鄭春松+嚴(yán)培晶+付長龍+葉蕻芝+吳廣文+李西海+劉獻(xiàn)祥

【摘 要】目的：探索獨(dú)活寄生湯治痿和治痹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：構(gòu)建獨(dú)活寄生湯化學(xué)成分分子數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用分子對接技術(shù)，探討其與軟骨退變靶點基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）、炎癥靶點環(huán)氧化酶-2（COX-2）受體的相互作用。結(jié)果：獨(dú)活寄生湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)含有25個化合物，主要為苷類、黃酮類化合物，其中，16個化合物能與MMP-13有較好的作用，14個化合物能與COX-2有較好的作用，5個化合物對MMP-13和COX-2均有作用效應(yīng)。結(jié)論：獨(dú)活寄生湯可通過MMP-13和COX-2的有效成分群分別起到治痿、治痹或痿痹同治的作用，為其在骨關(guān)節(jié)炎中的臨床運(yùn)用提供新依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；獨(dú)活寄生湯；治痿；治痹；藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；分子對接

Molecular Docking Research on Pharmacodynamic Material Basis of Duhuo Jisheng Tang（獨(dú)活寄生湯）Treating Flaccidity and Bi

ZHENG Chun-song，YAN Pei-jing，F(xiàn)U Chang-long，YE Hong-zhi，WU Guang-wen，LI Xi-hai，LIU Xian-xiang

【ABSTRACT】Objective：To explore the pharmacodynamic material basis of Duhuo Jisheng Tang（獨(dú)活

寄生湯）treating flaccidity and Bi.Methods：A molecular database of the chemical constituents of Duhuo Jisheng

Tang was established.Molecular docking technology was used to explore its interaction with MMP-13 and COX-2.Results：The material basis for the efficacy of Duhuo Jisheng Tang contained 25 compounds，mainly including glycosides and flavonoids，among which 16 compounds could have a better interaction with MMP-13，

14 compounds could have a better interaction with COX-2，and 5 compounds had interactions with MMP-13 and COX-2.Conclusion：Duhuo Jisheng Tang treats flaccidity and bi by effective components of MMP-13 and COX-2，

which can provide a new basis for its clinical use in osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis；Duhuo Jisheng Tang（獨(dú)活寄生湯）；treating flaccidity；treating bi；pharmacodynamic

material basis；molecular docking

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”“膝痹”范疇，中醫(yī)藥及其相關(guān)治療方法已經(jīng)成為國內(nèi)治療OA的主要手段[1]。筆者前期課題組基于陳可冀學(xué)術(shù)思想之骨關(guān)節(jié)炎研究，提出了本痿標(biāo)痹為OA的核心病機(jī)，開展了基于本痿標(biāo)痹核心病機(jī)的OA系列研究，形成了從本治痿、從標(biāo)治痹的OA治療理念，該成果獲2015年福建省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎一等獎[2]。但是，具體的治痿、治痹藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究甚少。

獨(dú)活寄生湯出自唐代醫(yī)家孫思邈的《備急千金要方》，由獨(dú)活、桑寄生、牛膝和細(xì)辛等組成，既能祛風(fēng)濕、止痹痛，又能益肝腎和補(bǔ)氣血[3]，臨床上可用于治療OA的痹證和痿證[4]，已被實驗證實其具有抗炎鎮(zhèn)痛和延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的作

用[5-6]。為此，筆者以獨(dú)活寄生湯為研究對象，借助計算機(jī)模擬之分子對接方法[7-9]，尋找獨(dú)活寄生湯中治痹和治痿療效發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)，從分子層面為OA“本痿標(biāo)痹”核心病機(jī)的中藥治療提供理論支持，也為名方的二次開發(fā)和OA的精準(zhǔn)治療提供新依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 實驗材料 獨(dú)活寄生湯分子集；OA治痹、治痿靶標(biāo)。

1.2 實驗設(shè)備 使用北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院計算機(jī)模擬實驗室的Discovery Studio（DS）軟件進(jìn)行計算，該軟件的運(yùn)行環(huán)境：DS 2.0圖形工作站和Microsoft Windows XP Professional，SP 2操作系統(tǒng)。計算模擬過程中所用的參數(shù)除非特別指明，否則，均為缺省值。

2 方 法

2.1 獨(dú)活寄生湯分子數(shù)據(jù)庫的建立 從北京大學(xué)中草藥有效成分三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫、中藥原植物化學(xué)成分手冊和文獻(xiàn)[10-12]，檢索獨(dú)活寄生湯組成藥物（獨(dú)活、桑寄生、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂、防風(fēng)、川芎、當(dāng)歸、地黃、杜仲、人參、白芍和甘草）的化學(xué)成分（包括代謝成分），經(jīng)過排重，共計566個中藥化學(xué)成分。利用美國MDL信息系統(tǒng)公司的ISIS/DRAW 2.5軟件繪制其二維結(jié)構(gòu)，輸出為mol格式文件。在DS 2.0上加氫，轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Ligand Minimination模塊對化學(xué)成分三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行默克公司開發(fā)的分子力場（MMFF）優(yōu)化，保存為sd文件（DHJSD-bank.sd），建立獨(dú)活寄生湯分子數(shù)據(jù)庫。

2.2 治痹、治痿靶標(biāo)的選擇 根據(jù)OA的發(fā)病機(jī)制[13-16]、治療靶數(shù)據(jù)庫（TTD）[17]、軟骨退變臨床表現(xiàn)為痿、骨質(zhì)增生臨床表現(xiàn)為痹[2]，確定與抗炎鎮(zhèn)痛密切相關(guān)的治痹靶標(biāo)環(huán)氧化酶-2（COX-2），以及與延緩軟骨退變密切相關(guān)的治痿靶標(biāo)基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）。在RCSB Protein Data Bank上[18]，下載COX-2和MMP-13

的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，其代碼分別為3MQE和3I7I，見圖1。

2.3 分子對接 獨(dú)活寄生湯分子集配體與OA靶標(biāo)的對接工作在DS 2.0中的LigandFit模塊進(jìn)

行[19-20]。對接中，蛋白結(jié)構(gòu)去溶劑、去配體、加氫處理后，以其所含的活性原配體來確定活性位

點；在“Input Ligands”中輸入DHJSD-bank.sd文件。使用蒙特卡羅方法對獨(dú)活寄生湯化學(xué)成分配體進(jìn)行構(gòu)象采樣、Dreiding力場下進(jìn)行打分，保留得分最高的構(gòu)象。對對接成功配體化合物的DOCK-SCORE進(jìn)行排序[9]，尋找比原配體DOCK-SCORE高的化合物，視為獨(dú)活寄生湯的藥效成

分[21-22]，從而得到獨(dú)活寄生湯中治痹和治痿藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 結(jié) 果

3.1 基于MMP-13和COX-2的分子對接 在DS的Ligandfit模塊中，遵循能量互補(bǔ)、幾何互補(bǔ)以及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)等原則，得到各自最佳的DOCK-SCORE。以已知的配體抑制劑DOCK-SCORE為閾值，發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯潛在的活性成分25個，其中，與MMP-13結(jié)合較好的化合物16個，分別為異洋丁香酚苷、新異甘草苷、甘草寧E、朝鮮連翹苷、烏拉爾寧、異芒果花苷、異甘草苷、葉酸、烏拉爾醇-3-甲基醚、烏拉爾醇、綠原酸甲酯、西北甘草異黃酮、綠原酸、烏拉爾甘草皂苷B、烏拉爾甘草皂苷A和4'-O-甲基光甘草定；與COX-2結(jié)合較好的化合物14個，分別為新西蘭牡荊苷Ⅱ、烏拉爾寧、異槲皮苷、烏拉爾醇-3-甲基醚、烏拉爾醇、異甘草黃酮醇、京尼平苷酸、甘草香豆精、烏拉爾甘草皂苷A、烏拉爾甘草皂苷B、芍藥苷、芍藥吉酮、烏拉爾甘草皂苷A甲基正丁酯和3'-甲氧基光甘草定。

3.2 獨(dú)活寄生湯化學(xué)成分治痿和治痹的綜合評價 以比原配體DOCK-SCORE高的化合物視為獨(dú)活寄生湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。以MMP-13為靶點的治痿藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與以COX-2為靶點的治痹藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要由苷類、黃酮類成分組成。其中，有5個化合物能同時作用MMP-13和COX-2，但有11個化合物僅能跟MMP-13存在作用效應(yīng)，有9個化合物僅能跟COX-2存在作用效應(yīng)。說明獨(dú)活寄生湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)在一定程度上顯示出治痿和治痹既有各自獨(dú)立的藥效成分，又有共同的藥效成分。獨(dú)活寄生湯化學(xué)成分治痿和治痹的綜合評價見表1。

4 討 論

目前，國內(nèi)科研人員常采用活性追蹤分離法從中藥中篩選活性化合物；但往往分離到的物質(zhì)越

純，其藥效活性越弱，難以追蹤到藥效物質(zhì)，相應(yīng)的作用靶點也難以闡明[23]。近年來，隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計算化學(xué)及分子模擬等學(xué)科的發(fā)展，開展計算機(jī)輔助藥物設(shè)計（CADD），已經(jīng)成為一種國際上熱點的研究領(lǐng)域。其方法已被國內(nèi)外許多制藥公司、研究機(jī)構(gòu)用于新藥、中藥的研究與開發(fā)，并取得了極大的成功[24-25]。其中，CADD中的分子對接，是中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的高效快速虛擬篩選最常見的技術(shù)之一[26-27]。因此，本文將分子對接方法用于獨(dú)活寄生湯復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。

OA是以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的一種慢性關(guān)節(jié)病，是導(dǎo)致中老年人疼痛和殘疾的最常見原因[28]。其治療目的是緩解關(guān)節(jié)疼痛，改善功能并重建受損的軟骨及骨的結(jié)構(gòu)。其中，緩解關(guān)節(jié)疼痛常用COX-2抑制劑，其作用機(jī)制是通過抑制COX-2的活性，阻斷花生四烯酸和緩激肽等致痛物質(zhì)的代謝，防止血管性前列腺素的合成達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的作用[29]。另外，已有研究表明，OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解超過其合成，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)凈含量的降低，進(jìn)而造成關(guān)節(jié)軟骨的部分甚至完全損耗，是關(guān)節(jié)軟骨破壞的主要病理表現(xiàn)[30]。而MMP-13可使Ⅱ型膠原變性裂解，對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)具有降解作用，引起關(guān)節(jié)軟骨腫脹，抗外力作用下降，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞[31]。因此，COX-2和MMP-13已成為緩解疼痛和延緩軟骨退變的重要靶點。

筆者課題組認(rèn)為，OA以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)樵l(fā)、骨質(zhì)增生為繼發(fā)的病理特點，關(guān)節(jié)軟骨退變臨床表現(xiàn)為痿，骨質(zhì)增生臨床表現(xiàn)為痹，本痿標(biāo)痹為OA的核心病機(jī)[2]。治療上應(yīng)本著整體觀念和病證結(jié)合的原則，客觀地辨證分析。從本治痿，從標(biāo)治痹，急則治痹痛，緩則治痿證，久則痿痹同治。這里的治痹、治痿與緩解疼痛、延緩軟骨退變相互對應(yīng)起來。而且，從中醫(yī)角度看，OA的“本痿標(biāo)痹”是以肝腎虧虛為本，以風(fēng)寒濕為標(biāo)[32]。說明祛風(fēng)濕、益肝腎作為治療OA的根本法則，且具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎和補(bǔ)氣血功效的獨(dú)活寄生湯可起到治痿和治痹的作用。王愛武等[33]進(jìn)行了獨(dú)活寄生湯抗炎、鎮(zhèn)痛的藥效學(xué)研究，進(jìn)一步證實了其治痹作用。原巧寧等[34]進(jìn)行獨(dú)活寄生湯治療大鼠膝OA軟骨病理學(xué)分析，證實了其能延緩關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變，即具有治痿作用。因此，筆者分別以MMP-13和COX-2為治痿、治痹靶點，以獨(dú)活寄生湯為研究對象，借助分子對接平臺，開展其治痿和治痹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活寄生湯中黃酮類（烏拉爾寧、甘草寧E等）、苷類（新異甘草苷、異甘草苷等）、有機(jī)酸類（葉酸和綠原酸）等化合物可能通過抑制MMP-13活性達(dá)到延緩軟骨退變治痿的目的；黃酮類（異槲皮苷、異甘草黃酮醇等）、苷類（新異甘草苷、異甘草苷等）、有機(jī)酸類（京尼平苷酸）等化合物可能通過抑制COX-2活性達(dá)到抗炎治痹的目的。文獻(xiàn)已報道，葉酸可以降低MMPs的活性，綠原酸對高強(qiáng)度跳躍運(yùn)動引發(fā)的膝關(guān)節(jié)軟骨損傷具有一定的保護(hù)作用，異槲皮苷和京尼平苷酸具有抗炎的作用等[35-38]。提示獨(dú)活寄生湯治痿和治痹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)均是有效成分群。由于中藥具有多靶點的作用特點[21]，本研究也發(fā)現(xiàn)烏拉爾寧、烏拉爾醇-3-甲基醚、烏拉爾醇、烏拉爾甘草皂苷A和烏拉爾甘草皂苷B既能作用于COX-2，又能作用于MMP-13。這些潛在的“混雜藥物”顯示出獨(dú)活寄生湯痿、痹同治的特點。上述為獨(dú)活寄生湯治療OA提供了依據(jù)。

總之，分子對接的方法用于獨(dú)活寄生湯治痿和治痹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是一個有益的嘗試。如何在這方面進(jìn)行更廣、更深的研究，如構(gòu)建治痿和治痹的中藥治療網(wǎng)絡(luò)等，是未來值得我們思索的問題。相信CADD之分子對接有助于推動OA的中藥現(xiàn)代化進(jìn)程。

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收稿日期：2016-09-12；修回日期：2016-11-16