魏志成　童東　楊娟　趙可惠　孟憲麗　張藝

[摘要] 該研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)虛擬篩選方法，旨在進(jìn)一步研究沙棘總黃酮（total flavonoids of Hippophae rhamnoides，TFH）治療心肌缺血的活性成分和作用機(jī)制。首先通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫，結(jié)合口服利用度和類藥性分析，篩選出沙棘化合物中的黃酮類化合物。篩選得到的7個化合物再通過ChemMapper服務(wù)器進(jìn)行靶點的預(yù)測分析。將得到的潛在靶點導(dǎo)入MAS 3.0數(shù)據(jù)庫，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點分析和通路分析。最后使用Cystoscope 3.3.0軟件繪制“化合物靶點作用通路”網(wǎng)絡(luò)圖。虛擬實驗預(yù)測得到了68個潛在靶點和60條信號通路，其中有31個靶點和23條通路直接或間接與心肌缺血有關(guān)。結(jié)果表明，TFH主要通過對鈣離子信號通路（calcium signaling pathway）、血管內(nèi)皮生長因子信號通路（VEGF signaling pathway）和縫隙連接信號通路（gap junction）等信號通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮協(xié)同作用，且與文獻(xiàn)報道吻合；提示其可能通過參與調(diào)節(jié)血小板聚集、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)等過程，增強(qiáng)心功能和對血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，從而發(fā)揮抗心肌缺血的作用。

[關(guān)鍵詞] 沙棘； 沙棘總黃酮； 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)； 心肌缺血； 機(jī)制研究

Action mechanism of total flavonoids of Hippophae rhamnoides in

treatment of myocardial ischemia based on network pharmacology

WEI Zhicheng， TONG Dong， YANG Juan， ZHAO Kehui， MENG Xianli， ZHANG Yi*

（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] In this study， a network pharmacological screening method was adopted to further study the active ingredients and action mechanism of total flavonoids of Hippophae rhamnoides（TFH） for the treatment of myocardial ischemia. Firstly TCMSP database and PubChem database were searched， and then the data were combined with oral bioavailability and drug analysis to screen flavonoids of H.rhamnoides compounds. Then predictive analysis was conducted for the 7 screened compounds by ChemMapper server.The obtained potential targets were imported into MAS 3.0. Database， and KEGG database was also used for targets analysis and pathway analysis. Finally Cystoscope 3.3.0 software was used to draw "compoundstargetspathway" network diagram. Virtual experiments predicted 68 potential targets and 60 signaling pathways， and 31 targets and 23 pathways of them were directly or indirectly associated with myocardial ischemia. The results showed that TFH played a synergistic rolemainly through the regulation of calcium signaling pathway， VEGF signaling pathway and gap junction signaling pathway， which was consistent with literature reports. These results indicated that it can enhance heart function， protect vascular endothelial cells， and fight against myocardial ischemia probably by regulating platelet aggregation， lipid metabolism， inflammation and other processes.

[Key words] Hippophae rhamnoides； TFH； network pharmacology； myocardial ischemia； mechanism

心肌缺血（myocardial ischemia），是指心臟的血液灌注減少，導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能維持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)[1]。冠狀動脈阻塞、主動脈供血減少和血壓降低，可直接導(dǎo)致心臟供血減少；心瓣膜病、血黏度變化和心肌本身病變同樣也會使心臟供血減少。其中冠狀動脈阻塞是造成心肌缺血的最主要也是最常見的原因，而使冠狀動脈阻塞的主要病因為冠狀動脈粥樣硬化。隨著人民生活水平的提高，不合理的飲食習(xí)慣和生活規(guī)律使得心肌缺血在我國的患病率呈逐年上升的趨勢，已成為中老年人的常見病和多發(fā)病之一，且逐年呈現(xiàn)年輕化的趨勢。

沙棘Hippophae rhamnoides為胡頹子科酸棘屬植物，是藏族習(xí)用藥材，其果實可以除肺腫瘤，化血，治培根病[2]。據(jù)2015年版《中國藥典》記載，沙棘有健脾消食，止咳祛痰，活血散瘀之功效[3]，其主要活性成分為黃酮類化合物，國內(nèi)外研究表明其具有抗血栓和體外抗血小板聚集活性[4]，能改善血液流變學(xué)[5]，改善心臟功能及血流動力學(xué)[67]等影響血液系統(tǒng)的藥理作用。以TFH為主要成分的已上市藥物心達(dá)康膠囊在臨床應(yīng)用中也表明具有良好的抗心肌缺血和改善血流動力學(xué)作用[89]。雖然目前對TFH的藥理研究已有較多報道，但針對其多成分、多靶點及多途徑治療心肌缺血的作用機(jī)制研究仍不夠系統(tǒng)和全面。該文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對沙棘黃酮類成分抗心肌缺血作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，希望能為后續(xù)實驗提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）；PubChem（有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫，http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）；ChemBioOffice2010；ChemMapper數(shù)據(jù)庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/index.html）；MAS 3.0（生物分子功能注釋系統(tǒng)，http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/）；KEGG數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp/kegg/）；Cystoscope 3.3.0。

1.2 沙棘化學(xué)成分分子庫的準(zhǔn)備 通過文獻(xiàn)考察和TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）查詢共獲得了沙棘223個化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu)。將上述223個化合物代入軟件分析，通過口服利用度和類藥性這2個決定藥物分子是否具有較好的口服生物利用度以及成藥性優(yōu)劣的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行篩選[1011]。設(shè)定口服利用度（OB）≥30%，和類藥性（DL）≥0.18 2個條件，得到同時符合條件個化合物有33個。這些化合物再通過PubChem（有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫，http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)辨別，篩選出2個苯環(huán)（A環(huán)與B環(huán)）通過中央三碳相互聯(lián)接而成的這類化合物（黃酮類化合物），滿足黃酮類結(jié)構(gòu)共7個化合物分別是槲皮素（quercetin，PubChem CID：5280343）、異鼠李素（isorhamnetin，PubChem CID：5281654）、山柰素（kaempferol，PubChem CID：5280863）、花葵素（pelargonidin，PubChem CID：5281605）、表兒茶素（epicatechin，PubChem CID：72322）、兒茶素（cianidanol，PubChem CID：2353）、AC1LDVZ[（2R）5，7dihydroxy2（3hydroxy4methoxyphenyl）2，3dihydrochromen4one，PubChem CID：3593]，化合物具體信息見表1。

1.3 沙棘黃酮類化合物潛在靶點預(yù)測與篩選 用ChemBioOffice2010繪制 7個沙棘黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，將其存為MOL2格式，并導(dǎo)入 ChemMapper服務(wù)器進(jìn)行潛在靶點的預(yù)測分析，參數(shù)設(shè)置如下，Options for ChemMapper：Target Navigator；3D similarity method：SHAFTS；Similarity Threshold：1.2；Bioactivity Database： DrugBank。ChemMapper[12]是基于分子相似性方法的靶效藥理學(xué)及化學(xué)關(guān)系發(fā)現(xiàn)的多功能平臺，本文通過ChemMapper整合Drugbank數(shù)據(jù)庫已知的包含生物活性及靶點注釋信息的藥物分子，然后應(yīng)用三維分子相似性方法SHAFTS[13]來計算查詢分子與藥物分子的相似度，從而預(yù)測查詢分子的潛在靶點?；趯π募∪毖l(fā)病機(jī)制的總結(jié)，進(jìn)一步通過KEGG數(shù)據(jù)庫靶點功能分析比對心肌缺血病理過程所對應(yīng)靶點，篩選出相應(yīng)的靶點進(jìn)行下一步分析。

1.4 GO富集分析與通路注釋 將預(yù)測獲取的靶點蛋白信息導(dǎo)入MAS 3.0數(shù)據(jù)庫，即可得到靶點的相關(guān)通路信息。參數(shù)設(shè)置如下，Species： Homo sapiens （Human）；Molecule Type： Protein；Database Symbols： Gen Bank ACC；Functions： Gene，mRNA，Protein，Pathway；Regulation Threshold： Up 2.0，Down 0.5。另外，KEGG包含的通路數(shù)據(jù)庫儲存了基因功能的相關(guān)信息，通過圖形來表示細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過程。利用此數(shù)據(jù)庫可以對由MAS 3.0得到的通路進(jìn)行注釋及GO富集分析，以及結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路分析。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cystoscope 3.3.0建立“化合物靶點通路”網(wǎng)絡(luò)模式，繪制沙棘黃酮類化合物分子與靶蛋白作用網(wǎng)絡(luò)圖。以選取的7個沙棘黃酮成分、預(yù)測出的靶點和通路及通路注釋為節(jié)點（node），建立相互關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.3.0軟件，運用network analyzer插件分析藏藥沙棘黃酮類成分治療心肌缺血的“化合物靶點通路”網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)中，以節(jié)點（node）表示活性成分、靶點和通路。以邊（edge）相連接表示某一靶點為某化合物的潛在作用靶點和某一靶點與某一通路相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 靶點預(yù)測與篩選 通過ChemMapper數(shù)據(jù)庫對TFH 7個黃酮類成分的分析，共預(yù)測得到了68個潛在靶點，經(jīng)靶點功能分析后確認(rèn)其中有31個靶點直接或間接與心肌缺血有關(guān)，相關(guān)靶點信息見表2。各化合物所對應(yīng)的作用靶點數(shù)不盡相同，其中槲皮素14個、異鼠李素4個、山柰素14個、花葵素15個、表兒茶素24個、兒茶素10個，單從作用層次上，提示表兒茶素在網(wǎng)絡(luò)中貢獻(xiàn)最大。在預(yù)測的靶點中，PTGS1（前列腺素G/H合酶1）、PTGS2（環(huán)氧合酶2）是花生四烯酸代謝通路中重要節(jié)點；ADRB1（β1腎上腺素能受體），ADRB2（β2腎上腺素能受體），ADRB3（β3腎上腺素能受體），DRD1（多巴胺D1b受體），DRD5（多巴胺D1a受體）等與鈣離子通道有關(guān)；MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1），MAPK14（絲裂原活化蛋白激酶14），PIK3CG（磷脂酰肌醇激酶CG），PIK3R1（磷脂酰肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞基1），PIK3R2（磷脂酰肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞基2），CDK2（細(xì)胞分裂蛋白激酶2）等與細(xì)胞生存和凋亡有關(guān)；PIK3CG，PTGS1，PTGS2，MAPK1，IFNG（干擾素γ）等與炎癥反應(yīng)有關(guān)；PIK3CG，PIK3R1，PIK3R2等與脂質(zhì)代謝有關(guān)。由此推斷，TFH治療心肌缺血可能通過參與調(diào)節(jié)血小板聚集、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)等過程，增強(qiáng)心功能和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用有關(guān)。

2.2 GO富集分析及通路分析 通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，見圖1～3，預(yù)測靶點在生物過程中，蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號通路和信號傳導(dǎo)排位靠前；在分子功能中，ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性和核苷酸結(jié)合相關(guān)性最大；在細(xì)胞組分中，質(zhì)膜和細(xì)胞核所占比例最大。通過KEGG通路分析共得到60條信號通路，23條直接或間接與心肌缺血有關(guān)，見表3。其中有2條與血小板聚集有關(guān)，分別是Fc epsilon RI和arachidonic acid metabolism信號通路；有3條與脂質(zhì)代謝相關(guān)，分別是Fc epsilon RI，mTOR和Insulin信號通路；有8條與炎癥相關(guān)，分別是Tolllike receptor，MAPK，JakSTAT，Arachidonic acid metabolism，Leukocyte transendothelial migration，TGFbeta，Proteasome和Focal adhesion信號通路；有6條與細(xì)胞凋亡相關(guān)，分別是VEGF，Apoptosis，Cell cycle，p53，Gap junction和ErbB信號通路；有3條與心臟功能和血管舒張有關(guān)，分別是Ca2+，F(xiàn)c epsilon RI和Phosphatidylinositol signaling system信號通路；有3條與血管韌性和通透性有關(guān)，分別是Leukocyte transendothelial migration，Adherens junction和Tight junction信號通路。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.3.0軟件建立了TFH的“化合物靶點通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。直觀地呈現(xiàn)了6個化合物（其中化合物AC1LDVZP無對應(yīng)靶點）、31個靶蛋白、23條作用通路與心肌缺血疾病之間的關(guān)系。分析結(jié)果表明， Calcium signaling pathway，VEGF signaling pathway和Gap junction 3條信號通路在網(wǎng)絡(luò)中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度排位靠前（作用于通路的靶點數(shù)均≥8），為網(wǎng)絡(luò)中的樞紐節(jié)點，提示它們可能是TFH抗心肌缺血核心作用途徑；化合物與靶點間存在著“一對多、多對一”的關(guān)系，體現(xiàn)了TFH其多成分、多靶點的抗心肌缺血作用機(jī)制；沙棘黃酮類成分在血小板聚集、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和心血管功能等相關(guān)通路上具有協(xié)同作用。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在基于高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計算機(jī)虛擬計算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索構(gòu)建 “藥物基因靶點疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步利用網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀來分析藥物與機(jī)體相互作用的一門學(xué)科[14]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展打破了“一個藥物、一個靶標(biāo)、一種疾病”的傳統(tǒng)理念，將高選擇性單一靶點的新藥研究模式轉(zhuǎn)化為針對機(jī)體網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的組合模式[15]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一研究策略為中藥和民族藥藥理學(xué)研究提供了嶄新的思路與方法，為中藥和民族藥多靶點、多途徑效應(yīng)提供了可量化數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了對單味藥多成分或者復(fù)方的作用機(jī)制研究的整體化、系統(tǒng)化[16]。

心肌缺血主要由于血液所含物質(zhì)的變化和血管腔內(nèi)產(chǎn)生病理改變的結(jié)果[1]。大多起因于膳食不合理、運動過少等生活因素導(dǎo)致的高脂血癥、高膽固醇血癥。久而久之導(dǎo)致動脈血管形成粥樣斑塊，而冠狀動脈粥樣硬化直接造成冠狀動脈血管通道變得狹窄，甚至阻塞，這也是心肌缺血最主要和常見的原因之一[17]。藏醫(yī)理論認(rèn)為，心是臟腑之君，《四部醫(yī)典》[18]對心臟病的病因描述為“愁悲煩亂心不安，腹肌失眠瞋粗暴生”。心肌缺血的癥狀屬于藏醫(yī)“心悸”“心刺痛”“心熱癥”等病的范疇[19]，而冠狀動脈粥樣硬化所導(dǎo)致的心肌缺血，藏醫(yī)認(rèn)為，一些病因一方面會使隆行太過發(fā)生偏盛的病變，或隆亂血塞；另一方面作用于血使赤巴受害而打破三因平衡[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)大量預(yù)測靶點與血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)和心肌細(xì)胞保護(hù)有關(guān)，且各個靶點、通路相互協(xié)同作發(fā)揮作用，提示這可能是TFH抗心肌缺血的關(guān)鍵。心肌缺血/再灌注損傷引起炎癥反應(yīng)，大量炎癥介質(zhì)的表達(dá)，造成心肌細(xì)胞的進(jìn)一步凋亡，從而加劇心肌缺血/再灌注損傷[21]。另一方面，血小板聚集、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)會進(jìn)一步損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血栓形成和加劇炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加速冠狀動脈硬化和心肌缺血病理過程。花生四烯酸代謝信號通路在整個抗心肌缺血過程扮演著重要的角色，其代謝產(chǎn)物參與膽固醇代謝、內(nèi)皮細(xì)胞單核細(xì)胞黏附、血小板聚集，調(diào)節(jié)血液黏度和血細(xì)胞功能等過程[22]；而且Src酪氨酸激酶的激活能增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平和激活磷脂A2（PLA2），進(jìn)而激活花生四烯酸在質(zhì)膜磷脂中的合成[4]。TFH對活性氧自由基（ROS）的清除作用[23]能減少心肌缺血造成的損傷。心肌缺血會導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，再灌注也會進(jìn)一步促使心肌細(xì)胞產(chǎn)生ROS[24]，加劇心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。而TFH可能通過MAPK14，PIK3CG，PTK2B，PIK3R1和PIK3R2等靶點調(diào)控白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號通路（Leukocyte transendothelial migration），抑制NADPH氧化酶表達(dá)，進(jìn)而減少ROS的分泌，保護(hù)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷。

本文通過預(yù)測得到的Calcium signaling pathway，VEGF signaling pathway和Gap junction 3個通路為網(wǎng)絡(luò)中樞紐節(jié)點，與已有文獻(xiàn)報道吻合，證實了預(yù)測實驗的準(zhǔn)確性。TFH對鈣離子轉(zhuǎn)運的影響，能增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮力[25]和減少鈣離子超載[26]造成的細(xì)胞損傷。TFH通過多個腎上腺素能受體和多巴胺受體對鈣離子信號通路進(jìn)行調(diào)控，提示這可能是總黃酮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制之一。心肌和血管在缺血性缺氧環(huán)境下，機(jī)體會上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子（HIF1α）的表達(dá)，誘導(dǎo)體內(nèi)一些血管活性物質(zhì)，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和內(nèi)皮素1（endothelin1，ET1）的表達(dá)[27]。VEGF在正常血管中無表達(dá)，但在動脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)顯著增加，這也是斑塊形成的重要特征之一。而沙棘提取物能顯著減少由缺氧誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子和VEGF水平的增加[28]，提示TFH能通過調(diào)節(jié)VEGF信號通路上游靶點（SRC，PIK3CG，PTGS2，MAPK14等）改善機(jī)體缺血缺氧狀態(tài)，從而下調(diào)VEGF的表達(dá)。縫隙連接和心律失常及細(xì)胞損傷等有著密切的關(guān)系，在心肌缺血早期給予阻斷縫隙連接細(xì)胞間通訊，發(fā)現(xiàn)可以明顯降低隨后發(fā)生的心肌壞死范圍[29]。已有文獻(xiàn)報道表明，槲皮素能顯著抑制縫隙連接細(xì)胞間通訊，從而達(dá)到心肌保護(hù)的作用[3031]。

TFH其主要有效成分為槲皮素、異鼠李素、山柰素等。目前TFH運用于人體主要是通過口服吸收，故在分子庫的準(zhǔn)備階段對沙棘所含化合物進(jìn)行了口服生物利用度和類藥性篩選，然后共得到7個滿足條件的化合物，這些化合物良好的口服生物利用度和類藥性決定了它們具有很好的成藥性，從藥物代謝角度上看可以很好代表了TFH的藥效。最后以上述7個化合物為研究對象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段分析了上述成分可能的作用靶點及信號通路，初步揭示了其多成分、多靶點、多途徑的協(xié)同效應(yīng)的作用特點。本文為下一步深入研究TFH抗心肌缺血藥效基礎(chǔ)研究及機(jī)制研究提供了一定的理論依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]