王盈予+夏曦+李曉薇+丁雙陽+沈建忠??

摘 要 建立了檢測雞的皮和脂肪中抗球蟲類藥物的超高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品采用甲醇、乙腈、乙酸（4∶1∶0.05；V/V） 混合溶液提取，提取液經(jīng)Sep Pak tC18固相萃取柱富集凈化，在電噴霧正離子模式下，以多反應(yīng)監(jiān)測模式采集數(shù)據(jù)，進(jìn)行定性與定量分析。結(jié)果表明，常山酮和氯苯胍的檢出限均為 7.0 μg/kg，定量限為20 μg/kg；鹽霉素、莫能菌素、甲基鹽霉素、馬杜霉素和拉沙洛菌素的檢出限均為 5.0 μg/kg，定量限為15.0 μg/kg。本方法在15～200 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)的回收率為75%～110%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤12.8%， 日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤13.4%。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜； 串聯(lián)質(zhì)譜； 抗球蟲藥； 殘留

1 引 言

球蟲病是由寄生于宿主腸道或膽管上皮細(xì)胞內(nèi)的艾美耳科原蟲引起的一種寄生蟲病，是集約化養(yǎng)雞業(yè)中最重要的疾病之一。聚醚類抗生素（Polyether antibiotics，PEs）、常山酮（Halofuginone，HAL）、氯苯胍（Robenidine，ROB）等是目前常用的抗球蟲藥物。目前， 球蟲病主要以預(yù)防為主，將抗球蟲藥物拌入飼料定期飼喂，效果較好，因此也易產(chǎn)生雞組織中抗球蟲藥物的殘留。

動(dòng)物源性組織中抗球蟲藥物的檢測方法已有不少報(bào)道[1～5]。Mortier等建立了雞蛋中同時(shí)檢測5種抗球蟲藥的液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法[6]，該方法采用乙腈作為提取液，定量限（LOQ）為0.75～6.0 μg/kg，檢出限為（LOD）0.9～8.3 μg/kg。Galarini等建立了雞蛋中11種抗球蟲藥的液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法[7]，樣品用乙腈提取，正己烷脫脂，硅膠柱凈化。Moloney等報(bào)道了同時(shí)測定雞蛋及肌肉組織中20種抗球蟲藥殘留的高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法[8]。Olejnik等建立了雞肝中12種抗球蟲藥殘留的液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法[9]，樣本用乙腈進(jìn)行提取，氧化鋁柱脫脂，HLB固相萃取柱凈化。在已有的文獻(xiàn)中，多為檢測雞蛋、雞肉、雞肝等基質(zhì)的方法，而雞皮和脂肪的確證方法幾乎沒有。我國農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告明確規(guī)定了多種抗球蟲藥在皮脂中的最大殘留限量（MRL）[10]，因此建立雞皮及脂肪組織中抗球蟲藥物的多殘留檢測方法是十分必要的。

本研究建立了雞的皮及脂肪中7種抗球蟲藥物（常山酮、氯苯胍、鹽霉素、甲基鹽霉素、莫能菌素、沙拉洛菌素、馬杜霉素）的超高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC MS/MS）確證檢測方法，填補(bǔ)了該類動(dòng)物組織中抗球蟲類藥物多殘留的確證方法空白。本方法靈敏度高，選擇性好，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，能夠滿足抗球蟲藥物多殘留的定性與定量分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Acquity UPLC Premier XE 超高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；AM 2組織勻漿機(jī)（日本Nissei公司）；5804R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；HQ 60 II渦旋混合器（北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司）；固相萃取裝置（美國Waters公司）；N Evap 112氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；GHP濾膜（0.2 μm，美國Pall公司）；Sep Pak tC18固相萃取柱（500 mg/6 mL，美國Waters公司）；Milli Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取適量的常山酮、氯苯胍、鹽霉素、莫能菌素、甲基鹽霉素、馬杜霉素、拉沙洛菌素對(duì)照品，用甲醇溶解，配制成1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，

Symbolm@@ 20 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確量取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋，配制成10 mg/L的7種抗球蟲藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，

Symbolm@@ 20 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量的10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，

Symbolm@@ 20 ℃保存。

2.3 樣品預(yù)處理

稱?。?.00±0.02） g試樣，加入10 mL提取液，渦動(dòng)2 min；在

Symbolm@@ 5 ℃，10000 r/min 離心10 min，取出上清液，殘?jiān)貜?fù)提取一次。合并提取液，混勻。取上清液4 mL，加水2 mL渦動(dòng)1 min， 5000 r/min離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加水2 mL渦動(dòng)1 min， 5000 r/min離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加水15 mL，混勻備用。C18柱用5 mL甲醇、5 mL水活化，將備用液全部過柱。先后用3 mL水、3 mL 20%甲醇溶液淋洗，用洗脫液10 mL洗脫。洗脫液于40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，加?00 μL甲醇 水（50∶50，V/V）溶液渦動(dòng)1 min復(fù)溶，14000 r/min 離心10 min，過濾膜后供液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2.4 色譜 質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件 Acquity UPLC BEHC18色譜柱（50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸甲醇溶液；梯度洗脫： 0～0.5 min， 90% A； 0.5～1.0 min， 90%～0% A； 1.0～2.5 min， 0% A； 2.5～2.6 min， 0%～90% A； 2.6～4.0 min， 90% A。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源，正離子掃描（ESI+）；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量： 600 L/h；錐孔氣流量：30 L/h；測試藥物的母離子、子離子及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 前處理方法的選擇

在被分析的化合物中，常山酮極性較強(qiáng)，而聚醚類藥物極性較弱，二者性質(zhì)上的差異給樣品的提取和凈化帶來了極大的挑戰(zhàn)，而且雞皮和脂肪組織中非極性干擾物很多，也使得樣品前處理更為困難。

采用不同的溶劑，如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，以及溶劑組合作為提取溶劑，從提取回收率及共提取雜質(zhì)干擾兩方面來評(píng)價(jià)提取效果，如圖1所示，甲醇 乙腈的混合溶液提取回收率較高。優(yōu)化了甲醇和乙腈的比例，并分別加入1%、2%、5%的甲酸和乙酸調(diào)節(jié)pH值，最終選擇了甲醇 乙腈 乙酸（4∶1∶0.05；V/V）混合溶劑進(jìn)行提取。用有機(jī)試劑對(duì)皮脂組織進(jìn)行提取后，粗提液中有大量的脂類物質(zhì)需要去除，而聚醚類藥物的非極性太強(qiáng)，常用的正己烷液 液萃取除脂方法會(huì)嚴(yán)重影響聚醚類藥物的回收率，因此考慮直接進(jìn)行固相萃取（SPE）凈化。運(yùn)用不同品牌不同類型的SPE柱進(jìn)行凈化，發(fā)現(xiàn)正相柱不適合純化常山酮，而聚醚類藥物在離子交換柱上的回收率偏低，所以采用反相柱。反相SPE柱的上樣液要求水相比例高，以防止分析物穿漏。將提取溶液揮發(fā)干燥后再進(jìn)行復(fù)溶，結(jié)果不甚理想。一方面，提取溶液濃縮干燥的時(shí)間較長；另一方面，復(fù)溶液中有機(jī)相比例過高則不滿足初衷，過低則聚醚類藥物有損失。采用稀釋法，但是直接加入大量的水稀釋提取液，容易渾濁乳化，進(jìn)而影響SPE的效果。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，采用了逐級(jí)稀釋的辦法，雖然稍微繁瑣，但是效果良好。比較了3種反相SPE柱Oasis HLB、Sep pak tC18和Bond Elut C18，可能是因?yàn)镠LB小柱的含碳量較低，對(duì)于聚醚類藥物的回收率難以讓人滿意，而另外兩款C18小柱的回收率滿足要求（圖2）。因?yàn)閠C18小柱的穩(wěn)定性更佳，平行樣品的差異較小，所以確定使用該SPE柱。優(yōu)化了SPE的洗滌和洗脫條件，用20%甲醇溶液可以洗掉更多的干擾物質(zhì)，不會(huì)影響回收率，而在洗脫液中高比例的乙酸乙酯有助于聚醚類藥物的洗脫。

采用的BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm）對(duì)7種抗球蟲藥物均具有較好的保留，且容易獲得良好的分離效果和對(duì)稱的峰形，可滿足質(zhì)譜檢測的要求。流動(dòng)相的選擇和組成對(duì)化合物的分離也至關(guān)重要，甲醇和乙腈是常見的分析抗球蟲藥物的流動(dòng)相[5～7]，本研究分別以甲醇（含0.1%甲酸）和乙腈（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈會(huì)使得拉沙洛菌素的峰形變寬，而甲醇則獲得更為尖銳的色譜峰，可以提高靈敏度和分離度。摸索不同的流動(dòng)相梯度洗脫比例，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定了2.4節(jié)所示條件，可在4 min內(nèi)完成7種抗球蟲類藥物的快速分離檢測，大大提高了分析速度，節(jié)省有機(jī)溶劑的使用，降低了分析成本。

目前， 抗球蟲藥的檢測多采用電噴霧離子源，本研究在串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化中，以1.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行7種抗球蟲藥物的正離子全掃描，確定被測物的母離子，并對(duì)電離電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。在子離子掃描模式下，選擇強(qiáng)度最高的兩個(gè)子離子作為定性與定量離子，并通過系列碰撞能量的優(yōu)化，確定各子離子最佳的碰撞能量。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 線性范圍和基質(zhì)效應(yīng) 在比較標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白樣品加標(biāo)溶液的響應(yīng)值時(shí)發(fā)現(xiàn)，7種抗球蟲藥物均存在不同程度的離子抑制現(xiàn)象，其中最嚴(yán)重的常山酮高達(dá)30%～40%。為了克服基質(zhì)效應(yīng)的影響，制備了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性范圍的驗(yàn)證。取空白樣品按照2.3節(jié)的步驟進(jìn)行處理，并在洗脫液中加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，吹干并復(fù)溶，得到濃度為5， 10， 50， 100， 250和500 μg/L的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按照2.4節(jié)所確定的條件進(jìn)行分析，線性回歸相關(guān)結(jié)果見表2。從表2可見，7種抗球蟲藥物的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，表明其在5～500 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3.2 靈敏度與特異性 制備一系列不同濃度的空白加標(biāo)樣品，按照所確定的方法進(jìn)行檢測，以信噪比S/N=3的樣品濃度為方法檢出限（LOD），以信噪比S/N=10的樣品濃度為方法定量限（LOQ）。具體結(jié)果見表2，方法的檢出限和定量限遠(yuǎn)低于最高殘留限量。對(duì)于方法特異性的考察，分析了不同來源的20份空白樣品，空白樣品質(zhì)量色譜圖在被測化合物保留時(shí)間附近沒有發(fā)現(xiàn)明顯的雜峰，表明基質(zhì)干擾小，特異性滿足藥物殘留分析的要求。

3.3.3 回收率與精密度 在雞的皮脂組織中進(jìn)行3個(gè)濃度水平（LOQ、5倍LOQ、10倍LOQ）的空白樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度6個(gè)平行樣品，進(jìn)行3個(gè)批次的樣品分析，計(jì)算回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)，結(jié)果如表3所示。7種抗球蟲藥的日內(nèi)平均回收率在75.7%～108.0%之間，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<12.8%；日間平均回收率在75.4%～96.3%之間，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<13.4%，表明方法的回收率高，穩(wěn)定性好?？瞻讟悠泛蚅OQ濃度水平的空白加標(biāo)樣品的質(zhì)量色譜圖見圖3。

3.4 實(shí)際樣品的檢測

運(yùn)用本方法對(duì)市場上隨機(jī)購買的80份雞皮及脂肪樣品進(jìn)行檢測，其中2個(gè)樣品呈陽性，均為莫能菌素，含量分別為51.6和87.1 μg/kg，低于最高殘留限量。結(jié)果表明， 本方法具有穩(wěn)定性好、簡單快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，適用于雞皮及脂肪組織中抗球蟲藥物的確證檢測。

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