杜國(guó)華+王宏旭+閆征+劉莉瑩+陳若蕓

[摘要]研究發(fā)現(xiàn)靈芝三萜類化合物具有抗腫瘤活性，但其作用靶點(diǎn)尚不清楚，該試驗(yàn)主要研究靈芝三萜類化合物的抗腫瘤活性并對(duì)其可能的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用Discovery Studio軟件的LibDock模塊，以靈芝子實(shí)體中的26種三萜類化合物作為配體，分別與抗腫瘤作用明確的11個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，獲得對(duì)接的打分結(jié)果，評(píng)判配體與靶點(diǎn)蛋白受體結(jié)合的親和力，從而進(jìn)行靈芝三萜類化合物抗腫瘤的虛擬篩選，探討可能的作用靶點(diǎn)。同時(shí)，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)26種靈芝三萜類化合物對(duì)5種腫瘤細(xì)胞的抑制能力，計(jì)算IC₅₀，以此反映化合物的抗腫瘤活性。對(duì)接結(jié)果表明，對(duì)接位置數(shù)目大于5，且對(duì)接得分高于100，可以作為判斷化合物是否具有活性的閾值，據(jù)此篩選出8種靈芝三萜類化合物可能具有抗腫瘤活性，其中5個(gè)具有多靶點(diǎn)作用的三萜成分。MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，靈芝酸Y對(duì)肺癌細(xì)胞H460顯示了一定的抑制活性，IC₅₀為22.4 μmol·L^-1，其次是7-oxo-ganoderic acid Z2，IC₅₀為43.1 μmol·L^-1。其他三萜類化合物對(duì)被測(cè)腫瘤細(xì)胞株未顯示活性或活性很弱。該研究建立的分子對(duì)接虛擬篩選方法可用于靈芝抗腫瘤活性成分的初步篩選，通過(guò)該方法的篩選，結(jié)合MTT細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)靈芝酸Y具有抗腫瘤，尤其抗肺癌開(kāi)發(fā)的潛在可能性，7-oxo-ganoderic acid Z2和ganoderon B具有一定的抑制活性，其抗腫瘤作用有待于進(jìn)一步深入研究，該研究結(jié)果可為抗腫瘤藥物的研制提供參考。

[關(guān)鍵詞]靈芝子實(shí)體； 三萜類化合物； 抗腫瘤； 分子對(duì)接； 虛擬篩選

[Abstract]It has reported that Ganoderma lucidum triterpenoids had anti-tumor activity. However， the anti-tumor target is still unclear. The present study was designed to investigate the anti-tumor activity of G. lucidum triterpenoids on different tumor cells， and predict their potential targets by virtual screening. In this experiment， molecular docking was used to simulate the interactions of 26 triterpenoids isolated from G. lucidum and 11 target proteins by LibDock module of Discovery Studio2016 software， then the anti-tumor targets of triterpenoids were predicted. In addition， the in vitro anti-tumor effects of triterpenoids were evaluated by MTT assay by determining the inhibition of proliferation in 5 tumor cell lines. The docking results showed that the poses were greater than five， and Libdock Scores higher than 100， which can be used to determine whether compounds were activity. Eight triterpenoids might have anti-tumor activity as a result of good docking， five of which had multiple targets. MTT experiments demonstrated that the ganoderic acid Y had a certain inhibitory activity on lung cancer cell H460， with IC₅₀ of 22.4 μmol·L^-1， followed by 7-oxo-ganoderic acid Z2， with IC₅₀ of 43.1 μmol·L^-1. However， the other triterpenoids had no anti-tumor activity in the detected tumor cell lines. Taking together， molecular docking approach established here can be used for preliminary screening of anti-tumor activity of G.lucidum ingredients. Through this screening method， combined with the MTT assay， we can conclude that ganoderic acid Y had antitumor activity， especially anti-lung cancer， and 7-oxo-ganoderic acid Z2 as well as ganoderon B， to a certain extent， had anti-tumor activity. These findings can provide basis for the development of anti-tumor drugs. However， the anti-tumor mechanisms need to be further studied.

[Key words]fruiting bodies of Ganoderma lucidum； triterpenoids； anti-tumor； molecular docking； virtual screening

靈芝Ganoderma lucidum（Leyss. Ex Fr）Karst.又稱瑞草、靈芝草，是靈芝屬藥食兩用真菌，世界各地均有分布，以熱帶和亞熱帶地區(qū)為多。我國(guó)靈芝藥用已有2 000多年的歷史，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，記載著赤芝、黑芝、紫芝等幾種靈芝的功效。大量藥理研究表明，靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤^[1-2]、抗衰老、提高機(jī)體耐缺氧能力等活性。其中研究較多的靈芝多糖具有抗腫瘤、抗氧自由基、抗衰老、提高免疫力、活血化瘀等多種生物活性。

近年來(lái)從靈芝中分離得到的另一類具有藥理活性的化學(xué)成分是三萜類化合物，是當(dāng)今靈芝研究的一個(gè)熱點(diǎn)^[3-5]。三萜類化合物具有抗腫瘤^[6]、保肝排毒^[7]、抗微生物、鎮(zhèn)靜、抗疲勞、耐缺氧等多種藥理活性，但是確切的抗腫瘤活性作用機(jī)制尚不清楚，常規(guī)篩選和高通量篩選需要樣品制備和比較高的成本，而通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)藥物的作用靶點(diǎn)簡(jiǎn)單而高效，對(duì)確定化合物的靶點(diǎn)具有提示作用。因此，本研究主要針對(duì)中藥藥效弱、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，基于計(jì)算機(jī)虛擬篩選和細(xì)胞活性篩選技術(shù)，從靈芝三萜類化合物中篩選抗腫瘤活性的天然配體和可能的作用靶點(diǎn)，為靈芝抗腫瘤作用靶點(diǎn)研究提供理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料

5種腫瘤細(xì)胞株，即肺癌細(xì)胞株H460、肝癌細(xì)胞株HepG2、胃癌細(xì)胞株BGC823、乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116本實(shí)驗(yàn)室保存，傳代培養(yǎng)。

靈芝三萜類化合物L(fēng)Z1～LZ26，依次為靈芝酸A，B，靈芝烯酸A，B，靈芝酸C6，I，G，LM2，C2，C1，H，靈芝赤芝酸A，靈芝酸ε，M，AM1，J，靈芝烯酸G，赤芝酮B，D，F(xiàn)，靈芝烯酸H，靈芝酸AP3，Y，7-oxo-ganoderic acid Z， 7-oxo-ganoderic acid Z2和ganoderon B（也稱作lucidadiol）。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所植化室課題組從赤芝中以高效液相色譜分離得到^[8]，并鑒定結(jié)構(gòu)，純度≥98%。

RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，培養(yǎng)用胎牛血清（FCS，北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所），MTT，0.25%胰酶購(gòu)自Solabio公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所用溶液均用Milli Q水配制。酶標(biāo)儀（Spectra Max190，美國(guó)MD公司）。

2 方法

2.1 小分子配體的準(zhǔn)備 從Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載本文研究的三萜類化合物結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入軟件Discovery Studio 2016（DS2016）中。對(duì)于網(wǎng)站上不能查到的化合物，應(yīng)用畫圖軟件ChemDraw Ultra 7.0畫出其結(jié)構(gòu)，直接拷貝到DS中。考慮到配體對(duì)映異構(gòu)體等因素，采用DS中的Prepare Ligand處理該體系，通過(guò)此操作不僅可以對(duì)小分子的構(gòu)象進(jìn)行能量?jī)?yōu)化處理，產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)，加氫，還可以產(chǎn)生異構(gòu)體，26種三萜類化合物如此處理后產(chǎn)生81種用于對(duì)接的配體分子。

2.2 蛋白文件的處理 本文所用蛋白見(jiàn)表1，其晶體結(jié)構(gòu)均源自Brookhaven（布魯克海文）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。使用DS2016軟件對(duì)這些蛋白進(jìn)行除去水分子、去除蛋白多構(gòu)象、補(bǔ)充非完整的氨基酸殘基、添加極性氫處理，最后給蛋白施加CHARMm力場(chǎng)得到用于對(duì)接的蛋白。

2.3 分子對(duì)接 以靈芝三萜類化合物為配體，以11個(gè)抗腫瘤作用的靶點(diǎn)為受體，利用DS2016軟件的LibDock模塊進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接的結(jié)果以打分函數(shù)Libdock Score給出。Libdock Score越高，預(yù)測(cè)小分子與受體結(jié)合的活性越高。另外通過(guò)DS2016軟件分析得到配體與受體的氫鍵數(shù)，找到對(duì)配體結(jié)合有重要貢獻(xiàn)的氨基酸殘基。

2.4 細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn) 對(duì)26種三萜類化合物的抗腫瘤活性試驗(yàn)在肺癌細(xì)胞株H460、肝癌細(xì)胞株HepG2、胃癌細(xì)胞株BGC823、乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116共5種細(xì)胞株上進(jìn)行。將腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞懸液按一定濃度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37 ℃ 5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。加 入待測(cè)化合物的工作液，其終濃度為0.1，1，10，100 μmol·L^-1（每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔）。作用72 h后棄去

培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含0.5 g·L^-1MTT的培養(yǎng)基。置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄液，每孔加入DMSO 150 μL，震搖10 min，使藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，以檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm、參考波長(zhǎng)655 nm于酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸收值，計(jì)算IC₅₀。

3 結(jié)果

3.1 三萜化合物與靶點(diǎn)蛋白的對(duì)接 三萜化合物配體和靶點(diǎn)蛋白對(duì)接完成后產(chǎn)生對(duì)接位點(diǎn)數(shù)目（poses）和對(duì)接的得分（Libdock Score）。由對(duì)接結(jié)果可知，26種三萜類化合物與5種靶蛋白Bcl-x1， TNF-α， CDK2， FAK， PD-1均不能對(duì)接上，能與IL-2對(duì)接上的化合物很少且得分很低，只有靈芝酸C2和靈芝赤芝酸A 2種化合物能夠與Cox-2對(duì)接上，且得分比較高，但是對(duì)接位點(diǎn)數(shù)目很少。具體的分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表2。

DS2016軟件的對(duì)接結(jié)果表明，對(duì)接位置數(shù)目大于5，且對(duì)接得分高于100的靈芝三萜類化合物有8種，LZ-1，11，12，17，23～26，對(duì)接效果好的這些三萜類化合物可能具有抗腫瘤活性，其中LZ-12，23～26這5種三萜類化合物可能存在多靶點(diǎn)作用。

尤其以靈芝酸Y（LZ-23）與EGFR的對(duì)接效果最好，因此對(duì)其作進(jìn)一步分析。靈芝酸Y與EGFR的分子對(duì)接效果見(jiàn)圖1。由二維平面圖1B可知，靈芝酸Y側(cè)鏈羧基上的羥基與Asp855殘基存在明顯的氫鍵作用，氫鍵距離為1.83，靈芝酸Y側(cè)鏈羧基上的羰基氧原子也與Asp855，His835 2個(gè)殘基之間具有明顯的相互作用，推測(cè)共軛雙鍵的存在促進(jìn)化合物與周圍氨基酸形成氫鍵和其他相互作用。靈芝酸Y還與殘基Phe723，Phe856分別形成了π鍵-烷基化作用。另外，靈芝酸Y處于Arg841，Phe723，Arg858，Phe856，Leu799等氨基酸殘基的包圍之中，存在多個(gè)烷基化作用，推斷可能是因?yàn)檫@些殘基與配體的相互作用增強(qiáng)了配體與受體的結(jié)合能力，從而使該配體化合物的活性提高。

3.2 細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn) 26種靈芝三萜類化合物對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試的5種腫瘤細(xì)胞株的IC₅₀列于表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，26種化合物單體對(duì)5種被測(cè)腫瘤細(xì)胞株的抑制作用顯著不同。靈芝酸A，靈芝酸Y，7-oxo-ganoderic acid Z，7-oxo-ganoderic acid Z2和ganoderon B表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性，其中靈芝酸A只對(duì)HCT116細(xì)胞株表現(xiàn)出弱活性；靈芝酸Y對(duì) 腫瘤細(xì)胞H460，BGC823，HCT116具有一定的抑制活性，7-oxo-ganoderic acid Z2對(duì)H460有一定的抑制活性（IC₅₀<50 μmol·L^-1）；尤其靈芝酸Y對(duì)肺癌細(xì)胞株H460的細(xì)胞毒活性最強(qiáng)，IC₅₀為22.4 μmol·L^-1。而其他化合物對(duì)所有被測(cè)細(xì)胞株都沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性（IC₅₀>100 μmol·L^-1）。

4 討論

針對(duì)中藥抗腫瘤治療體現(xiàn)出藥效弱、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)，本文對(duì)靈芝三萜成分的抗腫瘤作用進(jìn)行了多靶點(diǎn)的計(jì)算機(jī)虛擬篩選和MTT法體外篩選兩方面的研究。

對(duì)接結(jié)果顯示，ganoderon B和7-oxo-ganoderic acid Z可以與EGFR， VEGFR2， FTase， PPARγ 4個(gè)靶蛋白的多個(gè)位點(diǎn)能夠?qū)由?，且?duì)接位置的數(shù)目大于5，對(duì)接打分高于100，7-oxo-ganoderic acid Z2的對(duì)接情況與之相似，推斷這3種化合物可能會(huì)與這4個(gè)靶點(diǎn)作用，因此，細(xì)胞水平表現(xiàn)出弱活性的試驗(yàn)結(jié)果，文獻(xiàn)[9]研究結(jié)果顯示，7-oxo-ganoderic acid Z對(duì)HepG2的LC₅₀為22.08 μmol·L^-1，這些是相符的。而靈芝酸Y與EGFR靶點(diǎn)對(duì)接良好，對(duì)接位置的數(shù)目多達(dá)19，得分高達(dá)122.02，與PPARγ和FTase 2個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接稍弱些，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果靈芝酸Y卻表現(xiàn)出比較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，推測(cè)靈芝酸Y的作用靶點(diǎn)可能是EGFR， PPARγ或FTase。但是靈芝酸A， H， 靈芝烯酸G與FTase的對(duì)接位置數(shù)目和對(duì)接打分比較高，靈芝赤芝酸A與FTase和PPARγ的對(duì)接也比較好，但是它們幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性，原因可能是測(cè)定細(xì)胞的這種受體表達(dá)不高所致。據(jù)此，可以推斷靈芝酸Y對(duì)H460的作用靶點(diǎn)可能主要是EGFR，而靈芝酸A， H， 靈芝烯酸G的作用靶點(diǎn)可能是FTase，可以通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明確切的作用靶點(diǎn)。

Chen Chun-Ru等^[6]對(duì)從赤芝子實(shí)體中分離到的46個(gè)三萜成分的細(xì)胞毒活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示lucidadiol對(duì)海拉癌細(xì)胞株有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，其IC₅₀為5 μmol·L^-1。而本實(shí)驗(yàn)ganoderon B對(duì)腫瘤細(xì)胞株顯示弱的細(xì)胞毒活性，這可能是因?yàn)椴煌哪[瘤細(xì)胞的敏感度和受體表達(dá)不同導(dǎo)致的。

靈芝赤芝酸A與PPARγ和FTase 2個(gè)靶點(diǎn)的對(duì)接位置數(shù)目大于5，對(duì)接得分高于100，但是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性，對(duì)此，還需要其他的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

而其他三萜化合物對(duì)接結(jié)果顯示結(jié)合弱，體外5種細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果也沒(méi)有顯示活性，2種方法的結(jié)果相吻合。事實(shí)上，文獻(xiàn)[10]研究結(jié)果也表明，三萜化合物靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸I、靈芝酸G、靈芝酸H基本沒(méi)有細(xì)胞毒活性或者活性很弱，其中靈芝酸B對(duì)HepG2的IC₅₀為0.65 g·L^-1，相當(dāng)于1.258 mmol·L^-1，靈芝酸I對(duì)HepG2的IC₅₀為0.26 g·L^-1，相當(dāng)于0.488 mmol·L^-1，結(jié)果是相符的。

從結(jié)構(gòu)上看，化合物靈芝酸Y、7-oxo-ganoderic acid Z和7-oxo-ganoderic acid Z2的側(cè)鏈上含有共軛雙鍵，結(jié)果表現(xiàn)出一定的生物活性，ganoderon B側(cè)鏈上含有一個(gè)不共軛的雙鍵，其活性相對(duì)弱一些，而其他22種三萜化合物不具備這種結(jié)構(gòu)，也幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性，見(jiàn)圖2。因此，推測(cè)靈芝三萜結(jié)構(gòu)中側(cè)鏈上與羧基共軛的雙鍵可能是活性基團(tuán)，對(duì)化合物活性貢獻(xiàn)比較大。

靈芝酸Y活性最好，主要是其結(jié)構(gòu)除了側(cè)鏈含有共軛雙鍵活性基團(tuán)外，母核上還含有一對(duì)共軛烯鍵，使得靈芝酸Y分子與靶點(diǎn)蛋白氨基酸殘基易于形成了π鍵-烷基化作用，見(jiàn)圖1，從而表現(xiàn)出比較好的活性。

綜上，通過(guò)分子對(duì)接可以預(yù)測(cè)化合物的作用靶點(diǎn)，初步篩選活性化合物，利用細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證化合物活性，為靈芝三萜化合物的抗腫瘤研究提供理論依據(jù)。

5 結(jié)論

26種靈芝三萜類化合物在同一種細(xì)胞株上表現(xiàn)出顯著不同的抑制作用，這與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)，側(cè)鏈上的雙鍵，尤其是共軛雙鍵是活性基團(tuán)，能夠使得側(cè)鏈羧基容易與氨基酸殘基形成氫鍵，從而表現(xiàn)出比較強(qiáng)的活性。

通過(guò)計(jì)算機(jī)虛擬篩選和體外細(xì)胞毒活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)靈芝酸Y對(duì)肺癌細(xì)胞H460表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，是本研究初步篩選出的比較有潛力的抗腫瘤化合物。但是三萜成分抗腫瘤機(jī)制復(fù)雜，有待于進(jìn)一步深入研究。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]