秦萬昌，黃書奇，胡德慶

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，天津 300070）

染色質(zhì)重塑復(fù)合物可以通過水解ATP釋放能量，使組蛋白與DNA之間的構(gòu)象發(fā)生改變，從而使暴露的DNA處于可以被結(jié)合的狀態(tài)，達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的作用[1]?，F(xiàn)已知共有4種染色質(zhì)重塑復(fù)合物，分別為交換型轉(zhuǎn)換缺陷和蔗糖不發(fā)酵型（yeast mating type switch/sucrose non-fermentable，SWI/SNF）染色質(zhì)重塑復(fù)合物、模擬開關(guān)型（imitation switch，ISWI）染色質(zhì)重塑復(fù)合物、解旋酶DNA結(jié)合型（chromodomain helicase DNA-binding，CHD）染色質(zhì)重塑復(fù)合物、擬南芥型染色質(zhì)重塑復(fù)合物（inositol auxotrophy，INO80）[2]。Smarcad1屬于SWI/SNF家族，其可以通過水解ATP釋放能量發(fā)揮染色質(zhì)重塑的作用[3]。有報道指出，Smarcad1包含有一個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及雙核定位信號[4-5]。因此在DNA復(fù)制過程中，Smarcad1能夠維持染色質(zhì)沉默狀態(tài)[6]，在胚胎的早期發(fā)育中，其通過調(diào)節(jié)不同組蛋白修飾來維持胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）多能性[7]。獲得較高純度以及較大蛋白量的Smarcad1是對其生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深入研究的關(guān)鍵。由于原核表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短、操作簡單、抗污染能力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)性高等特點，因此是實驗室蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)先選擇的表達(dá)系統(tǒng)。所制備的高質(zhì)量蛋白能夠被應(yīng)用于多個方面，其中利用蛋白免疫動物制備特異性多克隆抗體能夠很大程度上保證實驗的可重復(fù)性。因此本文旨在通過構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒后使用原核系統(tǒng)對Smarcad1蛋白進(jìn)行體外表達(dá)、分離與純化，為Smarcad1蛋白相關(guān)的生物化學(xué)實驗提供足量的高質(zhì)量蛋白質(zhì)，并利用此蛋白制備多克隆抗體，從而為揭示Smarcad1在早期胚胎發(fā)育過程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料Rosetta感受態(tài)、DH5α感受態(tài)、pcDNA3.1-Flag-Smarcad1質(zhì)粒、pET16b質(zhì)粒為本實驗室所保存。T4連接酶購買自TransGen公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自Vazyme公司。NdeⅠ限制性內(nèi)切酶、XholⅠ限制性內(nèi)切酶以及Western印跡顯色試劑盒均購自Thermo公司。膠回收試劑盒購自Vazyme公司。鼠源、兔源IgG二抗購自Santa Cruz biotechnology。序列合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。氯化鈉、酵母粉、蛋白胨均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。Ni-NTA購自BBI公司?？捡R斯R250購自索萊寶公司?？贵w制備由武漢愛博泰克生物科技有限公司完成。293T、B16、V6.5細(xì)胞均為本實驗室所保存，用于檢測Smarcad1抗體在不同細(xì)胞系中的結(jié)合目的蛋白能力。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 確定合適的Smarcad1片段作為抗原片段，根據(jù)抗原預(yù)測選擇Smarcad1的第1至132位氨基酸為目的片段，設(shè)計引物，上游引物：5′-GGAATTCCATATGATGAATCTTTTCAACTTGGA-3′，下游引物：5′-AAACTCGAGTCAGGATTCTTCATCTTCAGATG-3′，使用pcDNA3.1-Flag-Smarcad1質(zhì)粒作為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），產(chǎn)生一條約400 bp的目的條帶，將此條帶進(jìn)行膠回收，使用NdeⅠ、XholⅠ對膠回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，對雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。同時，使用NdeⅠ、XholⅠ對pET-16b載體進(jìn)行雙酶切，得到酶切產(chǎn)物后進(jìn)行膠回收。將所得膠回收產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，37℃孵育過夜，待單克隆菌落形成后，挑菌至空LB培養(yǎng)基進(jìn)行菌落PCR，鑒定出陽性菌液后，進(jìn)行質(zhì)粒小提，將所提質(zhì)粒進(jìn)行測序得到pET-16b-Smarcad1-F1質(zhì)粒。

1.2.2 重組蛋白的原核表達(dá)與純化 選擇Rosetta感受態(tài)作為表達(dá)菌株，將pET-16b-Smarcad1-F1轉(zhuǎn)化至Rosetta，待單克隆菌落形成后，挑菌至LB AMP+搖床中培養(yǎng)，37℃，220 r/min，7 h，菌液渾濁后，將菌液接種至500 mL LB AMP+搖床中培養(yǎng)，220 r/min，37℃，4 h，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前樣本，4 h后，加入200 μmol IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)置搖床條件為16℃，12 h，220 r/min，誘導(dǎo)完成后取1 mL菌液作為誘導(dǎo)后樣本。隨后，離心收集全部菌體，加入裂解液，以30 s運(yùn)行，30 s暫停，40%能量，總時間6 min進(jìn)行超聲，將超聲后懸液離心，分離上清與沉淀。在上清中加入Ni-NTA進(jìn)行孵育，2 h孵育結(jié)束后，離心收集鎳珠，對鎳珠清洗后進(jìn)行洗脫，得到洗脫液（Elution1、Elution2、Elution3）。將洗脫液加入超濾管進(jìn)行超濾，最終收集蛋白。

1.2.3 蛋白的檢測與抗體制備 選擇不同階段的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，將蛋白送至武漢愛博泰克生物科技公司，免疫實驗動物（兔），約45 d后得到免疫前血清，以及含有Smarcad1特異性抗體的免疫后血清。

1.2.4 Western印跡檢測抗體特異性 分別收集293T、B16、V6.5細(xì)胞蛋白，以及在V6.5中敲低Smarcad1的表達(dá)作為陰性對照，293T中過表達(dá)Smarcad1作為陽性對照，進(jìn)行Western印跡檢測：配制8%分離膠，4%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠。加入1×Runnning Buffer沒過玻璃板，在膠孔內(nèi)加入一定量的蛋白液，利用電泳進(jìn)行蛋白分離。蛋白電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，切去濃縮膠，制作轉(zhuǎn)膜裝置。加入1×Trans Buffer。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜做好標(biāo)記，放于5%牛奶的TBST中，封閉1 h。隨后清洗膜，配一抗，1∶2 000稀釋抗體，將膜放于一抗4℃過夜。一抗后，使用TBST漂洗膜，置于搖床搖洗5 min，共3次。使用TBST配制二抗，1∶10 000稀釋，敷二抗，室溫，45 min。將膜置于搖床上用TBST漂洗5 min，3次。隨后配制曝光液，將曝光液覆蓋在膜表面，曝光，記錄。

1.2.5 Co-IP檢測抗體特異性 在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-Smarcad1質(zhì)粒，48 h后蛋白表達(dá)，收集細(xì)胞使用裂解液進(jìn)行裂解，隨后超聲使蛋白充分釋放，離心后收集上清，取一定量上清作為對照。在細(xì)胞上清中加入ProteinA/G beads，再分別加入IgG以及Smarcad1特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀，4℃孵育，隨后離心，分別收集沉淀，以Flag抗體進(jìn)行Western印跡。

1.2.6 免疫熒光檢測抗體特異性 在6孔板內(nèi)接種一定量B16細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80%愈合率后，使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，隨后，進(jìn)行打孔透化以及BSA封閉，封閉結(jié)束后，使用Smarcad1抗體作為一抗進(jìn)行孵育，一抗孵育結(jié)束后進(jìn)行二抗孵育以及DAPI染色，封片，最后使用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-16b-Smarcad1-F1的構(gòu)建 選取Smarcad1第1至132位氨基酸作為目的基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果產(chǎn)生399 bp的目的片段（圖1A），成功得到目的基因片段。利用XholⅠ、NdeⅠ對pET-16b載體進(jìn)行雙酶切，得到酶切產(chǎn)物，為一條約6 000 bp的目的條帶（圖1B），連接轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果檢測出多個陽性菌落克隆，目的條帶位置符合預(yù)期（圖1C）。表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-16b-Smarcad1-F1構(gòu)建成功。

圖1 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-16b-Smarcad1-F1的構(gòu)建Fig 1 Construction of prokaryotic expression plasmid pET-16b-Smarcad1-F1

2.2 Smarcad1蛋白的表達(dá)純化 考馬斯亮藍(lán)染色后，結(jié)果顯示相較于誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后產(chǎn)生明顯目的蛋白，此蛋白在上清液與沉淀中均有分布，洗脫后，目的蛋白純度明顯增加，并且其分子量大小為27 kD，符合預(yù)期蛋白分子量，說明Smarcad1-F1蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)純化，見圖2。

圖2 Smarcad1蛋白的表達(dá)純化Fig 2 Expression purification of Smarcad1 protein

2.3 抗體特異性驗證

2.3.1 Western印跡檢測抗體特異性Western印跡驗證制備的抗體能否結(jié)合目的蛋白，結(jié)果顯示，相較于陰性對照組，此抗體能夠識別B16細(xì)胞以及V6.5細(xì)胞中Smarcad1蛋白，不能識別293T細(xì)胞中目的蛋白，可能與293T細(xì)胞Smarcad1蛋白表達(dá)水平較低有關(guān)。此結(jié)果說明制備的目的抗體能夠應(yīng)用于Western印跡實驗，且目的條帶清晰（圖3）。

圖3 Western印跡檢測抗體特異性Fig 3 Western blotting detection of antibody specificity

2.3.2 Co-IP檢測抗體特異性 利用免疫共沉淀實驗檢測該目的抗體特異性，結(jié)果顯示相較于IgG組，制備的目的抗體能夠識別細(xì)胞內(nèi)Smarcad1蛋白，成功沉淀出目的蛋白，說明此抗體可以與Smarcad1蛋白相互作用（圖4）。

圖4 Co-IP檢測抗體特異性Fig 4 Co-IP detection of antibody specificity

2.3.3 免疫熒光檢測抗體特異性 為進(jìn)一步驗證此目的抗體的特異性，在B16細(xì)胞中進(jìn)行免疫熒光實驗，結(jié)果顯示Smarcad1抗體能夠識別細(xì)胞內(nèi)目的蛋白，熒光顯微鏡下呈綠色熒光，且此蛋白主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，表明此抗體能夠特異性識別細(xì)胞內(nèi)源性Smarcad1蛋白，再次驗證了制備的Smarcad1抗體的特異性（圖5）。

圖5 免疫熒光檢測抗體特異性Fig 5 Immunofluorescence detection of antibody specificity

3 討論

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）是一類具有自我更新以及發(fā)育多能性的細(xì)胞，最初由Evans等[8]從小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離而來，并且其可以發(fā)育成為包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的任何細(xì)胞[9]，雖然Samrcad1的表達(dá)貫穿細(xì)胞的整個發(fā)育階段，但其表達(dá)的高峰主要集中于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以及囊胚階段[10-11]，缺失了Samrcad1的細(xì)胞會表現(xiàn)出嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)改變，并且使細(xì)胞傾向于逃離自我更新狀態(tài)，展示了Samrcad1極強(qiáng)的對細(xì)胞發(fā)育過程的控制作用。在以往的報道中，Dongding等[12]發(fā)現(xiàn)Samrcad1通過其CUE domain與KAP1結(jié)合在Oct4、Nanog等多能性基因上，從而維持了mESC的多能性。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒是構(gòu)成哺乳動物基因組的重要組成部分，Smarcad1同樣能夠與之結(jié)合發(fā)揮抑制作用[13]。因此已有充分證據(jù)表明Smarcad1作為一個多能性轉(zhuǎn)錄因子在ESC的早期發(fā)育中具有重要作用，但其對多能細(xì)胞染色質(zhì)環(huán)境的調(diào)控仍知之甚少。

為進(jìn)一步研究Smarcad1在胚胎發(fā)育過程中的作用機(jī)制，本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)純化出Smarcad1蛋白，并成功制備出特異性較高的Smarcad1多克隆抗體。相較于單克隆抗體，多克隆抗體能夠識別任一抗原上的多個表位，在抗體制備中成本相對低廉且制備速度較快，制備過程較單克隆抗體更加簡單。并且由于多克隆抗體可識別多個表位，因此有利于蛋白質(zhì)免疫共沉淀和蛋白質(zhì)染色質(zhì)免疫沉淀實驗獲得更好的結(jié)果[14-15]，這為后續(xù)檢測Smarcad1在染色質(zhì)上的結(jié)合情況打下良好基礎(chǔ)，有利于研究Smarcad1在染色質(zhì)水平所發(fā)揮的功能。而且實驗室自己制備抗體除了可以彌補(bǔ)商品化抗體不足的缺點外，還能夠保證在多次實驗中所用抗體的一致性，排除了商品批號等問題帶來的誤差，提高了實驗的可重復(fù)性，本研究也為后續(xù)實驗室制備多種蛋白以及多克隆抗體提供借鑒。

綜上所述，本研究基于Samrcad1在胚胎發(fā)育中具有重要作用，為了進(jìn)一步探究其具體作用機(jī)制，在實驗室條件下，利用原核表達(dá)系統(tǒng)純化出純度較高、免疫原性較好的目的蛋白。使用此目的蛋白制備多克隆抗體，具有特異性高、親和能力強(qiáng)等優(yōu)點，為進(jìn)一步研究Samrcad1在不同領(lǐng)域中的作用奠定基礎(chǔ)，同時也為其他蛋白的體外表達(dá)純化提供了思路，通過這一方式，大大降低實驗室消耗，穩(wěn)定實驗結(jié)果，有利于實驗室長期發(fā)展。