陳楊達豪 勞楊駿 徐彬 徐衛(wèi)星 張樹良 盛紅楓

【摘 要】目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的方法探討張氏腰痛方治療腰椎間盤退變（LIDD）的分子生物學機制。方法：通過檢索數(shù)據(jù)庫，篩選張氏腰痛方的活性成分和作用靶點，以及LIDD的相關(guān)基因。通過R軟件篩選張氏腰痛方治療LIDD的共同靶基因，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)以及共同靶基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，同時挖掘網(wǎng)絡(luò)中潛在的蛋白質(zhì)功能模塊。關(guān)鍵靶基因進行GO功能富集分析與KEEG通路富集分析，以揭示這些靶基因的潛在生物學功能和通路。結(jié)果：共篩選出202個有效成分和164個共同靶基因，包括10個核心靶基因。富集分析結(jié)果表明，張氏腰痛方治療LIDD的靶點主要作用于晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、細胞凋亡和低氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路等。這些生物過程主要參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細胞凋亡的調(diào)控。分子對接結(jié)果顯示，張氏腰痛方治療LIDD的主要活性成分divaricatol、槲皮素、O-乙?；鐐惐葋嗆赵?、紫堇靈、黃芪紫檀烷苷與核心靶點TNF、AKT1、白細胞介素-6、TP53、血管內(nèi)皮生長因子A具有良好的結(jié)合能力。結(jié)論：本研究初步證實了張氏腰痛方治療LIDD具有“多成分、多靶點、多通路”的特點，主要從抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡和自噬等方面發(fā)揮對LIDD的治療作用。

【關(guān)鍵詞】 腰椎間盤退變；張氏腰痛方；網(wǎng)絡(luò)藥理學；靶點預測；分子對接

Exploring the Mechanism of Zhang's Waist Pain Formula in Treating Lumbar Intervertebral Disc

Degeneration Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

CHEN Yang-da-hao，LAO Yang-jun，XU Bin，XU Wei-xing，ZHANG Shu-liang，SHENG Hong-feng

【ABSTRACT】Objective：Based on network pharmacology and molecular docking methods，this study aims to explore the molecular biological mechanism of Zhang's Waist Pain Formula in the treatment of lumbar intervertebral disc degeneration（LIDD）.Methods：By searching the database，the active ingredients and targets of Zhang's Waist Pain Formula，as well as the related genes of LIDD，were screened.Software R was used to screen common target genes of Zhang's Waist Pain Formula.A "drug-component-target-disease" network and a protein interaction network with common target genes were constructed，while exploring potential protein functional modules in the network.GO functional enrichment analysis and KEEG pathway enrichment analysis on key target genes were performed to reveal their potential biological functions and pathways.Results：A total of 202 active ingredients and 164 common target genes were screened，including 10 core target genes.The enrichment analysis results indicate that the targets of Zhang's Waist Pain Formula in treating LIDD mainly act on AGE-RAGE signaling pathway，TNF signaling pathway，cell apoptosis，and HIF-1 signaling pathway.These biological processes are mainly involved in the regulation of inflammatory response，oxidative stress，and cell apoptosis.The molecular docking results showed that the main active ingredients of Zhang's Waist Pain Formula for treating LIDD，including divaricatol，quercetin，O-acetylcolumbidin，corynoline，and Isomucronulatol 7-O-glucoside have good binding ability with core targets TNF，AKT1，interleukin-6，TP53，and vascular endothelial growth factor A.Conclusion：This study preliminarily confirms that Zhang's Waist Pain Formula has the characteristics of "multiple components，multiple targets，and multiple pathways" in the treatment of LIDD，mainly playing a therapeutic role in anti-inflammatory，antioxidant stress，inhibition of cell apoptosis，and autophagy.

【Keywords】 lumbar intervertebral disc degeneration;Zhang's Waist Pain Formula;network pharmacology;

target prediction;molecular dockings

腰痛是成年人腰背部疾病最常見的癥狀［1］，腰椎間盤退變（lumbar intervertebral disc degenera-tion，LIDD）是導致腰腿疼痛最常見原因之一［2］。LIDD的發(fā)生機制仍不完全清楚［3］，針對LIDD的治療方法仍有局限性。保守治療效果有限，而手術(shù)治療存在并發(fā)癥的風險［4］。此外，這些治療手段既不能延緩椎間盤的退變進程，也不能對退變椎間盤進行再生修復。因此，亟需新的治療方案，幫助延緩或者預防LIDD的發(fā)生。

中醫(yī)學對LIDD有獨到深刻的認識，多將其歸為“腰腿痛”“痹證”范疇，認為LIDD主要由腎精虧虛、風寒濕邪、外傷勞損引起［5］。張氏骨傷始于清道光年間，是我國中醫(yī)骨傷重要學術(shù)流派之一，并入選國家第三批“非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”保護項目。張氏腰痛方為張氏骨傷治療腰腿痛的常用經(jīng)驗方，具有補肝腎、祛風寒濕、活血化瘀之效，臨床療效顯著［6］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學在中藥方劑研究上應(yīng)用廣泛，其以生物信息學和系統(tǒng)生物學為基礎(chǔ)，研究藥物、靶點、疾病之間的復雜關(guān)系，探索多種藥物的協(xié)同效應(yīng)，符合中藥方劑成分多、靶點多、途徑多的特點［7］。因此，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學原理與方法，本研究探析張氏腰痛方的中藥藥物成分與疾病靶點的對應(yīng)關(guān)系，預測各種可能的調(diào)控機制，為該方治療LIDD的后續(xù)實驗研究提供理論依據(jù)。

1 方 法

1.1 張氏腰痛方活性成分及作用靶點篩選 通過TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）［8］和TCMID（Traditional Chinese Medicine Integrated Database）［9］數(shù)據(jù)分析平臺檢索張氏腰痛方中各個藥物的活性成分。篩選條件為：口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。將預測得分 > 0的靶標作為藥物靶點。

1.2 相關(guān)靶點的篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以“intervertebral disc degeneration”“l(fā)umbar interver-tebral disc degeneration”作為關(guān)鍵詞，在OMIM、Disgenet、Genecards數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲得疾病相關(guān)靶點。應(yīng)用Venny2.1軟件作圖工具平臺將篩選出的關(guān)鍵靶點繪制韋恩圖，取兩者交集后獲得藥物-疾病共同靶點。使用Cystoscap 3.8.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。使用Network Analyzer對網(wǎng)絡(luò)圖進行拓撲分析。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫檢索藥物-疾病共同靶點，設(shè)置條件：蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值 = 0.4。應(yīng)用Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并進行拓撲分析，選取大于平均分的基因作為核心靶點，將前30個靶點繪制成條形圖。

1.4 核心靶點基因功能和通路富集分析 進行關(guān)鍵靶基因GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，設(shè)置條件為P值 < 0.05，Q值 < 0.05，根據(jù)結(jié)果繪制條形圖和氣泡圖。

1.5 分子對接驗證 分析“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖與PPI網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)度值大小篩選核心靶點和核心化合物進行分子對接。采用AutoDock Tools軟件對核心化合物配體和蛋白受體進行處理和對接，計算分子結(jié)合能。

2 結(jié) 果

2.1 張氏腰痛方治療LIDD關(guān)鍵靶點篩選 對張氏腰痛方中18味中藥有效成分進行篩選，去重后，共得到潛在活性成分202個。取預測得分 ﹥0的靶標作為藥物靶點，去重后，篩選出1093個藥物靶點。去重后，共獲得LIDD靶點1204個。在Venny2.1平臺上輸入藥物及疾病靶點，繪制韋恩圖，獲得藥物-疾病共同靶點164個（見圖1），即為張氏腰痛方治療LIDD的潛在靶點。

2.2 中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將張氏腰痛方中202個潛在活性成分與164個藥物-疾病共同靶點繪制成“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因分析 將164個藥物-疾病共同靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫中進行檢索，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，包括164個節(jié)點，2452條邊（見圖3）。通過度值排序，將前30個靶點使用R 3.6.1繪制條形圖（見圖4），前10位包括TNF、AKT1、白細胞介素（IL）-6、TP53、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、STAT3、EGFR、HIF1A、JUN、MAPK3。使用MCODE模塊進行PPI網(wǎng)絡(luò)基因簇分析并篩選核心基因，得到5個基因簇（見圖5）。前兩個基因簇包含前10位核心基因。

2.4 核心靶點基因功能和通路富集分析 將164個共同靶基因經(jīng)R語言運行后行GO分子功能分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析共確定2798個條目，其中生物學過程通路相關(guān)的條目2545個，主要涉及與氧化應(yīng)激相關(guān)的反應(yīng)，如對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對氧氣水平的反應(yīng)、對氧氣水平下降的反應(yīng)，及對缺氧的反應(yīng)；細胞組分相關(guān)的條目82個，主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等方面；分子生物功能相關(guān)的條目171個，主要涉及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、肽鏈內(nèi)切酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、酪氨酸蛋白激酶活性、磷酸酶結(jié)合等方面。并對每個類別前20個條目進行可視化分析，見圖6（1）、6（2）、6（3）。將張氏腰痛方治療LIDD涉及的164個共同靶基因經(jīng)R語言運行后得到160條KEGG通路，其中前20的結(jié)果形成KEGG功能富集的條形圖，見圖7。有意義的通路包括與糖尿病并發(fā)癥有關(guān)的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、細胞凋亡和低氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路等。

2.5 分子對接結(jié)果 選取張氏腰痛方的核心化合物divaricatol（MOL011740）、槲皮素（MOL000098）、O-乙?；鐐惐葋嗆赵∕OL003608）、紫堇靈（MOL004198）、黃芪紫檀烷苷（MOL000380）與核心靶點TNF、AKT1、IL-6、TP53、VEGFA進行分子對接，得到分子結(jié)合能。通常認為結(jié)合能的數(shù)值 ﹤-5.0 kcal·mol-1時，表明兩者之間具有較好的結(jié)合活性，﹤-7.0 kcal·mol-1時，表明兩者具有強烈的結(jié)合活性［10］。本研究結(jié)果顯示，核心化合物與核心靶點的結(jié)合能均﹤-5.0 kcal·mol-1，具有較好的結(jié)合活性。其中O-乙酰基哥倫比亞苷元與TNF、TP53、VEGFA的結(jié)合能分別為-7.02 kcal·mol-1、-7.15 kcal·mol-1、-7.66 kcal·mol-1，紫堇靈與AKT1、VEGFA的結(jié)合能分別為-7.69 kcal·mol-1、-7.77 kcal·mol-1，均 ﹤-7.0 kcal·mol-1，表明O-乙?；鐐惐葋嗆赵妥陷漓`與TNF、TP53、AKT1、VEGFA結(jié)合能力強，在張氏腰痛方治療LIDD中可能發(fā)揮重要作用，具有潛在的研究價值。

3 討 論

LIDD是一個慢性且不可逆的過程，主要病理特征是蛋白多糖和水分的丟失、細胞外基質(zhì)降解增多、神經(jīng)血管向內(nèi)生長和分解代謝細胞因子表達的增加［11-14］。雖然LIDD發(fā)生的病因及機制尚未明確，但已有證據(jù)表明，炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)在其中扮演著關(guān)鍵角色［15-16］。目前，包括非甾體抗炎藥和肌肉松弛劑在內(nèi)的藥物治療在LIDD中應(yīng)用廣泛，對于緩解疼痛具有一定的作用，但無法延緩或者逆轉(zhuǎn)椎間盤退變［17-18］。中醫(yī)藥治療包括“腰腿痛”“痹證”在內(nèi)的各種疾病已有數(shù)千年的歷史。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可以通過減少炎性介質(zhì)和因子的釋放、減輕氧化應(yīng)激和抗凋亡作用等機制延緩LIDD的病程［19］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在張氏腰痛方中起主要治療作用的活性成分包括divaricatol、槲皮素、O-乙?；鐐惐葋嗆赵?、紫堇靈、黃芪紫檀烷苷等。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，防風中色原酮類化合物divaricatol能夠抑制炎癥因子表達并且可以通過提高痛閾值達到一定的鎮(zhèn)痛作用［20］；槲皮素為本方中多味中藥的共同有效成分，可抑制髓核細胞凋亡，防止細胞外基質(zhì)變性，減緩LIDD的進展［21］；獨活中的O-乙酰基哥倫比亞苷元能夠抑制多種炎性因子活性，從而達到抗炎和延緩LIDD的效果［22］；延胡索中的紫堇靈已被證實可以保護細胞免受炎癥的影響，降低細胞中iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的因子水平［23］，并可使NF-κB失活發(fā)揮抗炎作用［24］。因此，推測張氏腰痛方可能通過防風、獨活、延胡索等諸多藥物配伍、協(xié)同發(fā)揮抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用，從而抑制細胞凋亡和自噬，阻止椎間盤的退變。

通過對共同靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)的分析，發(fā)現(xiàn)TNF、AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、STAT3、EGFR、HIF1A、JUN和MAPK3可能是張氏腰痛方治療LIDD的主要靶點。TNF通過誘導退變的椎間盤產(chǎn)生多種促炎細胞因子，進而加重椎間盤的炎癥反應(yīng)，加速細胞凋亡［25-26］；可通過刺激多種基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，降低膠原和聚集素水平，促進髓核退變［27］。STAT3可通過調(diào)節(jié)MMP-2的表達增加細胞外基質(zhì)的降解［28］。IL-6可通過誘導細胞氧化應(yīng)激和干擾鐵穩(wěn)態(tài)，導致軟骨細胞內(nèi)鐵死亡，從而引起細胞程序性死亡，促進椎間盤退變［29-30］。VEGFA可以促進新生血管形成和浸潤性病變，協(xié)同P53基因加速椎間盤的退變［31］。對張氏腰痛方和LIDD共同靶點的分子功能進行GO富集分析的結(jié)果也表明，其核心靶點的分子功能主要涉及氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)方面。張氏腰痛方干預LIDD的主要信號通路是AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、細胞凋亡和HIF-1信號通路等，這些通路參與誘導椎間盤細胞肥大和成骨分化、椎間盤細胞凋亡，從而加速椎間盤的退變［32-33］。

然而，本研究也存在一定的局限性。例如，只通過數(shù)據(jù)庫篩選活性成分和相關(guān)基因可能不夠全面。此外，這項研究的結(jié)果缺乏體外試驗驗證，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上進行進一步的動物實驗或細胞實驗驗證，進而明確張氏腰痛方的主要調(diào)控機制。

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收稿日期：2023-09-25；修回日期：2023-11-08