向志雄++劉成洪++謝建樹

摘要 采用單劑量隨機交叉實驗設(shè)計，評價8只比格犬口服受試或參比醋酸艾司利卡西平片的相對生物利用度。用UPLC-MS/MS法測定血漿中的艾司利卡西林濃度，艾司利卡西平的線性范圍為：1.0～1000.0ng/ml；定量下限可達1.0ng/ml；受試和參比制劑的主要藥動學參數(shù)分別為：Tmax（1.72±1.2）和（1.50±0.9）h；Cmax（31300±14104）和（40088±18156）ng/ml，AUC0-1， （133121±60209）和（146926±61557）ng·h/ml，AUC0-∞（133171±60 207）和（147028±61593）ng·h/ml，tl/2（5.84±2.0）和（5.80±1.1）h。受試制劑艾司利卡西平的相對生物利用度為（106.1±102.6）%。結(jié)果顯示：兩制劑平均藥動學參數(shù)無統(tǒng)計學差異。

關(guān)鍵詞 醋酸艾司利卡西平片 超高效液相色譜·質(zhì)譜聯(lián)用法 藥動學 相對生物利用度

中圖分類號：R971.6； R969.1

文獻標示碼：A

文章編號：1006-1533（2016）01-0075-05

鈉通道阻滯藥醋酸艾司利卡西平片（eslicarbazepineacetate，la），是由葡萄牙的BIAL集團和其北美合作商Sunovion制藥以及其歐洲市場合作伙伴Eisai制藥共同開發(fā)的抗癲癇新藥，它是艾司利卡西平（S-Iicarbazepine，1）的醋酸酯前藥。臨床上該藥用于成人癲癇部分性發(fā)作（伴有或不伴有繼發(fā)性全身發(fā)作）的輔助治療，推薦的起始劑量為400mg，每日1次，1～2周后增至800mg，每日1次。國內(nèi)外發(fā)表的有關(guān)1血藥濃度的測定方法豐要有HPLC_UV、LC-MS和LC-MS/MS法，前處理方法有蛋白沉淀、液一液萃取，血漿需求量一般比較大（0.2-1.0ml），測定1的靈敏度較低（10～2000ng/ml）；有關(guān)比格犬血漿中1的超高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用測定方法，作者未見國內(nèi)外任何文獻報道。本實驗遵照美國FDA指導原則，建立了快速、靈敏、專屬性強的UPLC-MS/MS法，測定比格犬血漿樣品中1的濃度，考察了單劑量口服la后比格犬體內(nèi)的相對牛物利用度，為該制劑的臨床應用提供參考。

1 儀器與試藥

API4000 QTRAP型串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源（ESI）以及Analystl.5.1數(shù)據(jù)處理軟件（美國AppliedBiosystem公司）；Waters Acquity UPLC系統(tǒng)，包括二元輸液泵，自動進樣器，（美國Waters公司）；Valco2-Position型切換閥（美國Valco Instruments公司）。

1標準品（加拿大TRC公司，純度98%，批號2-KMT-145-3）；艾司利卡西平-d4（2，內(nèi)標，加拿大TRC公司，純度98%，批號2-TMH-153-5）；受試la（上海醫(yī)藥集團股份有限公司，規(guī)格800mg，批號201309IOA）；參比la（葡萄牙Bial制藥公司，規(guī)格800mg，批號GCSX）；乙腈和甲醇（Merck，色譜純）；甲酸（CNW，色譜純）；實驗用水為Millipore超純水；其余試劑均為市售分析純級試劑。8只比格犬，雄性，體重8～9kg[上海交通大學農(nóng)學院教學實驗練習場，動物牛產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2012-0005，動物合格證號2007000400308]。

2 方法

2.1 溶液配制

1儲備液：精密稱取1標準品5mg，加甲醇溶解，并制成質(zhì)量濃度為5000μg/ml的1儲備液。

內(nèi)標工作溶液：精密稱取2標準品lmg，加甲醇溶解，并制成質(zhì)量濃度為1000μg/ml的2儲備液，取適量內(nèi)標儲備液，用含0.1%甲酸溶液的甲醇稀釋，獲得濃度為20.0ng/ml的內(nèi)標工作溶液。

系列濃度血漿樣品：精密量取1儲備液適量，用甲醇稀釋得1濃度為20，18，6，2，0.6，0.2，0.04，0.02μg/ml的標準溶液。精密量取標準溶液各10μ1平行加入到190μ1比格犬空白血漿中，制得1濃度為1000、900、300、100、30、10、2和lng/ml的系列濃度血漿樣品。

質(zhì)控血漿樣品：精密量取1儲備液適量，用甲醇稀釋得濃度為16，4和0.06μg/ml的標準溶液。精密量取標準溶液各10μl平行加入到190μ1比格犬空白血漿中，制得1濃度為800、200和3ng/ml的高、中、低質(zhì)控血漿樣品。

2.2 色譜質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件

色譜柱：BEHC₁₈（2.1mmxl00mm，1.7μm，Waters公司）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A），含0.1%甲酸的甲醇溶液（B）；梯度洗脫（表1）；流速0→1.2min，250μ/min；1.3→2.4min，400μI/min； 2.5→3.0min，250μI/min；柱溫50℃；自動進樣器溫度4℃；進樣量10μl。

2.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子方式檢測；掃描方式為多反應監(jiān)測（MRM）；監(jiān)測離子對m/z255.O→m/z194.2（1）和m/z250.2→m/z 198.1（2）；去簇電壓（DP） 45V（I）和49V（2）；碰撞電壓（CE） 29V（1）和30V（2）；碰撞室噴出電壓（CXP） 12V；離子源電壓（IS）5500V；離子源溫度（TEM）600℃；霧化氣（Gasl，N2）壓力60psi；輔助氣（Gas2，N2）壓力60 psi；氣簾氣（CUR）壓力20psi；碰撞氣（CAD，N2）壓力Medium。

2.3 實驗方案

8只比格犬隨機分成2組。受試和參比制劑劑量均為800mg/只。采用雙周期交義試驗設(shè)計，兩次試驗周期間隔10d。每周期試驗給藥前禁食12h，整個試驗過程不禁水，給藥后4h方可進食。每次試驗均在比格犬清醒狀態(tài)下給藥，給藥時以50ml水送服藥物。分別于每周期給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75、l、2、3、4、6、8、12、24、36、48、72h取血2ml，置于肝素化離心管中，離心（6662g） 10 min，分離上層血漿，-80℃冰箱保存。

2.4 血漿樣品處理

精密取血漿樣品50μ1至1.5mlEP管中，加入500μl內(nèi)標工作溶液，混勻后離心（25314g）10min，取上清450μ1，真空濃縮儀吹干。用100μl65%甲醇（含0.1%甲酸）進行復溶，進樣。

2.5血漿樣品分析方法考察

2.5.1 方法的專屬性

以色譜保留時間和離子對定性確定1的色譜峰及其對應內(nèi)標峰。分別取6份不同個體的比格犬空白血漿，除內(nèi)標工作液改加含0.1%甲酸的甲醇外，其他按“2.4”項下方法處理，進樣測定。取空白犬血漿、最低定量限（LLOQ，lng/ml）血樣、空白犬血漿加1（200ng/ml）、比格犬給予l片la后0.25h的血樣，均按“2.2”項下方法處理，分別進樣，色譜圖見圖l。結(jié)果表明：內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。

2.5.2線性關(guān)系

取系列濃度血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后進樣分析。以血漿中待測物濃度c為橫坐標，待測物與內(nèi)標物的峰面積比值R為縱坐標，用加權(quán)（W=I/c2）最小二乘法進行回歸計算，求得回歸方程分別為：R=0.0032c+0.0017，r=0.998，表明1在1.0-1000.0ng/ml范圍內(nèi)線形關(guān)系良好。1的LLOQ為1.0ng/ml。

2.5.3 準確度與精密度

取質(zhì)控血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后進樣分析。每個濃度各6份，分別測定3批，計算日內(nèi)（n=6）、日間（n=3） RSD和方法回收率（表2）。

2.5.4 提取回收率和基質(zhì)效應

按“2.4”項下操作，制備低、中、高3個濃度的對照品血漿，每個濃度6個樣品。同時取6份不同個體的50μl空白比格犬血漿，除不加內(nèi)標溶液外，按照生物樣品前處理方法處理后，向獲得的全部上清液中分別加入2.5μl的質(zhì)控樣品添加液和內(nèi)標溶液，渦流混勻后，于真空濃縮儀吹干，100μl溶液（Milli-Q Water/甲醇（35∶65，v/v），含0.1%甲酸）進行復溶，3個濃度水平。進樣10μl進行UPLC-MS/MS分析，獲得相應峰面積，以每一濃度2種處理方法的峰面積比值計算提取回收率，1低、中、高3個濃度的提取回收率士RSD分別為：（90.2±12.76）%、（80.7±12.59）%和（84.5±3.80）%：2的提取回收率為（100.1±4.26）%。實驗中對1和2的基質(zhì)效應進行了考察，結(jié)果相對偏差RE均小于15%，表明血漿無明顯基質(zhì)效應存在。

2.5.5 靈敏度和穩(wěn)定性試驗

配制6份1質(zhì)量濃度為lng/ml的LLOQ樣品，按“2.2”項下操作后測定，計算LLOQ濃度測定方法的準確度與精密度。S/N>5，RSD=7.76%，方法回收率為（96.7±7.76）%，本實驗分別考察了低、中、高濃度質(zhì)控血漿樣品在不同條件下的穩(wěn)定性（n=6）。結(jié)果表明在上述條件下血漿樣品均穩(wěn)定（表3）。本實驗還考察了儲備液-20℃放置30d和工作溶液室溫放置6h的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，儲備液和工作液在規(guī)定的儲存條件下穩(wěn)定。

2.5.6 稀釋效應驗證試驗

本方法中1的線性范圍為1.0-1000.0ng/ml，對于濃度超出線性范圍的樣品，用空白比格犬血漿稀釋后再測定，因此進行了稀釋效應驗證試驗。配制1濃度為40000 ng/ml的6份血漿樣品，精密吸取20μl，加入空白血漿980μl，混勻。然后從中取出50μl，按“2.2”項下操作后測定，結(jié)果準確度為108.7%，RSD=2.42%，表明血漿樣品稀釋對測定結(jié)果沒有影響。

3 結(jié)果

8只比格犬口服la受試和參比制劑后的平均藥時曲線見圖2，采用Kinetica 5.1軟件非房室方法計算比格犬給藥后1的豐要藥動學參數(shù)：達峰時間Tmax和達峰濃度Cmax采用實測值；藥物濃度一時間曲線下面積AUC0-t采用梯形法計算值，t為最后一個可測定濃度樣品的時間點；AUCO-∞按下列公式計算：AUCO-∞=AUC0-t+Ct/ke，Ct為最后一個可測定時間點的濃度，ke為消除速率常數(shù)；血漿消除半衰期t1/2=0.693/ke；相對牛物利用度F=（受試制劑AUC0-t/參比制劑AUC0-t）×l00%。采用配對t檢驗，比較給予受試或參比la制劑后的藥動學參數(shù)的差異，Tmax采用非參數(shù)檢驗，其他參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行檢驗。結(jié)果顯示：經(jīng)統(tǒng)計檢驗，藥動學參數(shù)Tmax、Gmax、AUC0-t、AUCo和t1/2在受試與參比la制劑間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

4 討論

1）色譜條件為了提高分析靈敏度，改善峰形并縮短分析時間，分別嘗試用甲醇和乙腈作為流動相中的有機相，結(jié)果表明前者背景噪音較低，且待測物的響應更穩(wěn)定，在流動相中加入甲酸可使待測物的響應增加，峰形得到改善，同時采用內(nèi)標2，有效避免離子抑制與內(nèi)源性物質(zhì)干擾。為了減少殘留，在目標化合物出峰以后采用大流速沖洗系統(tǒng)。

2）血樣樣品處理文獻報道的血漿樣品處理方法有蛋白沉淀法、液一液萃取法等。液一液萃取法比沉淀蛋白處理繁瑣，本實驗在不影響靈敏度的前提下，采用了極其簡便的蛋白沉淀法，并在優(yōu)化沉淀條件時，對沉淀試劑進行了考察。血漿樣品在不同體積甲酸作為酸化試劑的條件下，分別經(jīng)甲醇、乙腈溶劑進行沉淀，通過UPLC-MS/MS進行分析，發(fā)現(xiàn)以500μl含0.1%甲酸的甲醇為沉淀試劑，提取上清，并用起始流動相稀釋，提取回收率高且穩(wěn)定。

3）受試參比制劑的相對牛物利用度由于母藥經(jīng)過體循環(huán)后濃度很低，所以測定豐要代謝物1，并計算其藥動學參數(shù)。經(jīng)過方法驗證測得的受試參比制劑的藥動學參數(shù)標準差有點偏大，其豐要原因是因為比格犬的個體差異大造成的。比較兩制劑的藥動學參數(shù)，表明兩制劑藥動學性質(zhì)沒有統(tǒng)計學差異。