黃書(shū)奇，閻晗，胡德慶

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，天津 300070）

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）是一類具有無(wú)限增殖能力、多能性以及自我更新能力的細(xì)胞，可以分化成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞[1]。在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，胚胎基因組在受精卵形成后的2細(xì)胞時(shí)期開(kāi)始激活。在8細(xì)胞時(shí)期，胚胎經(jīng)歷緊束化形成桑椹胚，此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)極性，在胚內(nèi)的一側(cè)形成一個(gè)充滿液體的腔，即囊胚腔，在囊胚腔的一側(cè)存在一個(gè)小的細(xì)胞團(tuán)，即內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM），ICM具有分化為成熟個(gè)體中全部細(xì)胞類型的潛能。隨著胚胎的繼續(xù)發(fā)育，ICM將快速增殖并進(jìn)一步分化，逐步形成3個(gè)胚層以及相應(yīng)的組織和器官[2-5]。哺乳動(dòng)物胚胎植入子宮后，在BMP信號(hào)通路以及Wnt信號(hào)通路的共同作用下，近端外胚層細(xì)胞分化產(chǎn)生原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGCs）[6-9]，鼠PGCs（mPGCs）呈堿性磷酸酶染色陽(yáng)性，最早發(fā)現(xiàn)于原條后端，存在于胚胎發(fā)育的第6.25天（E6.25）。

基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Prdm1（PR/SET Domain 1）的蛋白序列中包含一個(gè)N端PR/SET結(jié)構(gòu)域和5個(gè)近C端的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域（鼠源Prdm1蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1）。在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，Prdm1可以抑制體細(xì)胞形成相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并致使部分外胚層細(xì)胞向生殖細(xì)胞譜系分化[10]。Dppa3（developmental pluripotency-associated 3）由母體效應(yīng)基因編碼，主要在PGCs、植入前胚胎和其他多能干細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)始于小鼠胚胎發(fā)育的第7.5天（E7.5），并持續(xù)表達(dá)至E15.5[11-12]。Dppa3主要包含N端結(jié)構(gòu)域、SAP-like和Splicing-like結(jié)構(gòu)域（包含核定位信號(hào)及出核信號(hào)）、C端結(jié)構(gòu)域（鼠源Dppa3蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1）。卵母細(xì)胞中Dppa3的缺失會(huì)導(dǎo)致囊胚數(shù)量減少、存活幼崽的數(shù)量下降[13]。Dppa3特異表達(dá)于PGCs和減數(shù)分裂前的生殖細(xì)胞，在PGCs特化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

圖1 鼠源Prdm1、鼠源Dppa3蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Schematic diagram of the primary structure of mouse Prdm1 and Dppa3 proteins AB

研究表明，Dppa3與Prdm1在胚胎-胚外界面存在共定位[14-15]。并且，Prdm1和Dppa3為mPGCs的常用標(biāo)志基因。本研究利用CRISPR基因編輯技術(shù)，在小鼠ESCs的Prdm1和Dppa3基因翻譯起始位點(diǎn)后分別插入eGFP和mCherry熒光蛋白編碼序列，構(gòu)建了小鼠原始生殖細(xì)胞報(bào)告基因系統(tǒng)，對(duì)于研究小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及質(zhì)粒mESCs：V6.5購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）。pSpCas9（BB）-2A-Puro（PX459）、pBluescript SK+質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Addgene。

1.2 針對(duì)鼠Prdm1和Dppa3基因sgRNA的設(shè)計(jì) 利用網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu）對(duì)鼠源Prdm1和Dppa3基因起始密碼子位置分別設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA，序列見(jiàn)表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 sgRNA名稱及序列Tab 1 The name and sequences of sgRNA

1.3 Donor質(zhì)粒的設(shè)計(jì)Donor質(zhì)粒由pBluescript SK+載體骨架以及目的Donor片段構(gòu)成，Donor片段主要由同源臂序列和要插入的目的片段構(gòu)成。eGFP-Prdm1 Donor片段由6部分組成，第1部分為切割位點(diǎn)上游5′端500 bp同源臂，第2部分為綠色熒光標(biāo)簽eGFP序列，第3部分為熒光標(biāo)簽與目的基因Prdm1之間的Linker序列，第4部分為切割位點(diǎn)下游Prdm1 1號(hào)外顯子序列（去除ATG）及450 bp內(nèi)含子序列，第5部分為FRT序列及Neomycin抗性基因序列，第6部分為3′端500 bp同源臂。mCherry-Dppa3 Donor片段設(shè)計(jì)原理同上。

1.4 mESC基因組DNA提?。?）收取細(xì)胞至1.5 mL EP管中，用200 μL Genomic Lysis Buffer重懸，加入終濃度為200 μg/mL的蛋白酶K，置于金屬浴55℃過(guò)夜。（2）每管加入200 μL異丙醇，顛倒混勻，置于-20℃靜置30 min，后4℃，13 500 r/min離心20 min。（3）棄掉上清，將沉淀用200 μL 75%乙醇洗2次，再用100%乙醇洗1次，棄掉上清，將沉淀晾干。（4）每管加入80 μL ddH2O，吹打混勻，將EP管置于55℃金屬浴1 h至沉淀徹底溶解。

1.5 PX459-sgRNA質(zhì)粒及Donor質(zhì)粒的構(gòu)建

1.5.1 PX459-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建（1）引物退火：利用降落PCR，使sgRNA與其互補(bǔ)鏈形成二聚體。體系：1 00 mmol/L濃度的sgRNA與其互補(bǔ)鏈各10 μL，ddH2O 30 μL；程序：95℃，5 min；-1℃/min，至25℃；4℃終止。（2）PX459載體線性化：用BbsI內(nèi)切酶切割載體，體系：PX459載體1 μg；10×FD buffer 2 μL；FastDigestBbsI 0.5 μL；用ddH2O補(bǔ)至20 μL。程序：37℃，1 h。載體酶切產(chǎn)物在電泳后切膠，純化回收。（3）連接：體系：線性化PX459載體50 ng；雙鏈sgRNA 100 ng，10×T4 ligase buffer 2 μL；T4 ligase 1 μL；用ddH2O補(bǔ)至20 μL。室溫連接2 h。（4）轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物加入到100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰上靜置30 min；42℃水浴熱激30 s；冰上靜置2 min，加入600 μL LB培養(yǎng)基，37℃，180 r/min搖菌45 min，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于Amp抗性的平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，后挑取單克隆菌落，送公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5.2 Donor質(zhì)粒的構(gòu)建（1）pBluescript SK+載體線性化：用EcoR1和BamH1內(nèi)切酶切割載體，體系：pBluescript SK+載體1 μg；10×FD buffer 2 μL；Fast－Digest EcoR1和BamH1內(nèi)切酶各0.5 μL；用ddH2O補(bǔ)至20 μL。程序：37℃，1 h。載體酶切產(chǎn)物在電泳后切膠，純化回收。（2）eGFP-Prdm1和mCherry-Dppa3 Donor片段擴(kuò)增：以mESC基因組DNA或質(zhì)粒為模板，利用PCR擴(kuò)出Donor片段。體系：5xHF Buffer 10 μL；10 mmol/L dNTP 1 μL；10 μmol/L上下游引物各1 μL；DMSO 1.5 μL；高保真DNA聚合酶0.5 μL；模板：若用質(zhì)粒為模板，則加入10 ng，若用基因組DNA為模板，則加入250 ng；用ddH2O補(bǔ)至50 μL。程序：98℃預(yù)變性3 min；98℃變性30 s，52℃退火20 s，72℃延伸，延伸時(shí)間根據(jù)片段長(zhǎng)度確定，本實(shí)驗(yàn)中所使用的高保真DNA聚合酶延伸速率為30 s/kb，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為32～35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。（3）連接：體系：線性化pBluescript SK+載體50 ng；Donor片段100 ng；T5 Mix 4 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。程序：30℃，40 min。（4）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，后挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，并送公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染mESCs在2i+LIF條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為DMEM、15%FBS、0.1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L L-glutamine、1 mmol/L PD、3 mmol/L CHIR、1 000 U/mL LIF。將12孔板用0.1%Gelatin包被30 min，每個(gè)孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，每?jī)商靷鞔淮?。提取px459-sgRNA、pBluescript-eGFP-Prdm1和pBluescript-mCherry-Dppa3 Donor質(zhì)粒。將px459-sgRNA和線性化pBluescripteGFP-mPrdm1 Donor質(zhì)粒各2 μg轉(zhuǎn)染至2×106個(gè)細(xì)胞中。

1.7 單克隆細(xì)胞的篩選及鑒定 轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)基并加入1.5 μg/mL Puromycin培養(yǎng)48 h，后更換培養(yǎng)基并加入400 μg/mL Neomycin培養(yǎng)1周。挑取單克隆細(xì)胞至24孔板中培養(yǎng)，提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。選取陽(yáng)性細(xì)胞，將2 μg pCAGGSFLPe質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至2×106個(gè)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)基并加入1.5 μg/mL Puromycin培養(yǎng)48 h后撤藥，繼續(xù)培養(yǎng)1周后挑取單克隆細(xì)胞至24孔板中培養(yǎng)，提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。

1.8 從mESCs向mPGCs的定向誘導(dǎo) 在體外誘導(dǎo)過(guò)程中，由mESCs向mPGCs的定向誘導(dǎo)主要由兩個(gè)步驟組成，第一步是mESCs在ActivinA和bFGF的作用下形成EpiLCs（epiblast-like cells），第二步是在BMP4、BMP8a、SCF、EGF、LIF的作用下由EpiLCs誘導(dǎo)形成PGCLCs（primordial germ cell-like cells）。

EpiLCs誘導(dǎo)：培養(yǎng)基成分為N2B27、1% KSR（Knockout serum replacement）、20 ng/mL ActivinA、12 ng/mL bFGF。將12孔板用0.1% Gelatin包被30 min，每個(gè)孔接種1×105個(gè)mESCs細(xì)胞，培養(yǎng)2 d，每天更換新鮮培養(yǎng)基，得到EpiLCs。

PGCLCs誘導(dǎo)：將2×103個(gè)EpiLCs接種到低吸附96孔板的一個(gè)孔中，PGCLCs培養(yǎng)基成分為GMEM、15%KSR、0.1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L L-glutamine、1 mmol/L sodium pyruvate、55 nmol/L 2-Mercaptoethanol、1 000 U LIF、500 ng/mL BMP4、500 ng/mL BMP8a、100 ng/mL SCF、50 ng/mL EGF。培養(yǎng)4 d后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/Cas9基因敲入系統(tǒng)的構(gòu)建

2.1.1 PX459-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果 對(duì)PX459-eGFP-Prdm1-sgRNA和PX459-mCherry-Dppa3-sgRNA重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，序列比對(duì)，編碼序列插入的位置和方向均正確，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功（測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2）。

圖2 sgRNA測(cè)序結(jié)果Fig 2 The sequencing results of sgRNA

2.1.2 Donor質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果eGFP-Prdm1 Donor片段由6部分組成，第1部分為切割位點(diǎn)上游5′端500 bp同源臂，第2部分為綠色熒光蛋白eGFP編碼序列，第3部分為eGFP編碼序列與目的基因Prdm1之間的Linker序列，Linker序列為5個(gè)連續(xù)的甘氨酸，第4部分為切割位點(diǎn)下游Prdm1 1號(hào)外顯子序列（去除ATG）及450 bp內(nèi)含子序列，第5部分為FRT序列及Neomycin抗性基因序列，第6部分為3′端500 bp同源臂（圖3A）。mCherry-Dppa3 Donor片段同樣由6部分組成，第1部分為切割位點(diǎn)上游5′端500 bp同源臂，第2部分為紅色熒光標(biāo)簽mCherry序列，第3部分為熒光標(biāo)簽與目的基因Dppa3之間的Linker序列，第4部分為切割位點(diǎn)下游Dppa3 1號(hào)外顯子序列（去除ATG）及450 bp內(nèi)含子序列，第5部分為FRT序列及Neomycin抗性編碼序列，第6部分為3′端500 bp同源臂（圖3B）。以mESCs基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增出Donor片段的第1、4、6部分，從含有相應(yīng)序列的質(zhì)粒上PCR擴(kuò)增出第2、5部分，第3部分Linker序列為公司合成，根據(jù)DNA同源重組的原理使用T5酶將這些片段克隆到pBluescript SK+載體上，經(jīng)公司測(cè)序，序列插入的位置和方向均正確，Donor質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 鼠Prdm1基因翻譯起始位點(diǎn)后插入eGFP編碼序列的細(xì)胞株鑒定 引物設(shè)計(jì)方案見(jiàn)圖3A。提取不同單克隆細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行PCR，首先通過(guò)引物P3和P4從37個(gè)單克隆中鑒定出2個(gè)陽(yáng)性克隆，以野生型（WT）細(xì)胞為對(duì)照，4號(hào)和37號(hào)克隆在750 bp位置出現(xiàn)條帶，說(shuō)明這2個(gè)克隆均成功插入eGFP編碼序列。接下來(lái)通過(guò)引物P1和P2判斷這2個(gè)陽(yáng)性克隆是純合子或是雜合子，其中WT在250 bp處出現(xiàn)條帶，4號(hào)克隆只在1 kb處出現(xiàn)條帶，為純合子；37號(hào)克隆分別在250 bp和1 kb處出現(xiàn)條帶，為雜合子。為了進(jìn)一步確認(rèn)eGFP編碼序列是否正確插入到鼠Prdm1基因翻譯起始位點(diǎn)后，從5′同源臂上游選取上游引物P7，在eGFP編碼片段上選取下游引物P8，PCR結(jié)果顯示，4號(hào)克隆和37號(hào)克隆均在700 bp位置出現(xiàn)條帶，說(shuō)明eGFP編碼序列正確插入到鼠Prdm1基因翻譯起始位點(diǎn)后。

為了提高基因編輯的效率，在Prdm1的1號(hào)和2號(hào)外顯子之間的內(nèi)含子上插入了Neomycin抗性編碼序列，其表達(dá)產(chǎn)物可以給細(xì)胞提供復(fù)制壓力，在使用Neomycin進(jìn)行篩選時(shí)，細(xì)胞為了存活，會(huì)產(chǎn)生更多的同源重組，同時(shí)在Neomycin抗性編碼片段兩端插入了同向的FRT位點(diǎn)，外源表達(dá)的重組酶Flippase可以切除兩個(gè)方向相同的FRT位點(diǎn)之間的序列，從而達(dá)到去除Neomycin抗性編碼片段的目的。挑選4號(hào)和37號(hào)陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)入pCAGGS-FLPe質(zhì)粒后用藥物進(jìn)行篩選，提取不同細(xì)胞克隆的基因組DNA進(jìn)行PCR，引物設(shè)計(jì)方案見(jiàn)圖3A。用引物P5和P6進(jìn)行PCR，成功去除Neomycin抗性編碼片段的克隆無(wú)法擴(kuò)出300 bp的條帶（圖4A）。

圖3 CRISPR介導(dǎo)的基因敲入策略模式圖Fig 3 Schematic diagram of CRISPR-mediated gene knock-in strategy

2.3 鼠Dppa3基因翻譯起始位點(diǎn)后插入mCherry編碼序列的細(xì)胞株鑒定 分別向上述4號(hào)和37號(hào)細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)染PX459-mCherry-Dppa3-sgRNA和mCherry-Dppa3-Donor質(zhì)粒，進(jìn)行抗性篩選后挑取單克隆并提取基因組DNA進(jìn)行鑒定，基因型鑒定引物設(shè)計(jì)方案見(jiàn)圖3B。挑取4號(hào)克隆中的純合子以及37號(hào)克隆中的雜合子，轉(zhuǎn)染pCAGGS-FLPe質(zhì)粒去除Neomycin抗性基因片段。最后得到4-14號(hào)克隆為eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3雙純合子細(xì)胞，37-8號(hào)克隆為eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3雙雜合子細(xì)胞（圖4B）。

圖4 eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3KnockIn細(xì)胞基因型鑒定結(jié)果Fig 4 The genotyping results of eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3 Knock In cells

2.4 流式檢測(cè)PGCs誘導(dǎo)結(jié)果 在進(jìn)行體外誘導(dǎo)前，即2i+LIF培養(yǎng)條件下，對(duì)WT細(xì)胞、eGFPPrdm1/mCherry-Dppa3雙雜合子細(xì)胞及雙純合子細(xì)胞進(jìn)行流式分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，WT細(xì)胞中未檢測(cè)到eGFP和mCherry熒光信號(hào)，Knock In細(xì)胞中可以檢測(cè)到微弱mCherry和eGFP熒光信號(hào)，并且純合子的mCherry和eGFP熒光信號(hào)比雜合子強(qiáng)，此結(jié)果符合在mESCs中Dppa3基因有少量表達(dá)，Prdm1基因也有微弱表達(dá)。

圖5 未誘導(dǎo)時(shí)WT及Knock In細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果Fig 5 Flow cytometry results of WT and Knock In cells without induction

選用WT細(xì)胞和eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3 Knock In細(xì)胞進(jìn)行PGCs誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)流程示意圖見(jiàn)圖6A），使用Activin A、bFGF和1%KSR刺激2 d后，細(xì)胞形態(tài)從克隆狀變成扁平的上皮樣，說(shuō)明成功將ESCs誘導(dǎo)為EpiLCs；然后將3×103個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到低吸附96孔板中培養(yǎng)，加入500 ng/mL BMP4、500 ng/mL BMP8a、100 ng/mL SCF、50 ng/mL EGF、1 000 U LIF，培養(yǎng)4 d后收集細(xì)胞進(jìn)行流式分析，培養(yǎng)過(guò)程見(jiàn)圖6B，流式分析結(jié)果見(jiàn)圖7，與WT相比，Knock In細(xì)胞出現(xiàn)明顯的eGFP和mCherry陽(yáng)性，成功由EpiLCs狀態(tài)誘導(dǎo)為PGCLCs，成功構(gòu)建了eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3 Knock In細(xì)胞系。

圖6 PGCLCs誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)流程示意圖Fig 6 Schematic diagram of PGCs induction experiment

圖7 原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)流式檢測(cè)結(jié)果Fig 7 The flow cytometry results of primordial germ cell induction

3 討論

PGCs是生殖細(xì)胞的起源，在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，PGCs在尿囊底部形成，隨著胚胎發(fā)育，大量的PGCs沿著后腸遷移到生殖嵴，最終分化為功能性配子，這種早期譜系選擇依賴于BMP/Smad信號(hào)通路激活Prdm1基因表達(dá)，從PGCs形成直至遷移到生殖嵴，Prdm1一直持續(xù)表達(dá)[16]。在小鼠中，Prdm1基因缺失可導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)大量的血液滲漏和組織凋亡，并在妊娠中期死亡。Prdm1純合子突變體胚胎無(wú)法產(chǎn)生PGCs，雜合子突變體胚胎中PGCs數(shù)量顯著減少[17]。Dppa3最初是在小鼠原腸胚時(shí)期出現(xiàn)并一直持續(xù)表達(dá)到E15.5。Dppa3缺陷的雌性個(gè)體可以正常受精，但由于染色質(zhì)壓縮和基因轉(zhuǎn)錄抑制，很難產(chǎn)生后代[18]。在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，PGCs在不同的時(shí)間點(diǎn)表達(dá)不同的基因并進(jìn)行特定的表觀遺傳重塑。當(dāng)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)3種特定的生殖細(xì)胞基因（Dppa3、Oct4和Nanos2）時(shí)，許多與干細(xì)胞自我更新以及生殖細(xì)胞程序相關(guān)的基因會(huì)被激活[19]，這些都表明Dppa3在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。

胚胎發(fā)育以及相關(guān)的遺傳信息通過(guò)配子傳遞給后代，因此研究PGCs的特化過(guò)程對(duì)于理解早期胚胎發(fā)育過(guò)程以及相關(guān)疾病的機(jī)制具有重要意義。但是早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，體內(nèi)PGCs數(shù)量十分稀少，這極大影響了對(duì)于早期生殖細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程及相關(guān)分子機(jī)制的探究，因此需要在體外建立由ESCs分化形成PGCs的培養(yǎng)系統(tǒng)。在之前的研究中，Ohinata等[20]構(gòu)建Prdm1-Venus及ECFP-Dppa3 BAC（Bacterial artificial chromosome），用顯微注射針將線性化的外源DNA片段注入小鼠受精卵的原核中，從而獲得Prdm1-Venus及ECFP-Dppa3轉(zhuǎn)基因小鼠，將這兩種小鼠進(jìn)行后續(xù)交配以獲得雙純合小鼠（將雙純合命名為BVSC：Blimp1-Venus and Stella-ECFP），并從與BVSC雄性交配的雌性小鼠囊胚中獲得帶有PGC報(bào)告基因的ES細(xì)胞系。此方法中外源DNA為隨機(jī)整合，不同整合位點(diǎn)的PGC報(bào)告基因的表達(dá)水平有很大的差異需要通過(guò)建系篩選外源基因高表達(dá)的系，過(guò)程繁瑣，并且外源DNA的隨機(jī)整合還可能影響內(nèi)源基因的表達(dá)。此外，真核細(xì)胞中的很多順式作用元件與靶基因相距較遠(yuǎn)，BAC質(zhì)粒中可能缺失這些遠(yuǎn)程調(diào)控元件，因此利用BAC質(zhì)粒獲得的帶有PGC報(bào)告基因的ES細(xì)胞系并不一定能真實(shí)地反映PGC基因在ES細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)。CRISPR-Cas9系統(tǒng)通過(guò)非常短小的guideRNA形成靶向特異性，該系統(tǒng)極大地簡(jiǎn)化了基因組編輯操作，應(yīng)用領(lǐng)域涵蓋干細(xì)胞工程、基因治療、組織和動(dòng)物疾病建模等諸多方面。

在本實(shí)驗(yàn)中，利用CRISPR技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因組定點(diǎn)編輯，在mESCs中構(gòu)建mPGCs分化的報(bào)告基因系統(tǒng)，為PGCs提供穩(wěn)定、可靠和安全的標(biāo)記方法，有助于后續(xù)進(jìn)一步探究PGCs分化的分子機(jī)制，也可促進(jìn)對(duì)早期胚胎發(fā)育過(guò)程的理解以及不孕不育等相關(guān)疾病的研究。