張薇，辛靈，閻濤，2

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院1.神經(jīng)病學(xué)研究所；2.神經(jīng)內(nèi)科，天津 300052）

腦卒中是導(dǎo)致全球患者死亡和殘疾的主要病因，顯著增加了患者家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。缺血性腦卒中是最常見的卒中亞型，缺血性腦卒中誘導(dǎo)損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern molecules，DAMPs）的激活，在損傷的大腦區(qū)域引發(fā)局部炎癥，這種局灶性炎癥進(jìn)一步加劇血腦屏障損傷、微血管衰竭、腦水腫和氧化應(yīng)激并直接誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡，加重腦損傷[1]。目前對急性缺血性腦卒中最有效的治療主要是組織纖溶酶原激活物溶栓治療或血管內(nèi)機(jī)械再通治療[2-3]。然而，相當(dāng)部分患者到達(dá)醫(yī)院時(shí)已錯(cuò)過最佳的治療時(shí)間窗，導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)功能障礙。許多分子靶點(diǎn)的藥物在減輕卒中動(dòng)物模型的神經(jīng)損傷方面顯示出巨大的潛力，但大多在臨床試驗(yàn)中失敗。因此，尋找缺血性腦卒中治療的新靶點(diǎn)來改善治療效果至關(guān)重要。Janus激酶2（Janus kinase2，JAK2）是蛋白酪氨酸激酶家族成員之一，調(diào)節(jié)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT1、STAT3和STAT5）等信號分子的激活[4]。JAK2/STAT3是JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑家族中最重要的途徑，通過多種生長因子和細(xì)胞因子的信號級聯(lián)反應(yīng)，參與調(diào)控細(xì)胞存活、增殖和分化的病理生理過程。AG490是一種酪氨酸激酶抑制劑，應(yīng)用于抑制JAK1、2。在腦缺血大鼠模型中，AG490治療可改善卒中后腦水腫、氧化應(yīng)激、炎癥水平[5]。有研究報(bào)道，自噬相關(guān)信號通路的激活參與卒中的病理生理變化過程，并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6]。然而AG490能否通過抑制JAK2/STAT3降低卒中后炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)自噬減輕血腦屏障損傷、改善神經(jīng)功能損傷尚缺乏相關(guān)研究。本研究旨在探討AG490對缺血性腦卒中后小鼠神經(jīng)功能改善的機(jī)制，為JAK1/2抑制劑成為未來缺血性腦卒中新的治療藥物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性C57BL/6J小鼠，20～22 g，6～8周齡，購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（京）2016-0006，批號：110011200109844553]。造模后隨機(jī)分為Control組、Stroke組、DMSO組、AG490組（AG490，JAK1/2抑制劑，購自美國MCE公司），每組18只。Control組為正常對照組，Stroke組不給予任何治療，DMSO組注射等量的DMSO溶劑，AG490組在造模后1 h、24 h及48 h腹腔注射AG490（5 mg/kg，溶解于5%DMSO+40%PEG300+55%NaCl）。所有小鼠提供充足的食物和水，并維持晝夜節(jié)律的穩(wěn)定。

1.2 方法

1.2.1 缺血性腦卒中模型及動(dòng)物處理 采用光化學(xué)法誘導(dǎo)局灶性大腦皮層缺血性腦卒中模型。主要步驟：稱重小鼠，在術(shù)前5 min腹腔注射玫瑰紅染料（50 mg/kg，0.9%生理鹽水溶解）。腹腔注射5%水合氯醛（70 μL/10 g）麻醉小鼠，之后將麻醉的小鼠固定于立體定位儀上，放置小鼠體溫維持板以維持體溫。沿顱骨中縫切開小鼠顱骨表面皮膚，約1 cm，暴露并標(biāo)記梗塞部位的顱骨外骨膜。將綠光源的光纖探頭固定于標(biāo)記部位，開啟綠光光源照射25 min，注意監(jiān)測小鼠生命體征。結(jié)束照射后縫合切口，碘伏再次對縫合傷口消毒，維持小鼠體溫至徹底清醒，恢復(fù)自由進(jìn)食水。造模成功率：95%，造模成功標(biāo)準(zhǔn)：小鼠造模后前肢和后肢屈曲，不能正常走直線，頭部在30 s內(nèi)偏離垂直軸＞10°，向輕癱側(cè)傾倒。

1.2.2 神經(jīng)功能評估 采用足錯(cuò)步實(shí)驗(yàn)評價(jià)其運(yùn)動(dòng)功能，判斷缺血性腦損傷后損傷程度和恢復(fù)情況。在完成造模后第1、3、7、14天的固定時(shí)間，讓小鼠在不規(guī)則的鐵網(wǎng)上行走，記錄小鼠行走100步中偏癱側(cè)掉落網(wǎng)格的數(shù)目，對掉落網(wǎng)格的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表示為（錯(cuò)步/總步）%。

1.2.3 RT-PCR檢測 目的基因的表達(dá)在造模后72 h處死小鼠，取新鮮腦組織，加入TRIzol裂解液，研碎充分，制備RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。20 μL的反應(yīng)體系由2.5 μL的cDNA、1.25 μL的正向引物、1.25 μL的反向引物、5.0 μL的無酶水和10 μL的SYBR green PCR Master Mix組成。通過RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)水平。通過與內(nèi)參基因Ct值之間的差值來計(jì)算基因表達(dá)差異，即2-△△Ct。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 primer sequences

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測 目的蛋白的表達(dá)在造模后72 h處死小鼠，收集缺血側(cè)皮質(zhì)組織，稱重后放入加有裂解液的研磨管勻漿，勻漿后的組織裂解物脈沖超聲處理30 s，然后以13 000 r/min 4℃離心15 min。收獲上清液并用Nanodrop測定蛋白質(zhì)濃度。提取的蛋白質(zhì)在10% SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含有5% BSA的0.1% Tween-TBS封閉膜，一抗[Claudin5（1∶1 000）、ZO-1（1∶1 000）、Occludin（1∶1 000）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1 000）、P62/SQSTM1（1∶1 000）、Beclin-1（1∶1 000）]4℃過夜孵育，抗小鼠GAPDH用作對照。用發(fā)光試劑盒檢測二抗結(jié)合的一抗。使用ImageJ軟件掃描和量化免疫反應(yīng)條帶。目的蛋白的相對表達(dá)量=目的條帶的灰度值/內(nèi)參的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用Graphpad Prism9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±sx表示。多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AG490改善小鼠缺血性腦卒中后的神經(jīng)功能如圖1所示，與Control相比，DMSO組和Stroke組的錯(cuò)步/總步比例在卒中后各時(shí)間點(diǎn)顯著增加，而在第3天、7天和14天，AG490組小鼠比DMSO組和Stroke組的錯(cuò)步/總步比例降低（F=3.704、9.199、10.83，均P＜0.05）。

圖1 AG490改善小鼠缺血性腦卒中后的神經(jīng)功能Fig 1 AG490 improves neurological function after ischemic stroke in mice

2.2 AG490抑制JAK2-STAT3的表達(dá) 如圖2所示，與Control相比，DMSO組和Stroke組小鼠腦組織中的JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)水平上調(diào)（F=8.718、12.12，均P＜0.05），而與DMSO組和Stroke組相比，AG490組小鼠JAK2和STAT3的mRNA水平表達(dá)下調(diào)（F=6.331、7.168，均P＜0.05）。

圖2 AG490抑制JAK2-STAT3的表達(dá)Fig 2 AG490 inhibits the expression of JAK2-STAT3

2.3 AG490改善小鼠缺血性腦卒中后的血腦屏障圖3A~3C顯示，與Control組相比，DMSO組和Stroke組小鼠腦組織中的Occludin、Claudin5和ZO-1的mRNA表 達(dá) 明 顯 降 低（F=29.83、25.22、20.49，均P＜0.05），而MMP-9的mRNA表達(dá)明顯升高（F=17.06，P＜0.05），而與DMSO組和Stroke組小鼠相比，AG490組小鼠腦組織中的Occludin、Claudin5和ZO-1的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（F=7.648、29.83、25.08，均P＜0.05），同時(shí)MMP-9的mRNA表達(dá)明顯降低（F=9.790，P＜0.01）。圖3F~3H結(jié)果顯示，與Control組相比，DMSO組和Stroke組小鼠腦組織中的Occludin、Claudin5和ZO-1的蛋白表達(dá)明顯降低（F=14.05、57.83、22.75，均P＜0.05），而與DMSO組和Stroke組小鼠比較，AG490組小鼠腦組織中的Occludin、Claudin5和ZO-1的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（F=12.42、10.88、14.32，均P＜0.05）。

圖3 AG490改善小鼠缺血性卒中后的血腦屏障損傷Fig 3 AG490 ameliorates blood-brain barrier disruption after ischemic stroke

2.4 AG490降低缺血性腦卒中后炎癥因子的表達(dá)水平 圖4顯示，與Control組相比，DMSO組和Stroke組小鼠IL-1α、MCP-1和C1q的水平升高（F=8.451、18.55、6.380，均P＜0.05），而與DMSO組和Stroke組相比，AG490組小鼠IL-1α、MCP-1和C1q的水平顯著降低（F=5.486、5.455、4.862，均P＜0.05）。

圖4 AG490降低缺血性腦卒中后炎癥因子的表達(dá)水平Fig 4 AG490 reduces the expression levels of inflammatory factors after ischemic stroke

2.5 AG490促進(jìn)缺血性腦卒中小鼠的自噬 如圖5所示，與Control組相比，DMSO和Stroke組腦組織中的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1輕度增加（F=95.85、20.07，均P＜0.05），而P62/SQSTM1降低（F=6.322，P＜0.05），與DMSO和Stroke組相比，AG490組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1的表達(dá)水平增加（F=6.092、15.52，均P＜0.05），而P62/SQSTM1的表達(dá)降低（F=8.143，P＜0.05）。

圖5 AG490促進(jìn)缺血性腦卒中小鼠的自噬Fig 5 AG490 promotes autophagy in ischemic stroke mice

3 討論

質(zhì)膜中的STAT3在各種細(xì)胞因子和生長因子刺激下被JAK2磷酸化，二聚化后移位入細(xì)胞核中，結(jié)合RelA/p65促進(jìn)核因子-κB的激活，參與免疫細(xì)胞的分化并介導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生，進(jìn)一步傳播和放大炎性損傷過程[7]。研究表明，腦卒中患者循環(huán)中JAK2、STAT3顯著上調(diào)[8]，STAT3基因敲除的卒中小鼠表現(xiàn)出較小的梗死面積、較輕的神經(jīng)功能缺損[9]。在過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，AG490的使用改善了細(xì)胞氧化損傷，同時(shí)下調(diào)了p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)[10]。針對JAK2-STAT3信號通路的抗神經(jīng)元凋亡療法可以增加卒中小鼠的存活率[11]。本研究通過光化學(xué)法誘導(dǎo)局灶性大腦皮層缺血性腦卒中模型，應(yīng)用AG490治療腦卒中小鼠，結(jié)果顯示AG490顯著改善小鼠卒中后神經(jīng)功能并同時(shí)降低卒中小鼠JAK2和STAT3表達(dá)水平。

缺血性腦卒中后，神經(jīng)血管單元的損傷導(dǎo)致血腦屏障破壞以及炎癥細(xì)胞和炎癥因子從體循環(huán)中流入，導(dǎo)致腦水腫和神經(jīng)元損傷并促進(jìn)出血轉(zhuǎn)化，最終增加死亡率。同時(shí)，腦損傷激活的內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌MMPs介導(dǎo)緊密連接蛋白（tight junction，TJs）的降解導(dǎo)致血腦屏障進(jìn)一步破壞，促進(jìn)白細(xì)胞募集到缺血后腦組織中增強(qiáng)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加速腦損傷[12]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中，IL-6誘導(dǎo)的JAK/STAT3通路激活降低了TJs的表達(dá)，而AG490的治療恢復(fù)了血腦屏障的功能[13]。在本研究中，缺血性腦卒中導(dǎo)致小鼠的Occludin、Claudin-5和ZO-1的降解，而AG490治療逆轉(zhuǎn)了Occludin、Claudin-5和ZO-1的表達(dá)。同時(shí)，卒中后MMP-9表達(dá)上調(diào)，MMP-9可通過增加卒中后血腦屏障的開放增加出血轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)，而AG490可部分抑制MMP-9的表達(dá)，進(jìn)一步表明AG490可通過改善血腦屏障介導(dǎo)部分神經(jīng)保護(hù)作用。

卒中后神經(jīng)損傷激活損傷相關(guān)的分子模式，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及中性粒細(xì)胞浸潤，釋放促炎細(xì)胞因子以及趨化因子[14]。研究表明，IL-1α、MCP-1、C1q等炎癥因子參與腦損傷的病理進(jìn)展并與預(yù)后相關(guān)[15-17]。IL-1α可促進(jìn)腦內(nèi)巨噬細(xì)胞的活化，在缺血24 h后，IL-1α的表達(dá)與局灶性血腦屏障破壞和神經(jīng)元死亡密切相關(guān)[15]。MCP-1參與卒中后錐體神經(jīng)元延遲性死亡的病理過程，并促進(jìn)卒中的復(fù)發(fā)事件[16]。而腦損傷后C1q的表達(dá)通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞突觸吞噬和突觸丟失顯著增加了小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1α、MCP-1和C1q在卒中后腦組織中表達(dá)上調(diào)，而IL-1α、MCP-1和C1q的水平在AG490治療顯著降低。表明AG490可通過降低卒中后炎癥因子的表達(dá)介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用。

自噬是細(xì)胞在應(yīng)激或損傷狀態(tài)下通過清除導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙的受損細(xì)胞成分維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的生物過程。卒中可影響自噬的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制誘導(dǎo)自噬發(fā)生，抑制細(xì)胞凋亡、增加卒中后神經(jīng)元的活力[6，18]。自噬受損會導(dǎo)致銜接蛋白p62積累，促進(jìn)TRAF6寡聚化激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[19]，調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生。研究表明，抑制JAK2/STAT3的激活可促進(jìn)小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成過程中的自噬[20]。此外，細(xì)胞質(zhì)STAT3通過與PKR結(jié)合抑制自噬[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，LC3-Ⅱ/Ⅰ作為自噬激活的標(biāo)志物在卒中后輕度增加，p62的表達(dá)在卒中后降低，而AG490的治療上調(diào)了LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表達(dá)，降低了P62的表達(dá)，表明AG490促進(jìn)卒中后的自噬。而AG490可以抑制JAK2-STAT3的表達(dá)，表明AG490通過抑制JAK2-STAT3的表達(dá)促進(jìn)卒中后的自噬過程。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬會加劇缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）誘導(dǎo)的血腦屏障損傷，而在激活自噬后可通過促進(jìn)ZO-1在細(xì)胞膜上的重新定位顯著逆轉(zhuǎn)I/R后的ZO-1的表達(dá)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，AG490可促進(jìn)自噬的發(fā)生并逆轉(zhuǎn)緊密連接蛋白的表達(dá)，表明AG490可能間接影響卒中后的自噬過程，抑制緊密連接蛋白的降解來改善血腦屏障功能障礙。綜上所述，AG490可通過促進(jìn)自噬間接調(diào)控神經(jīng)炎癥、改善血腦屏障功能障礙來介導(dǎo)卒中后的神經(jīng)保護(hù)作用。

總之，本研究表明，AG490抑制JAK2/STAT3通路激活，對腦缺血性損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，這可能是由減輕神經(jīng)炎癥、促進(jìn)卒中后的自噬以及改善血腦屏障損傷介導(dǎo)的。JAK2/STAT3通路介導(dǎo)卒中后神經(jīng)損傷機(jī)制的研究為腦缺血提供了新的見解和治療靶點(diǎn)，未來應(yīng)關(guān)注JAK2/STAT3作為缺血性腦卒中治療靶點(diǎn)的進(jìn)一步研究和臨床轉(zhuǎn)化。