.76 ±0.10 1.83 ±0.05 1.9 1 ±0.07 1.61 ±0.06 1.60 ±0.06

表2 各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果比較

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)屬于固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相載體的表面發(fā)生，但標(biāo)本中的抗體與固相抗原結(jié)合的機(jī)會(huì)并不均等，在最貼近孔壁的一層溶液中的才直接與抗原接觸。該反應(yīng)是一個(gè)逐漸平衡的過程，需要經(jīng)過擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)，要保證足夠的溫育時(shí)間，才能使產(chǎn)物生成達(dá)到頂峰。然而，是不是延長(zhǎng)任何一個(gè)步驟的時(shí)間獲得的效果是一樣的，筆者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并非如此。

從本實(shí)驗(yàn)可以看出，延長(zhǎng)加酶前溫育時(shí)間對(duì)強(qiáng)陽性和弱陽性標(biāo)本影響顯著，強(qiáng)陽性標(biāo)本隨溫育時(shí)間延長(zhǎng)吸光度明顯下降，弱陽性卻明顯加強(qiáng)，兩者均與延長(zhǎng)的時(shí)間密切相關(guān)。因?yàn)镋LISA 方法檢測(cè)HBsAg 是一種雙抗體夾心法，待測(cè)抗原既要與包被抗－HBs 結(jié)合，又要與酶標(biāo)抗體(HRP－HBs)作用，反應(yīng)過程中酶標(biāo)抗體與包被抗體共同競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)本的HBsAg。當(dāng)HBsAg濃度在一定低值范圍時(shí)，HBsAg 易受試劑中的酶標(biāo)抗體(HRP－HBs)飽和而被洗脫掉，降低了靈敏度。而對(duì)于強(qiáng)陽性標(biāo)本，標(biāo)本中含有過量的HBsAg，由于“鉤狀”效應(yīng)未能完全消除［1］，因此吸光度會(huì)反而降低，所以延長(zhǎng)加酶前和加酶后溫育時(shí)間其值都下降，并與時(shí)間成反比。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)加酶后的溫育時(shí)間對(duì)各標(biāo)本吸光度(陰性除外)影響最顯著，這點(diǎn)與相關(guān)報(bào)道［2］一致，因此對(duì)于弱陽性標(biāo)本，我們可以適當(dāng)延長(zhǎng)該步驟的溫育時(shí)間以防止假陰性結(jié)果出現(xiàn)。但延長(zhǎng)顯色時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響并不明顯，應(yīng)該是試劑盒在設(shè)計(jì)時(shí)已充分考慮到包被的抗體全部被抗原結(jié)合后所需的反應(yīng)時(shí)間。此外，對(duì)于HBsAg 陰性標(biāo)本，延長(zhǎng)各反應(yīng)步驟溫育時(shí)間對(duì)其結(jié)果影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［3－4］相吻合，表明適當(dāng)延長(zhǎng)溫育時(shí)間不會(huì)造成假陽性結(jié)果。

HBsAg 檢測(cè)作為判斷乙肝病毒感染的指標(biāo)，ELISA 以其操作簡(jiǎn)單、快速、便于大批量樣本檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)成為首選方法。盡管市面上可供選擇的試劑盒很多，但目前沒有哪種可以做到100%準(zhǔn)確，有的靈敏度高，有的特異性好，因此，在選擇最佳試劑的同時(shí)，根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)條件，適當(dāng)改良操作步驟，保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。ELISA 是根據(jù)著色深淺(吸光度值)判定待測(cè)抗原抗體的有無及含量，反應(yīng)時(shí)間是影響實(shí)驗(yàn)靈敏度和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素，尤其是對(duì)于弱陽性標(biāo)本［5］，足夠的溫育時(shí)間是防止假陰性出現(xiàn)的重要保證，選擇正確的實(shí)驗(yàn)步驟適當(dāng)延長(zhǎng)溫育時(shí)間可提高ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和弱陽性標(biāo)本的檢出率。

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