【摘 要】目的：建立茜草炭配方顆粒的超高效液相（UPLC）指紋圖譜，為茜草炭配方顆粒的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用UPLC法，ACQUITY UPLC BEH 300 C18 （2.1 mm×150 mm，1.7μm）為色譜柱；以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫；流速為0.3 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。結(jié)果：建立了茜草炭配方顆粒的UPLC指紋圖譜，確定了7個(gè)共有峰，并指認(rèn)其中1個(gè)化學(xué)成分，為異茜草素，其相似度結(jié)果均在0.9以上。結(jié)論：所建立的茜草炭配方顆粒指紋圖譜精密度高、穩(wěn)定性好，可為茜草炭配方顆粒的化學(xué)成分研究及質(zhì)量控制提供參考。

【關(guān)鍵詞】茜草炭配方顆粒；超高效液相色譜；指紋圖譜；異茜草素

【中圖分類號(hào)】R284.1"" 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A""" 【文章編號(hào)】1007-8517（2024）13-0037-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.13.zgmzmjyyzz202413009

Study on UPLC Fingerprint Analysis of Carbonized Rubiae Radix et Rhizoma Formula Granules

QIN Sheng1 TANG Ruiyin2 JIA Dezheng2 ZENG Zhihao2，3

1.Sinopharm Group Dezhong（Foshan） Pharmaceutical Co. Ltd.， Foshan 528012， China;

2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development in Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510095， China;

3. School of the Fifth Clinical Medicine， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510405， China

Abstract：

Objective To establish the UPLC fingerprint of Carbonized Rubiae Radix et Rhizoma （cRRR） formula Granules for identifying and evaluating its quality. Methods The UPLC analysis was performed on ACQUITY UPLC BEH 300 C18 （2.1 mm×150 mm， 1.7μm） column with a mobile phase of acetonitrile-0.1% formic acid by gradient elution. The flow rate was 0.3 mL/min. The column temperature was 30℃. The detection wavelength was 260 nm. Results The UPLC fingerprint was established， 7 common peaks were selected as the character fingerprint peaks with the identified of 1，3-dihydroxyanthraquinone. The similarity between the fingerprints of the 11 batches of cRRR formula Granules and the control fingerprints was all above 0.9. Conclusion The established fingerprint is stable and reliable， which can provide a reference for the study of chemical components and quality control of cRRR formula Granules.

Keywords：

Carbonized Rubiae Radix et Rhizoma Formula Granules; UPLC;Fingerprint; 1，3-Dihydroxyanthraquinone

茜草炭是由茜草片或段（茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根莖），照炒炭法炒至表面焦黑色而制成的。中醫(yī)理論認(rèn)為，茜草性寒，味苦，具有涼血、祛瘀、止血、通經(jīng)等功效［1-3］，而經(jīng)炒炭后，其寒性減弱，澀性增加，止血作用增強(qiáng)，具有“化瘀” “止血”雙向調(diào)節(jié)作用［4-5］，因此，茜草炭臨床上主要用于由瘀血阻滯引起的吐血、崩漏、外傷出血等出血癥的治療［6-7］。

中藥配方顆粒作為新型飲片的代表，既體現(xiàn)了中醫(yī)辨證施治、隨癥加減的特點(diǎn)、保留了中藥飲片的藥性藥效，又從根本上解決了中藥飲片“使用的不方便性”和“療效的不確定性”問題，具有現(xiàn)代中藥規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化的特性，形成了自己的優(yōu)勢(shì)特色和核心競(jìng)爭(zhēng)力。茜草炭配方顆粒是以茜草炭飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代工業(yè)技術(shù)精制而成的新型產(chǎn)品。由于茜草藥材來(lái)源、生產(chǎn)工藝等差異，提示茜草炭配方顆粒產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要性，另一方面，由于配方顆粒已失出了原飲片的外觀，一般的性狀檢查、薄層色譜圖鑒別、顯微鑒別等已無(wú)法滿足對(duì)茜草炭配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制的需求［8-9］，然而目前文獻(xiàn)中僅有對(duì)茜草炭原料藥的UPLC-Q-TOF-MS的化學(xué)成分分析［3］、紅外圖譜 ［4］、HPLC及UV含量測(cè)定 ［10-11］等分析研究，卻未見茜草炭配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)研究，國(guó)家公布的中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)中也尚未收錄茜草炭配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)，因此，加強(qiáng)茜草炭配方顆粒質(zhì)量控制研究，建立茜草炭配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)成為了急需解決的問題［12-13］。

中藥指紋圖譜技術(shù)，是評(píng)價(jià)中藥優(yōu)劣、鑒別真?zhèn)巍^(qū)分物種和確保其一致性和穩(wěn)定性的有效方法，其作為一種現(xiàn)代鑒定技術(shù)，能夠全面、整體地反映出中藥材的化學(xué)物質(zhì)的種類和數(shù)量。UPLC技術(shù)作為HPLC技術(shù)的升級(jí)，具有更高的分離能力和靈敏度，將UPLC技術(shù)應(yīng)用于中藥指紋圖譜研究中，可實(shí)現(xiàn)中藥品種的準(zhǔn)確、快速、高通量的檢定。本研究采用UPLC法，探索并建立了茜草炭配方顆粒的UPLC指紋圖譜方法，可為后續(xù)茜草炭配方顆粒的鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UPLC色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；Mettler Toledo×S205DU電子分析天平（瑞士- METTLER TOLEDO公司）；Millipore Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國(guó)默克密理博公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；JJ500型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）。

1.2 試藥 乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；水為自制超純水；甲醇、甲酸等實(shí)驗(yàn)用試劑為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）；異茜草素對(duì)照品（批號(hào)：13475，純度gt;98%）購(gòu)于上海澤楷國(guó)際貿(mào)易有限公司；11批茜草炭配方顆粒均購(gòu)于廣東一方制藥有限公司，茜草炭配方顆粒來(lái)源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH 300 C18 （2.1 mm×150 mm，1.7μm）柱；流動(dòng)相：乙腈（A）- 0.1%甲酸（B），梯度洗脫；洗脫梯度：0～5 min，4%～15%A；5～10 min，15%～23%A；10～15 min，23%～38%A；15～28 min，38%～41%A；28～29 min，41%～95%A；29～34 min，95%A；34～35 min，95%～4%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；柱溫：30℃；流速：0.30 mL·min-1；進(jìn)樣量1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取異茜草素對(duì)照品適量，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為232.00 μg/mL的異茜草素對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.3 供試品溶液制備 取茜草炭配方顆粒樣品粉末（過三號(hào)篩）約0.25 g，精密稱定，置50 mL具塞錐瓶中，精密加入70%（v/v）甲醇水溶液20 mL，稱重，置于超聲波清洗機(jī)中超聲30 min，待溶液放冷后，用70%（v/v）甲醇水溶液補(bǔ)重，搖勻，取續(xù)濾液（0.22μm濾膜），即得。

2.4 方法學(xué)試驗(yàn)

2.4.1 精密度考察 取同一批次茜草炭配方顆粒供試品溶液（S1），按“2.1”規(guī)定方法，于UPLC儀中重復(fù)測(cè)試6次，得色譜圖，以7號(hào)峰（異茜草素）為參照，分別計(jì)算各色譜圖中7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間（RRT）的RSD值在0.11%～0.21%之間，各共有峰的相對(duì)峰面積（RPA）的RSD在0.40%～2.67%之間，均小于3%，表明所用UPLC儀器精密度良好。

2.4.2 重現(xiàn)性考察 取同一批次茜草炭配方顆粒樣品（S1），照“2.3”項(xiàng)下規(guī)定供試品制備方法分別同時(shí)處理6份供試品溶液，按“2.1” 規(guī)定方法，分別進(jìn)樣，得色譜圖，以7號(hào)峰（異茜草素）為參照，分別計(jì)算各色譜圖中7個(gè)共有峰的RRT的RSD值在0.09%～0.18%之間，各共有峰的RPA的RSD在0.54%～2.98%之間，均小于3%，表明所建立的方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一批次茜草炭配方顆粒供試品溶液（S1），按“2.1” 規(guī)定方法，于UPLC儀中，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h重復(fù)測(cè)試，得色譜圖，以7號(hào)峰（異茜草素）為參照，分別計(jì)算各色譜圖中7個(gè)共有峰的RRT的RSD值在0.01%～0.88%之間，各共有峰的RPA的RSD在0.04%～0.21%之間，均小于3%，表明供試品溶液24 h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

2.5 茜草炭配方顆粒指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 將11批茜草炭配方顆粒照“2.3”項(xiàng)下的制備方法進(jìn)行處理得供試品溶液，按“2.1” 規(guī)定方法進(jìn)行測(cè)定，得到11批茜草炭配方顆粒UPLC色譜圖。如圖1。

將所得的11批茜草炭配方顆粒的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件，采用以下方法擬合指紋圖譜共有模式圖（如圖2所示）：S1為參照，時(shí)間窗寬度為0.1 min，中位數(shù)法，峰點(diǎn)校正，數(shù)據(jù)自動(dòng)匹配。

通過數(shù)據(jù)分析，指紋圖譜中共確認(rèn)了7個(gè)共有特征峰；通過與對(duì)照品色譜的保留時(shí)間及紫外掃描圖比對(duì)，指認(rèn)了7號(hào)峰為異茜草素，并以其為參照峰，計(jì)算各共有特征峰的RRT和RPA，結(jié)果見表2、表3。將11批茜草炭配方顆粒指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度比較，分別為0.962、0.993、0.975、0.996、0.955、0.995、0.991、0.979、0.997、0.997、0.970，均大于0.9，表明不同批次樣品質(zhì)量較穩(wěn)定。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液等流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，甲醇-水體系出峰較少，乙腈-水體系色譜峰較寬且基線不平，乙腈-0.1%甲酸溶液體系色譜峰豐富，峰型較好，分離度好且穩(wěn)定性高，故選用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相體系。另外，通過比較不同色譜柱的色譜行為，發(fā)現(xiàn)Phenomenex Luna Omega Polar柱分離度不好，色柱出峰時(shí)間晚，分離度差，整體信息較少；而ACQUITY UPLC BEH 300 C18柱所得譜圖信息較豐富，整體分離度較好，且峰面積大，峰型好，最終選擇ACQUITY UPLC BEH 300 C18作為本次試驗(yàn)的色譜柱。

在擬定的色譜條件下，對(duì)不同的提取溶劑進(jìn)行考察，分別用50%（v/v）乙醇水溶液、70%（v/v）乙醇、乙醇、50%（v/v）甲醇水溶液、70%（v/v）甲醇水溶液作為提取溶劑，結(jié)果表明，用70%（v/v）甲醇水溶液提取時(shí)，能夠分離出較多峰型和分離度較好的色譜峰，且峰面積大，極性大和極性小的成分都被提取出來(lái)，能較大限度地反映藥材的成分和信息。綜合考慮圖譜信息和色譜峰面積，最終選用70%（v/v）甲醇水溶液作為樣品的提取溶劑。

質(zhì)量是影響配方顆粒療效的關(guān)鍵因素，本研究針對(duì)茜草炭配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的不足，通過系統(tǒng)研究，建立了其指紋圖譜，確認(rèn)了7個(gè)共有特征峰（7號(hào)峰為異茜草素），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同批次茜草炭配方顆粒樣品的指紋圖譜相似度較高，提示茜草炭配方顆粒成分組成批間差異小，工藝及產(chǎn)品質(zhì)量較為穩(wěn)定。所建立的方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，為茜草炭配方顆粒的鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制，特別是產(chǎn)品穩(wěn)定性的研究，提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（編輯：陶希睿）

作者簡(jiǎn)介：秦升（1977—），男，漢族，本科，制藥工程師，研究方向?yàn)橹兴幉幕亟ㄔO(shè)、中藥材研究分析。E-mail：172820230@qq.com

通信作者：茜草炭配方顆粒UPLC指紋圖譜研究