范世明+徐惠龍+謝心月+蔡碧雅+鄒福賢+許文+謝志森+黃心平

[摘要]采用超高效液相色譜建立三葉青葉指紋圖譜，并同時測定8種酚類成分（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊苷、異牡荊苷）的含量，為三葉青葉質(zhì)量評價提供依據(jù)。采用UHPLC法，Welch UHPLC Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm），流動相為乙腈-0.1%甲酸（含5%甲醇）水梯度洗脫，流速0.4 mL·min^-1，柱溫30 ℃，采用國家藥典委員會“相似度評價軟件2004AB”處理分析，建立41批不同產(chǎn)地三葉青葉的指紋圖譜，共標(biāo)定15個共有峰并對不同產(chǎn)地進行聚類分析，然后選擇其中8個主要的酚類成分作為定量指標(biāo)，建立UHPLC同時測定8種主要酚類成分含量的方法，經(jīng)方法學(xué)驗證該研究建立的三葉青葉指紋圖譜和8種酚類成分含量測定方法簡便有效、靈敏、準(zhǔn)確，可為綜合評價三葉青葉的質(zhì)量提供參考。

[關(guān)鍵詞]三葉青葉； UHPLC； 指紋圖譜； 含量測定

[Abstract]A novel method combining ultra-high performance liquid chromatography （UHPLC） fingerprint and simultaneous quantitative analysis of eight phenolic components was developed and validated for quality evaluation ofTetrastigma hemsleyanum leaves. For fingerprint analysis， 15 peaks were selected as the common peaks to evaluate the similarities among 41 batches ofT. hemsleyanum leaves collected from different regions. Additionally， simultaneous quantification of eight markers， including neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， isoorientin， orientin， vitexin-2-O-rhamnoside，vitexin and isovitexin， was performed and the obtained data demonstrated that our method has achieved desired linearity， precision and accuracy. Clustering statistical analysis was further application inT. hemsleyanum leaves from different regions. The results indicated that new approach conbine ultra-high performance liquid chromatography （UHPLC） fingerprint and simultaneous quantitative analysis of eight phenolic components was applicable in quality control ofT. hemsleyanum leaves.

[Key words]Tetrastigma hemsleyanum leaves； UHPLC； fingerprint analysis； quality control

doi：10.4268/cjcmm20162115

三葉青是我國特有的珍稀藥用植物，為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg，以塊根或者全草入藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛的功效^[1]，并廣泛用于多種國藥準(zhǔn)字中成藥，如排石利膽膠囊、華佗風(fēng)痛寶、結(jié)石康膠囊等。前期課題組已經(jīng)針對三葉青的塊根進行了質(zhì)量評價^[2-4]，但由于三葉青對生長環(huán)境的要求較為苛刻，在自然條件下生長緩慢，加上近年來針對三葉青塊根人為無節(jié)制的采挖，野生的三葉青已經(jīng)成為瀕危藥用植物^[5]，目前多數(shù)三葉青藥材的使用多為塊根部位，對三葉青葉資源的開發(fā)利用的報道較少，而現(xiàn)代藥理研究表明三葉青葉也具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫^[6-7]等作用，同時也是結(jié)石康膠囊等中成藥的直接原料，因此為了加大三葉青資源的應(yīng)用，本文采用UHPLC建立三葉青葉指紋圖譜，并同時測定8種主要酚類成分（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊苷、異牡荊苷）的含量，為三葉青葉質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料

安捷倫LC1290超高效液相色譜儀（安捷倫公司）；CPA225D型1/10萬分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-500E臺式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FY135型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純（德國MERCK公司），Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司），其余試劑均為分析純。

對照品新綠原酸（批號SH906332）、隱綠原酸（批號SH905997）、1-咖啡?？鼘幩幔ㄅ朣H1241878）和咖啡酸（批號SH331395）購自北京賽百草科技有限公司，異葒草苷、葒草苷、葒草素鼠李糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊苷、異牡荊苷、綠原酸由本實驗室分離制備^[8-9]，純度經(jīng)HPLC-DAD（面積歸一法）檢測純度均大于98.0%。

三葉青葉41批樣品分別采自不同產(chǎn)地，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物實驗室范世明高級實驗師及生藥教研室黃澤豪副教授鑒定，為葡萄科植物三葉青T. hemsleyanum的干燥葉，樣本存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物標(biāo)本室，樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜研究色譜條件

采用Welch UHPLC Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）；流動相為乙腈（A）-水（含0.1%甲酸，5%甲醇）（B），流速0.4 mL·min^-1，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，梯度洗脫（0～2 min， 2% A； 2～4 min， 2%～10% A； 4～7 min， 10% A； 7～15 min， 10%～12% A； 15～20 min， 12% A； 20～30 min， 12%～18% A； 30～50 min， 18%～20% A），檢測波長330 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊苷、異牡荊苷對照品適量，精密稱定，加入甲醇分別制備質(zhì)量濃度為0.556， 0.580， 0.592， 0.552， 0.562， 0.620， 0.566， 0.570 g·L^-1的單一對照品儲備液。其他質(zhì)量濃度的對照品溶液由80%甲醇稀釋儲備液得到。

2.2.2 供試品溶液制備 將三葉青干燥葉粉碎過60目篩得三葉青葉粉末。取三葉青葉粉末0.1 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（250 W， 50 kHz），放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足失重，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜研究方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 精密吸取同一份三葉青葉供試品5 μL連續(xù)進樣6次記錄色譜圖，以牡荊苷為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD小于0.041%、相對峰面積RSD小于2.1%，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”進行評價，相似度為0.99，表明儀器精密度好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取同一批三葉青葉子粉末6份，制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液5 μL，記錄色譜圖，以牡荊苷為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD小于0.035%、相對峰面積RSD小于2.1%，相似度為0.99，表明該方法重復(fù)性好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液5 μL，分別在0， 2， 4， 8， 12， 24 h進樣，記錄色譜圖，以牡荊苷為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD小于0.037%，相對峰面積RSD小于1.8%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 三葉青葉的指紋圖譜建立

將41批三葉青葉制備成供試品溶液進樣5 μL，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”進行數(shù)據(jù)處理， 設(shè)定S1為參照圖譜， 將其他樣品的色譜峰與參照圖譜進行自動匹配， 生成三葉青葉指紋圖譜色譜疊加圖，見圖1。

2.4.1 共有峰的標(biāo)定 根據(jù)41批三葉青葉的指紋圖譜檢測結(jié)果，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”，在對照圖譜上共標(biāo)定15個共有峰，色譜圖中保留時間（tR）為38.97 min處的13號色譜峰（牡荊苷）響應(yīng)較高，分離良好，保留時間合適，故此選此峰為參照峰，同時采用課題組分離的三葉青化學(xué)成分進行色譜共有峰指認(rèn)，鑒定其中12個共有峰，見圖1。

2.4.2 三葉青葉指紋圖譜相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”，對41批不同產(chǎn)地三葉青藥材的指紋圖譜檢測數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理，分析了41批三葉青藥材的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，見表2。

2.4.3 聚類分析 采用DPS 16.0將41批三葉青的15個共有峰峰面積作為原始數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)的聚類分析，見圖2?？芍陂撝荡笥?.8時，三葉青葉資源可以分為兩大類；2.5～3.5時可以分為4大類[第1類（5個）：S13，S14，S6，S4，S3；第2類（2個）：S2，S5；第3類（19個）：S26，S23，S24，S19，S38，S32，S18，S41，S40，S37，S17，S33，S35，S25，S28，S22，S16，S29，S15；第4類（15個）：S8，S12，S31，S11，S9，S36，S7，S30，S21，S34，S20，S39，S10，S27，S1]，同時對15個共有峰面積進行聚類主成分分析，發(fā)現(xiàn)新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊苷、異牡荊苷為指紋圖譜共有模式的最主要成分，因此選擇這8個指標(biāo)進行含量測定研究。

2.5 三葉青中8種酚類成分含量測定

2.5.1 色譜條件 采用Welch UHPLC Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（含5%甲醇）（B），流速0.4 mL·min^-1，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，梯度洗脫（0～2 min， 1% A； 2～4 min， 1%～9% A； 4～7 min， 9%～9% A； 7～15 min， 9%～12%A； 15～20 min， 12% A； 20～30 min， 12～18% A； 30～50 min， 18%～20% A）， 檢測波長330 nm。

2.5.2 供試品和對照品溶液制備 同2.2項下方法制備供試品和對照品溶液。

2.5.3 系統(tǒng)適用性試驗 按2.5.1項下色譜條件進行分析，8個成分理論塔板數(shù)均大于5 000，分離度大于1.5，對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖3。

2.5.4 檢測線與定量限 在選定的色譜條件下，通過稀釋不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品得到各個化合物的定量限（S/N為10）和檢測限（S/N為3），見表3。

2.5.5 線性和范圍考察 取各對照品儲備液，用80%甲醇分別稀釋10，12.5，16.6，5，50，200，250，500，1 000，2 500，5 000倍的8種系列對照品混合溶液。精密吸取5 μL進樣并測定峰面積，以峰面積（Y）對分析物濃度（X）作線性回歸曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。

2.5.6 精密度試驗 精密吸取同一份對照品混合溶液5 μL，1日內(nèi)連續(xù)進樣6次，連續(xù)進樣3 d，記錄8種酚類成分的峰面積，其峰面積日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD范圍均在1.4%～2.1%，表明精密度良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗 制備一份供試品，取該供試品溶液分別于0， 2， 6， 10， 12， 24 h進樣分析，記錄8種酚類成分的峰面積，其峰面積的RSD范圍均在1.1%～1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批三葉青樣品6份，制備成供試品溶液進樣測定峰面積，計算8種酚類成分的含量，其含量RSD范圍均在1.4%～3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.9 回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品0.05 g，平行6份，分別精密加入一定量（近似1∶1）的各個對照品液，按照2.2.2項下制備供試品溶液，進樣測定峰面積，計算含量，得到平均回收率為96.50%～103.2%，RSD為2.7%～3.7%。

2.5.10 樣品含量測定 分別精密稱取不同批次的三葉青葉樣品粉末0.1 g，制備成供試品溶液，進樣測定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 三葉青葉的提取

在樣品前處理上，考察了不同的提取方法（回流、超聲、索氏提取）、提取溶劑（不同濃度甲醇、乙腈）、溶劑倍量、提取次數(shù)、提取時間對實驗的影響。結(jié)果表明超聲提取和回流提取效果較佳，且兩者無明顯差異，故樣品制備最終采用超聲提取，即50倍量甲醇，超聲30 min，提取1次。

3.2 色譜條件的選擇

在色譜柱選擇上，通過比較不同廠家不同粒徑色譜柱對三葉青葉中8種酚類成分的分離效果，最終選擇Welch UHPLC Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）。該色譜柱其顆粒填料小于普通HPLC柱，其柱效顯著高于普通5，3 μm粒徑色譜柱，色譜峰更窄從而靈敏度更高，分析時間縮短，流速也減小為0.4 mL·min^-1，節(jié)約流動相。對于流動相系統(tǒng)的選擇，先后比較了4 種流動相系統(tǒng)：乙腈-（含5%甲醇+0.1%甲酸）水，乙腈-0.1% 甲酸水，甲醇-0.1%甲酸水，甲醇-0.5%醋酸水，結(jié)果表明，乙腈-（含5%甲醇+0.1%甲酸）水三元溶劑系統(tǒng)能使指紋圖譜和含量測定系統(tǒng)分離度更好。經(jīng)過DAD光譜掃描，8種酚類成分在檢測波長330 nm下均有最大吸收波長，故選擇330 nm為檢測波長。

3.3 三葉青葉與塊根指紋圖譜比較

本次實驗根據(jù)41批三葉青葉的指紋圖譜檢測結(jié)果，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”，以牡荊苷作為參照峰，共標(biāo)定15個共有峰，經(jīng)過標(biāo)品比對鑒定其中12個共有峰，并且經(jīng)過相似度評價41批樣品的相似度均達到0.9以上，在閾值設(shè)定2.5～3.5時可以分為四大類。而查閱文獻，目前報道三葉青指紋圖譜研究的報道較少：程林等^[10]采用HPLC對三葉青塊根進行指紋圖譜研究，以β-谷甾醇為參照峰，共標(biāo)定了7個共有峰，并且對所采集的10個批次塊根樣品進行相似度分析，結(jié)果顯示塊根相似度為0.823～0.928，認(rèn)為可能由于產(chǎn)地、氣候、土壤等因素導(dǎo)致三葉青塊根化學(xué)成分存在一定的差異；張煜炯等^[11]對17批次的三葉青塊根氯仿部位進行HPLC指紋圖譜研究，共標(biāo)定15個共有峰，其中3個峰被確認(rèn)為槲皮素、山柰酚-3-O-新橙皮糖苷和β-谷甾醇，經(jīng)過聚類分析將17批樣品分為5類，17批樣品的相似度達到0.816～0.985，提示三葉青塊根的指紋圖譜的相似度相對低于葉子，并且從文獻指紋圖譜來看，三葉青葉子和塊根整體共有模式存在較大的差異。另一方面，從化學(xué)成分來看，課題組前期對三葉青塊根進行LC-Q-TOF-MS分析，共鑒定了塊根中24種成分^[3]，主要為有機酸如綠原酸和氧苷黃酮類成分，如山柰酚-3-O-蕓香糖苷；而本研究發(fā)現(xiàn)三葉青葉中除了綠原酸等有機酸成分外，主要黃酮類成分為碳苷類黃酮，如牡荊苷等，提示三葉青塊根和葉指紋圖譜的差異性可能是由于其化學(xué)成分種類和含量上存在差異性所致。

3.4 樣品測定結(jié)果

對于41批不同產(chǎn)地三葉青葉含量測定及指紋圖譜研究，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地三葉青葉中含有的化學(xué)成分種類差異不大，但8種酚類成分含量具有較大差異：從8個成分的含量均值來看，含量最高的為綠原酸，其質(zhì)理分?jǐn)?shù)范圍在0.413～17.077 mg·g^-1，并且以產(chǎn)地福建閩侯（S2）、福建福安（S13，S14）含量較高；其次是異葒草苷和牡荊苷，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為0.420～5.716，0.353～7.338 mg·g^-1，其中，福建閩侯（S2）、福建福州（S6）、福建福安（S14）產(chǎn)地的異葒草苷含量較高，福建閩侯（S2、S5）、浙江麗水（S4）產(chǎn)地的牡荊苷含量較高；而隱綠原酸的含量相對最少，質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍0.047～1.424 mg·g^-1，僅僅產(chǎn)地福建閩侯（S2，S5）較高于其他產(chǎn)地；從8種酚類成分總和來看，福建閩侯（S2，S5）、福建福安（S14）種植地的三葉青樣品的總酚含量最高，達到2.3%以上，提示該產(chǎn)地三葉青葉子適合于三葉青總酚物的進一步開發(fā)利用。不同產(chǎn)地三葉青含量上存在較大的差異外因上可能與不同地理環(huán)境（產(chǎn)地、氣候、土壤、溫度）、生長年限等有關(guān)，內(nèi)因上可能是由于不同產(chǎn)地三葉青葉中酚類成分的合成代謝酶的表達量存在差異，因此，課題組下一步擬從轉(zhuǎn)錄組角度分析不同產(chǎn)地三葉青中Unigene的差異性以揭示不同產(chǎn)地三葉青塊根和葉有效成分含量或者種類差異的原因。

4 結(jié)論

本實驗建立了UHPLC同時測定三葉青中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊苷、異牡荊苷8種酚類成分含量及指紋圖譜的方法，該方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可以為三葉青藥材質(zhì)量控制提供新的方法與參考依據(jù)。

[參考文獻]

[1]全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編.上冊 [M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1975：31.

[2]許文，傅志勤，林婧，等.UPLC-MS/MS法同時測定三葉青中10種黃酮類成分[J].藥學(xué)學(xué)報，2014，49（12）：1711.

[3]許文，傅志勤，林婧，等.HPLC-Q-TOF-MS和UPLC-QqQ-MS的三葉青主要成分定性與定量研究[J].中國中藥雜志，2014，39（22）：4365.

[4]范世明，黃澤豪，林婧，等. 蛇附子中4種黃酮類成分的分離及含量測定[J]. 中藥材，2014，37（12）：2226.

[5]錢麗華，戴丹麗，姜慧燕，等.瀕危藥用植物三葉青研究進展[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，27（7）：1301.

[6]陳麗蕓，郭素華. 三葉青的化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，36（12）：1368.

[7]Sun Yong， Li Hongyan， Hu Jiangning， et al. Qualitative and quantitative analysis of phenolics inTetrastigma hemsleyanum and their antioxidant and antiproliferative activities[J].J Agric Food Chem ，2013，61（44）： 10507.

[8]林婧，紀(jì)明妹，黃澤豪，等.三葉青的化學(xué)成分及其體外抗腫瘤活性研究[J].中國藥學(xué)雜志，2015，50（8）：658.

[9]傅志勤，黃澤豪，林婧，等.蛇附子化學(xué)成分及抗氧化活性研究[J].中草藥，2015，46（11）：1583.

[10]程林，胡軼娟，浦錦寶，等.三葉青的高效液相色譜指紋圖譜研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2013，48（4）：296.

[11]張煜炯，彭昕，吉慶勇，等.聚類分析和主成分分析法研究三葉青氯仿部位HPLC指紋圖譜[J].中成藥， 2016，38（3）：607.

[責(zé)任編輯 丁廣治]