張凌云，趙威

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科，天津 300052）

賁門失弛緩癥（AC）是一種罕見(jiàn)的食管運(yùn)動(dòng)障礙性疾病，表現(xiàn)為體重減輕、吞咽困難、反流和胸痛。雖然發(fā)病率低，但是患病率并不低，賁門失弛緩癥嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。它的發(fā)病機(jī)制至今仍然未知，目前現(xiàn)有的治療方式如腹腔鏡heller肌切開(kāi)術(shù)（LHM）、球囊擴(kuò)張術(shù)（PD）或經(jīng)口內(nèi)鏡肌切開(kāi)術(shù)（POEM）等都只能控制癥狀，而不能治愈疾病。雖短期效果好，但長(zhǎng)期效果不理想，復(fù)發(fā)率高[2-3]。這使得研究AC的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

免疫介導(dǎo)的神經(jīng)節(jié)炎可能誘發(fā)AC的食管肌層神經(jīng)元損傷，包括嗜酸性粒細(xì)胞在內(nèi)的各種炎癥細(xì)胞參與了這一過(guò)程[4-6]。筆者還在AC患者POEM期間采集的肌肉標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了食管固有肌層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并與神經(jīng)節(jié)炎和肌神經(jīng)元損傷有關(guān)[7]。由于嗜酸細(xì)胞釋放的物質(zhì)，如嗜酸細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP）和嗜酸細(xì)胞源性神經(jīng)毒素（EDN）可損傷神經(jīng)[8]，而POEM前食管肌層內(nèi)的嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)與治療后預(yù)后不良有關(guān)[7]。筆者推測(cè)，食管平滑肌中的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)可能與AC的發(fā)病機(jī)制有密切的關(guān)系。然而，缺乏食管固有肌層嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)的動(dòng)物模型是進(jìn)一步研究的主要障礙。

在本研究中，筆者借鑒嗜酸性粒細(xì)胞食管炎（EoE）動(dòng)物模型的方法制作了嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)食管肌層的AC模型。此外，筆者還研究了抗原暴露時(shí)間與食管壁嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度、食管肌層神經(jīng)元的喪失以及食管運(yùn)動(dòng)異常之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料BALB/c小鼠50只，雌雄各半，約4～6周齡。均由北京維多利亞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，使用抽簽法將小鼠隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（n=20）和模型組（n=30）。分別在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0 d、21 d、28 d）比較兩組的體重、食管下括約肌壓力（LESP）、食管寬度和食管排空情況。食管壁的嗜酸細(xì)胞數(shù)量和食管固有肌層神經(jīng)元的數(shù)量也分別在基線和終點(diǎn)進(jìn)行了組間比較。此外，還比較了模型組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的食管運(yùn)動(dòng)和組織學(xué)參數(shù)。在模型組，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，使用抽簽法隨機(jī)選擇10只小鼠處死后進(jìn)行食管病理檢查。而在對(duì)照組中，也分別在基線和終點(diǎn)隨機(jī)選擇10只小鼠進(jìn)行同樣的檢查。

1.2.2 模型構(gòu)建 用3%的異氟烷吸入法對(duì)小鼠進(jìn)行輕度麻醉，并腹腔注射含50 μg卵清蛋白（Sigma，美國(guó)）和1 mg明礬（Sigma，美國(guó)）的PBS溶液（50 μg/1.0 mg/0.5 mL），兩次間隔14 d。從第15天開(kāi)始，在吸入10%異氟烷麻醉的情況下，用微吸管向小鼠鼻內(nèi)注射150 μg卵白蛋白（OVA）。上述操作每周進(jìn)行3次，持續(xù)2周。除最后1次外，每次手術(shù)后1 h給予小鼠正常的飲用水和飲食。而對(duì)照組則給予與模型組相同體積的PBS溶液。

1.2.3 食管測(cè)壓 吸入麻醉后，使用水灌注壓力測(cè)量系統(tǒng)（MMS，荷蘭）進(jìn)行測(cè)壓。記錄小鼠的LESP。

1.2.4 食管排空 小鼠保持仰臥位，將0.1 mL碘海醇注入食管內(nèi)。X光透視下最寬處為食管的寬度。然后，將另一個(gè)帶改良針頭的灌胃針將標(biāo)記物（直徑1 mm的不銹鋼球，運(yùn)城縣康達(dá)鋼球有限公司）從針尖釋放到食管的胸骨角水平處。通過(guò)X射線透視并記錄標(biāo)記物通過(guò)食管的整個(gè)過(guò)程。標(biāo)記物從胸骨角水平到賁門水平和通過(guò)賁門的時(shí)間分別被記錄為食管通過(guò)時(shí)間和賁門通過(guò)時(shí)間。

1.2.5 組織學(xué)分析 將LES部位組織進(jìn)行固定包埋，制成5 μm的切片，進(jìn)行HE及免疫組化染色。對(duì)主要堿性蛋白（MBP）、嗜酸細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP）和SOX-10進(jìn)行免疫組化染色，以分別識(shí)別活化的嗜酸性粒細(xì)胞和食管肌層神經(jīng)元。

1.2.6 免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià) 在光鏡下進(jìn)行免疫組化染色的半定量分析，通過(guò)免疫組織化學(xué)評(píng)分（IHS）進(jìn)行評(píng)估。IHS的計(jì)算方法是將數(shù)量評(píng)分（1%～10%為1，11%～50%為2，51%～80%為3，81%～100%為4）與染色強(qiáng)度評(píng)分（0=陰性，1=弱，2=中等，3=強(qiáng)）相乘。IHS的范圍從0到12。9～12分的IHS被認(rèn)為是強(qiáng)免疫反應(yīng)性，5～8分是中度，1～4分是弱，0分是陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用用SPSS 22.0進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。組間和模型組內(nèi)的比較酌情使用非配對(duì)t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行分析。嗜酸細(xì)胞計(jì)數(shù)與食管肌層神經(jīng)元之間的相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般狀況和體重 模型組小鼠從第21天攝取的食物量顯著減少，并表現(xiàn)出活動(dòng)減少和毛發(fā)豎立等癥狀。隨著OVA刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組小鼠體重低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第28天，t=-2.569，P=0.019）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖1 不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的體重Fig 1 The body weight at different time points

2.2 小鼠的LESP與對(duì)照組相比，模型組小鼠在基線和第21天時(shí)LESP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在第28天時(shí)，模型組LESP比對(duì)照組高（t=2.187，P=0.042）。同時(shí)，模型組隨著OVA刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，與基線狀態(tài)相比，LESP在28 d時(shí)增高（t=3.082，P=0.004），見(jiàn)圖2。

圖2 不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的LESPFig 2 The LESP during different time points

2.3 食道排空和食道放射檢查 與對(duì)照組相比，模型組的食管通過(guò)時(shí)間在第21天（t=2.540，P=0.017）和第28天（t=3.993，P=0.001）時(shí)明顯延長(zhǎng)，賁門通過(guò)時(shí)間在第28天時(shí)明顯延長(zhǎng)（t=2.168，P=0.044），食管寬度無(wú)顯著差異。隨著OVA刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，與基線狀態(tài)相比，模型組在第21天（t=5.429，P<0.000 1）、第28天（t=7.149，P<0.000 1）時(shí)食管通過(guò)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，在第28天時(shí)，賁門通過(guò)時(shí)間明顯延長(zhǎng)（t=2.227，P=0.032），而食管寬度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)明顯差異（圖3）。

圖3 食管排空和X線放射檢查Fig 3 Esophageal emptying test and esophageal radiography

2.4 小鼠食管的組織病理學(xué)HE染色 兩組在基線時(shí)食管內(nèi)幾乎沒(méi)有嗜酸性粒細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組固有肌層（t=4.587，P<0.000 1）和黏膜層（t=8.417，P<0.000 1）的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量均超過(guò)對(duì)照組。此外，模型組隨著OVA刺激的延長(zhǎng)，食管固有肌層第28天時(shí)（t=4.429，P=0.000 3）嗜酸性粒細(xì)胞較基線增加，黏膜層第21天（t=5.219，P<0.000 1）和第28天（t=4.623，P=0.000 2）較基線增多（圖4、5）。

圖4 食管組織中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量Fig 4 Number of eosinophils in esophageal tissue

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，模型組食管肌層MBP陽(yáng)性嗜酸性粒細(xì)胞散在或局灶分布，并伴有散在的ECP和EDN陽(yáng)性顆粒。相反，在對(duì)照組中未觀察到MBP、ECP和EDN的表達(dá)（圖5）。

圖5 第28天時(shí)對(duì)照組和模型組小鼠食管組織的嗜酸性粒細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色（400×）Fig 5 Immunohistochemical staining of the esophageal tissue for eosinophils，and nerve cells of mice in control and model group at D28（400×）

2.5 SOX-10顯示的肌層神經(jīng)元 基線時(shí)，兩組無(wú)差異，第28天時(shí)，模型組肌層神經(jīng)元減少（t=-4.283，P<0.000 1）。隨著OVA暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，與基線相比，模型組的肌間神經(jīng)元在第28天時(shí)（t=-4.328，P=0.000 4）明顯減少（圖6）。

圖6 SOX-10顯示的肌間神經(jīng)元Fig 6 Myenteric neurons indicated by Sox-10

2.6 肌層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與肌間神經(jīng)元的相關(guān)性 食管平滑肌層嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量與Sox-10表達(dá)所表明的肌間神經(jīng)元呈負(fù)相關(guān)（r=0.531）（圖7）。

圖7 肌層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與肌間神經(jīng)元的相關(guān)性Fig 7 The correlation between eosinophil infiltration and the myenteric neurons

3 討論

在建立EoE動(dòng)物模型的各種方法中[9-12]，呼吸道抗原，如卵清蛋白（OVA），操作簡(jiǎn)單，成本低，易于控制實(shí)驗(yàn)條件[13]。然而，在上述小鼠模型中[9，12-13]，嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)的深度主要在食管鱗狀上皮、黏膜肌層和黏膜下層，這與以往AC的病理發(fā)現(xiàn)不一致。與傳統(tǒng)的EoE小鼠模型相比，在致敏小鼠中，較長(zhǎng)時(shí)間的呼吸道抗原暴露可誘發(fā)食管固有肌層的嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)、食管固有肌層神經(jīng)元的喪失和AC樣食管運(yùn)動(dòng)障礙。

在研究結(jié)束時(shí)，小鼠食管固有肌層出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)類似AC的食管異常運(yùn)動(dòng)。此外，食管肌層中嗜酸性粒細(xì)胞的增加與食管神經(jīng)元的減少呈正相關(guān)。由于X射線沒(méi)有發(fā)現(xiàn)食管狹窄，因此可以合理推測(cè)，食管肌層中的嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)可能誘發(fā)神經(jīng)元的減少和AC樣食管運(yùn)動(dòng)障礙。這可能與嗜酸細(xì)胞分泌物釋放，LES蠕動(dòng)和松弛障礙，或細(xì)胞毒性嗜酸性粒細(xì)胞分泌物的釋放，如ECP和EDN[8]有關(guān)。在本研究中，ECP和EDN均由免疫組化證實(shí)，支持該假設(shè)。今后，有必要在小鼠模型中進(jìn)一步探討相關(guān)的細(xì)胞毒性物質(zhì)。

也有研究表明，OVA也可以誘導(dǎo)肥大細(xì)胞在食管壁的浸潤(rùn)[14]。Mavi等[15]發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)跨基因的EoE小鼠模型中，食管運(yùn)動(dòng)功能障礙是由于肥大細(xì)胞炎癥。但在以前的研究中，食管固有肌層中嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)程度以及肌層神經(jīng)元的數(shù)量都未得到明確的體現(xiàn)。因此，以前的研究結(jié)果不能作為排除本研究中由嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)引起的AC樣食管運(yùn)動(dòng)障礙的可能性的證據(jù)。

嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞都可以在AC患者的食管固有肌層標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)[5，7，16]。除了上述不一致的證據(jù)外，一個(gè)臨床證據(jù)甚至認(rèn)為，由于食管運(yùn)動(dòng)的改善和嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)的減少，對(duì)AC使用潑尼松龍會(huì)導(dǎo)致吞咽困難的完全消失[17]。迄今為止，仍不清楚哪些炎癥細(xì)胞對(duì)AC的發(fā)生貢獻(xiàn)最大。在這個(gè)問(wèn)題上，這種OVA誘導(dǎo)的小鼠模型具有類似AC的食管組織學(xué)和功能特征，為今后的研究提供了一個(gè)合適的平臺(tái)。

嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)食道的深度與呼吸道抗原的類型和接觸時(shí)間有關(guān)。簡(jiǎn)單的呼吸道過(guò)敏原（如狗、貓、蟑螂、塵螨和A.fumigatus）刺激，持續(xù)21～28 d，可以促進(jìn)嗜酸細(xì)胞主要在上皮細(xì)胞中浸潤(rùn)[10，18]。然而，如果通過(guò)腹腔注射OVA使小鼠致敏，然后通過(guò)呼吸道接觸OVA 14 d，可以發(fā)現(xiàn)嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)的趨勢(shì)更深，大部分嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)到黏膜和黏膜下層[19]。為了支持以前的研究結(jié)果，筆者還觀察了從21 d開(kāi)始食管黏膜和黏膜下層的嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)情況。正如預(yù)期的那樣，與黏膜中的嗜酸細(xì)胞相比，在OVA刺激的后期，嗜酸細(xì)胞出現(xiàn)在食管肌層中，表明長(zhǎng)時(shí)間的OVA治療有利于食管壁中嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)的加深。這可能是由于第一次致敏促進(jìn)了特異性T和B細(xì)胞反應(yīng)，以及隨后的過(guò)敏性發(fā)展[19]。

筆者還發(fā)現(xiàn)食管壁中嗜酸細(xì)胞的數(shù)量隨著OVA暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。然而，與以前的研究相反，本研究中的增加曲線不是已往的“S”形或倒“V”形[18，20]，而是線性的。這可能與所采用的方案不同有關(guān)，也可能與本研究中治療時(shí)間不夠長(zhǎng)以達(dá)到嗜酸性粒細(xì)胞的峰值有關(guān)。為了弄清嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)的動(dòng)力學(xué)，今后應(yīng)進(jìn)一步延長(zhǎng)OVA治療時(shí)間，同時(shí)增加停藥觀察期。

當(dāng)然，筆者的研究也有局限性。雖然食管肌層的嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)比較突出，但不能排除同一部位有其他炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的可能性。作為食管固有肌層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的小鼠模型，雖然符合AC的功能和病理特征，但也可能是嗜酸細(xì)胞性食管肌炎（EoEM），與AC有一定程度的區(qū)別[21-22]。盡管如此，這是唯一一項(xiàng)專門研究固有肌層中的嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)以及它與小鼠食管肌層神經(jīng)元和食管運(yùn)動(dòng)關(guān)系的研究。

綜上所述，本研究表明，長(zhǎng)期OVA刺激可能誘發(fā)食管固有肌層的嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)、肌層神經(jīng)元的喪失和食管的AC樣運(yùn)動(dòng)障礙。雖然還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，但本研究討論的方法有助于探索嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)與AC之間的關(guān)系，甚至有助于未來(lái)相應(yīng)的治療方案。