王志慧，喬衛(wèi)

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，天津 300070）

抑郁癥是一種常見的精神障礙疾病，其臨床表現(xiàn)主要有持久性的心情低落、快感缺失、焦慮失眠，嚴重者甚至?xí)霈F(xiàn)自殺或自殘傾向[1]。抑郁癥臨床癥狀多樣化，病因尚不明確，其發(fā)病涉及多種機制，其中神經(jīng)炎癥[2]、下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸失調(diào)[3]、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平失調(diào)[4]、神經(jīng)營養(yǎng)因子水平改變[5]以及代謝途徑[6]等被認為與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)。目前抗抑郁的藥物以西藥為主，主要有三環(huán)、四環(huán)類抗抑郁藥物（如阿米替林）、5-羥色胺再攝取抑制劑（如帕羅西汀）以及5-羥色胺-去甲腎上腺素再攝取抑制劑（如文拉法辛）等。但是抗抑郁西藥在臨床使用中經(jīng)常產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，尤其是在長期服用的情況下。這就需要尋找并篩選有效安全的抗抑郁藥物[7-8]。

阿樸菲類生物堿屬于異喹啉類生物堿，是天然生物堿的一個重要類型，在自然界中分布廣泛且具有多種藥理活性。研究表明，阿樸菲類生物堿具有抗菌[9]、抗癌[10]、抗血小板聚集[11]以及多種神經(jīng)系統(tǒng)作用如對神經(jīng)細胞的保護作用[12]、抗抑郁作用[13]等。本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的方法對部分阿樸菲類生物堿的抗抑郁作用進行預(yù)測。并對作用靶點與信號通路進行整合分析，構(gòu)建阿樸菲類生物堿成分-抑郁癥靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，闡明其抗抑郁的作用機制。

1 材料與方法

1.1 阿樸菲類生物堿代表性化合物收集 通過檢索CNKI、Pubmed、CAS等數(shù)據(jù)庫收集阿樸菲類生物堿代表性化合物。

1.2 阿樸菲類生物堿潛在作用靶點的預(yù)測及篩選 根據(jù)已知41個阿樸菲類生物堿成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用Chem Bio Draw Ultra18軟件畫出化學(xué)結(jié)構(gòu)，并以sdf格式保存，將sdf文件上傳至Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，物種選擇為Homo sapiens，獲得每個活性成分的預(yù)測靶點。將所有化合物的靶點進行整合，刪除重復(fù)值得到所有成分的總靶點。

1.3 抑郁癥相關(guān)靶點篩選 將“Depression”為關(guān)鍵詞在Gene Cards數(shù)據(jù)庫中進行檢索，尋找與抑郁癥相關(guān)的潛在靶點。在此數(shù)據(jù)庫中Score值表示該靶點與疾病關(guān)系，Score值越大代表該靶點越重要，因此本次篩選設(shè)定大于5分的目標靶點作為抑郁癥的潛在作用靶點。

1.4 阿樸菲類生物堿成分與抑郁癥靶點的交集 將阿樸菲類生物堿成分的作用靶點與抑郁癥的相關(guān)靶點導(dǎo)入Venny2.1.0，得到阿樸菲類生物堿成分與抑郁癥的交集靶點，繪制韋恩圖。

1.5 阿樸菲類生物堿成分-抑郁癥靶點蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將1.4中得到的交集靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，設(shè)置“minimum required interaction score”為“highest confidence（0.700）”，隱藏游離節(jié)點，其余參數(shù)默認。獲得并下載交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，保存tsv格式文件。將結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO和KEGG富集分析 將得到的交集靶點導(dǎo)入DAVID平臺進行GO富集功能分析，包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）以及分子功能（MF），并進行KEGG通路富集分析。以P<0.01為顯著性閾值。另外再對P值從小到大排列，選出P值最小的前10個BP、CC和MF進行GO富集功能分析并繪制條形圖。篩選出P值最小的前10條KEGG通路，并繪制氣泡圖。

1.7 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將41個有效成分，78個交集靶點和84條通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2得到阿樸菲生物堿成分-抑郁癥靶點-通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并用軟件中的Network Analyzer工具進行拓撲分析，用Dgree值參數(shù)判斷阿樸菲類生物堿抗抑郁的主要活性成分和關(guān)鍵靶點通路。

1.8 分子對接 將PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵靶點蛋白與成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖中的活性成分導(dǎo)入Autodock 1.5.6，得到對接分數(shù)。之后利用pymol 2.3.1繪制蛋白配體3D結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 阿樸菲類生物堿成分 通過檢索數(shù)據(jù)庫收集并篩選阿樸菲類生物堿成分，最終獲得41個成分，如表1所示。將41個活性成分導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲取預(yù)測基因靶點，刪除重復(fù)值之后一共有662個總靶點。

表1 阿樸菲類生物堿成分信息Tab 1 Information of aporphine alkaloids constituents

2.2 阿樸菲類生物堿-抑郁癥相關(guān)靶點 從Gene Cards數(shù)據(jù)庫中共獲得12 812個與抑郁癥相關(guān)的靶點，由于靶點數(shù)目過多，所以將條件設(shè)為Score值≥5，將小于5的靶點剔除，篩選后得到342個靶點。將阿樸菲類生物堿活性成分的662個靶點與抑郁癥342個靶點導(dǎo)入Venny2.1.0得到成分-疾病交集靶點（圖1），從圖中可以看出二者交集靶點有78個。

圖1 阿樸菲類生物堿成分—抑郁癥靶點Fig 1 Aporphine alkaloids constituents—depression targets

2.3 阿樸菲類生物堿-抑郁癥相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖 將78個交集靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫得到蛋白互作關(guān)系，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），該網(wǎng)絡(luò)圖包含73個節(jié)點，216條邊。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值的大小即節(jié)點的大小和顏色深淺判斷靶點與疾病的關(guān)系，節(jié)點越大，顏色越深代表Degree值越大，意味著該靶點可能與阿樸菲類生物堿抗抑郁作用的關(guān)系越密切。由圖中可以看出同心圓內(nèi)圈靶點Degree值較大，其中N-甲基-D-天冬氨酸受體亞基基因（GRIN1）、5-羥色胺（5-HT）轉(zhuǎn)運蛋白（SLC6A4）、兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶基因（COMT）、單胺氧化酶A（MAOA）、蛋白激酶B1（Akt1）是Degree值最大的前5個靶點，這5個靶點可能與阿樸菲類生物堿抗抑郁作用有很大相關(guān)性。

圖2 阿樸菲類生物堿-抑郁癥靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 PPI network of aporphine alkaloids constituents depression targets

2.4 靶點GO功能和KEGG通路富集分析 為了進一步研究阿樸菲類生物堿抗抑郁的作用機制，將交集靶點導(dǎo)入DAVID平 臺（https://david．ncifcrf．gov/），進行GO（gene ontology）生 物 學(xué) 過 程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、和細胞定位（cellular component，CC）3種基因功能分析以及KEGG（Kyoto encyclo-pedia of genes and genomes）信號通路富集分析。通過篩選，得到符合條件的BP、CC、MF，富集前10位，利用微生信繪制條形圖（圖3），同樣取篩選出的前10條通路繪制氣泡圖（圖4）。

圖3 GO-BP、GO-CC、GO-MF分析結(jié)果條形圖Fig 3 Bar graphs of GO-BP、GO-CC、GO-MF analysis results

圖4 KEGG富集分析通路圖Fig 4 Pathway diagram of KEGG enrichment analysis

2.5 阿樸菲類生物堿成分-抑郁癥靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將41種阿樸菲類生物堿成分、交集靶點以及通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，應(yīng)用Network Analyzer進行拓撲分析，繪制成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)（圖5），如圖所示，共有203個節(jié)點，1 450條邊。方形代表成分，圓形代表交集靶點，菱形代表通路。圖中節(jié)點越大，顏色越深代表Degree值越大。結(jié)果可知，roemerine、menisperine、cassameridine、（-）-Nmethylasimilobine以 及N-methylactinodaphnine的節(jié)點較大，顏色較深，表明這5種化合物通過多個靶點，多條通路，進行疾病治療。圖中基因Degree值排名靠前的5個分別為MAPK1、MAP2K1、Akt1、PIK3R1、糖原合酶激酶-3B（GSK-3B），其中Akt1也是蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的主要基因，表明AKT1基因可能是阿樸菲類生物堿抗抑郁的關(guān)鍵作用靶點。通過網(wǎng)絡(luò)圖可以看出不同活性成分通過多靶點、多通路進行抗抑郁作用。

圖5 阿樸菲類生物堿成分-抑郁癥靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig 5 Aporphine alkaloids constituents-depression targets-pathway network diagram

2.6 分子對接 將PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點與網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵化合物進行分子對接，對接結(jié)果見表2，對接結(jié)構(gòu)圖見圖6。結(jié)果顯示，阿樸菲類生物堿代表性化合物和關(guān)鍵靶點之間均具有一定的親和力，蓮堿（Roemerine）與COMT結(jié)合力最強而蝙蝠葛林堿（menisperine）與SLC6A4的結(jié)合力最強。進一步證實阿樸菲類生物堿代表性化合物可以作為潛在的抗抑郁候選藥物。

圖6 Roemerine與COMT(1)、menisperine與SLC6A4(2)的對接結(jié)果圖(左)及對接模式圖(右)Fig 6 Docking results(left)and docking pattern(right)of roemerine-COMT(1)and menisperine-SLC6A4(2)

表2 阿樸菲類生物堿代表性化合物與關(guān)鍵靶點分子對接結(jié)果Tab 2 Molecular docking results of aporphine alkaloids constituents with key target

3 討論

抑郁癥因其病因及發(fā)病機制復(fù)雜，目前臨床治療尚未取得滿意的效果，阿樸菲類生物堿是自然界中分布廣泛且具有重要生物活性的一類生物堿[14]。已有研究結(jié)果表明部分阿樸菲類生物堿具有抗抑郁活性[13，15-17]。本文通過查閱文獻找出41個阿樸菲類生物堿，包括蓮堿、木蘭花堿、阿撲嗎啡、酸李堿等。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討阿樸菲類生物堿治療抑郁癥的分子作用機制。篩選出阿樸菲類生物堿抗抑郁有效性成分、作用靶點以及通路。由PPI網(wǎng)絡(luò)圖可知預(yù)測到的73個靶點中GRIN1、SLC6A4、COMT、MAOA、AKT1等靶點基因可能是阿樸菲類生物堿治療抑郁癥的主要靶點。GRIN1是NMDA的一個關(guān)鍵亞基，具有高鈣滲透性和對鎂的電壓依賴敏感性。有研究表明GRIN1通過調(diào)節(jié)突觸的可塑性在記憶和學(xué)習(xí)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-19]。SLC6A4在中樞系統(tǒng)中的功能涉及將5-羥色胺分子從突觸間隙轉(zhuǎn)運回突觸前末端以重新利用來調(diào)節(jié)5-羥色胺能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。SLC6A4的遺傳變異會影響精神疾病的一系列癥狀特征[20]。COMT是一種參與多巴胺降解的酶，CMOT表達或活動異?？赡軐?dǎo)致多巴胺能功能障礙，進而可能導(dǎo)致常見的精神疾病癥狀[21-22]。COMT基因的變異，特別是Val158Met多態(tài)性，已經(jīng)被廣泛地研究與抑郁癥的臨床表型和神經(jīng)認知過程的關(guān)系[23]。MAOA分解代謝單胺遞質(zhì)、血清素、去甲腎上腺素和多巴胺，在神經(jīng)精神疾病的發(fā)病、進展和治療中發(fā)揮重要作用。在抑郁癥中，MAOA表達的增加和腦內(nèi)血清素以及去甲腎上腺素水平降低被認為是主要的致病因素。MAOA基因和血清素信號通路基因的功能多態(tài)性與抑郁癥相關(guān)[24]。Akt1屬于3種Akt激酶之一，可以調(diào)節(jié)細胞增殖、存活、代謝、生長和血管生成等許多過程。研究表明，Akt1是一種下游酶，通過調(diào)節(jié)其下游效應(yīng)物GSK-3來促進生長因子介導(dǎo)的細胞存活和阻止細胞凋亡，GSK-3具有抗抑郁作用[25-27]。

由阿樸菲類生物堿-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖可知neuroactive ligand-receptor interaction，serotonergic synapse，cAMP signaling pathway，calcium signaling pathway，dopaminergic synapse為degree值最高的前5條通路。說明這些通路可能是阿樸菲類生物堿治療抑郁癥涉及的主要通路。神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路（neuroactive ligand-receptor interaction）是質(zhì)膜上所有與細胞內(nèi)外信號通路相關(guān)的受體配體的集合，在生理學(xué)上與神經(jīng)功能關(guān)系最密切[28]。5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）屬于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)通路，與多種精神疾病密切相關(guān)如抑郁癥、焦慮癥、精神分裂等。有研究表明大鼠缺乏5-羥色胺應(yīng)激時更容易產(chǎn)生抑郁和焦慮癥狀，并易導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶等認知功能受損，對應(yīng)激適應(yīng)能力下降[29]。cAMP信號通路又稱PKA系統(tǒng)，該通路與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)。大量研究表明AC-cAMPPKA信號通路在抑郁癥患者和動物的海馬和皮層中表達下調(diào)。鈣離子信號通路（calcium signaling pathway）與抑郁癥關(guān)系密切。長時程增強效應(yīng)（LTP）被認為是與抑郁癥的病因和治療有關(guān)的細胞機制之一。鈣與鈣調(diào)蛋白結(jié)合并激活最豐富的神經(jīng)元激酶α-CaM激酶Ⅱ。CaM激酶自身磷酸化并且還磷酸化AMPA受體，為LTP期間突觸末端的電導(dǎo)增加提供分子基礎(chǔ)。許多研究將LTP和鈣信號與壓力、焦慮和抑郁以及抗抑郁作用聯(lián)系起來[30-31]。多巴胺作為單胺類遞質(zhì)，是下丘腦和垂體的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)。多巴胺的合成、釋放、再攝取或代謝紊亂可導(dǎo)致抑郁癥。多巴胺缺乏可以下調(diào)多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白但上調(diào)D2/3受體的濃度。抑郁癥患者杏仁核多巴胺轉(zhuǎn)運體減少，多巴胺D2/3受體增加，提示抑郁癥可能與大腦多巴胺缺乏有關(guān)。因此，多巴胺在抑郁癥的病理生理過程中起著重要作用[32]。

本文通過構(gòu)建阿樸菲類生物堿-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，從整體角度分析了阿樸菲類生物堿抗抑郁靶點以及通路，并通過分子對接技術(shù)驗證了阿樸菲類生物堿化合物與關(guān)鍵靶點的對接結(jié)果。綜上所述，阿樸菲類生物堿主要通過GRIN1、SLC6A4、COMT、MAOA、Akt1等靶點以及neuroactive ligandreceptor interaction，serotonergic synapse，cAMP signaling pathway，calcium signaling pathway，dopaminergic synapse等通路進行多靶點、通路整合調(diào)節(jié)，發(fā)揮抗抑郁作用。本研究為進一步研究抗抑郁活性成分的實驗奠定了理論基礎(chǔ)。