賀 麗，楊 平，田 良△

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院協(xié)和武漢紅十字會醫(yī)院/武漢市紅十字會醫(yī)院：1.泌尿外科；2.骨科，武漢 430015)

腎細胞癌(RCC)是全球第七大常見腫瘤，男性發(fā)病率高于女性，RCC發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)腫瘤中排第二位，且近年來發(fā)病率不斷升高，2018年全球約400 000人被診斷為RCC[1]。RCC組織類型包括透明細胞型(70%)、乳頭狀細胞癌 (10%～15%) 及嫌色細胞癌(5%) 。處于進展期的患者生存率不到10%[2]。RCC的治療方法包括手術(shù)、放化療和內(nèi)分泌治療，但療效仍不佳[3]。對早期RCC患者手術(shù)切除是可以治愈的。不幸的是，25%～30%患者在確診時就存在遠處轉(zhuǎn)移，且約40%患者手術(shù)切除后復(fù)發(fā)[4]。深入闡明RCC的發(fā)生及發(fā)展機制對提高RCC的診治水平極其重要。微RNA(miRNA)分子是一類長度為18～22 nt的短單鏈RNA，這類RNA不編碼蛋白，通過與靶基因的3′-UTR末端序列結(jié)合影響靶基因的表達[5]，進而調(diào)控包括細胞生長、組織發(fā)育、細胞增殖、分化、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[6]，在多種疾病尤其是腫瘤中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7]。miR-455家族基因定位于染色體9q32上，miR-455家族包括miR-455-3p與miR-455-5p成員，miR-455-3p與多種腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)[8-9]。相比之下，miR-455-5p 在腫瘤中的作用的研究較少見，通常認為其生物學(xué)功能與腫瘤類型有關(guān)[10]。在胃癌中miR-455-5p具有抑癌基因的功能[11]。但在口腔鱗狀細胞癌中miR-455-5p卻促癌基因的作用[12]。然而miR-455-5p在RCC細胞系中的表達、功能和作用機制尚不清楚。本研究探討了miR-455-5p對RCC細胞系增殖、凋亡及侵襲的影響，并闡明其機制。

1 材料與方法

1.1標本采集

收集2018年1月至2020年12月本院泌尿外科收治并接受RCC切除術(shù)的60例RCC及癌旁組織標本，其中男40例，女20例，平均年齡(59.3±6.2)歲。所有組織標本均保存于-80 ℃冰箱。納入標準：(1)患者一般情況可且接受RCC切除術(shù)；(2)經(jīng)病理檢查確診為RCC；(3)臨床病理資料齊全。排除標準：(1)肝、腎功能差，無法耐受手術(shù)者；(2)存在其他部位腫瘤；(3)臨床病理資料不全。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準并符合赫爾辛基宣言。

1.2主要儀器和試劑

正常腎上皮細胞系HREpiC，腎癌細胞系Caki-2、A498、786-O及Caki-1均由同濟醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系實驗室饋贈。于美國Cell signaling公司購買RAB18、GAPDH一抗，于美國Santa Cruz公司購買羊抗鼠IgG二抗。于美國Thermo Scientific公司購買BCA蛋白試劑盒、ECL試劑盒和LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑。于上海天根生物技術(shù)公司購買MTT增殖檢測試劑盒。于美國Invitrogen公司購買細胞侵襲小室試劑盒。廣州銳博生物科技有限公司負責設(shè)計及合成miR-455-5p過表達序列(miR-455-5p mimics)及陰性對照序列(Scramble)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組

將正常腎上皮細胞系HREpiC，Caki-2、A498、786-o及腎癌細胞系Caki-1置于10%胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中，并在 37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對Caki-2細胞系采用LipofectamineTM3000試劑盒分別轉(zhuǎn)染miR-455-5p mimics及Scramble序列，并分為miR-455-5p mimics組和Scramble組，轉(zhuǎn)染后進行轉(zhuǎn)染效率測定，并進行后續(xù)細胞增殖及侵襲實驗。

1.2.2定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

采用TRIzol試劑盒，依據(jù)說明書提取正常腎上皮細胞系HREpiC，腎癌細胞系Caki-2、A498、786-O及Caki-1，以及腎癌和癌旁組織中的總RNA，RNA濃度和純度分析采用紫外分光光度計測量，并進行反轉(zhuǎn)錄。每個標本設(shè)3個復(fù)孔，每個標本測定3次，以U6作為miR-455-5p內(nèi)參。使用2-ΔΔct法計算miR-455-5p相對表達水平。

1.2.3細胞增殖測定

細胞增殖能力測定采用MTT實驗，以5×106個細胞/孔將兩組細胞置于96孔板中，0、24、48、72、96 h加入10 μL MTT及90 μL DMEM培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)2 h，采用酶標儀測定490 nm處吸光度值(A)。

1.2.4細胞凋亡能力測定

采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)測定細胞凋亡能力。將兩組細胞經(jīng)胰酶消化懸浮后每組收集1～5×105細胞，加入Binding Buffer 500 μL以懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后加入5 μL Propidium Iodide混勻，在室溫、避光、反應(yīng)5～15 min后于1 h內(nèi)用流式細胞儀分析凋亡細胞比例，計算細胞凋亡率。

1.2.5細胞侵襲測定

采用Transwell實驗測定細胞侵襲能力，將兩組細胞以4×104個細胞/孔加入侵襲小室上室并加入200 μL DMEM培養(yǎng)基，侵襲小室下室放置含20% FBS DMEM培養(yǎng)基500 μL。經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h，將未穿膜的細胞和培養(yǎng)基擦去，洗滌3次后用多聚甲醛固定10 min。對穿膜的下室侵襲細胞用0.5% 結(jié)晶紫染色，計數(shù)分析在視野顯微鏡(×200)下進行。

1.2.6Western blot檢測

采用Western blot測定RAB18蛋白相對表達水平，裂解兩組細胞并提取總蛋白，蛋白濃度測定采用BCA法。采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行蛋白分離電泳，并轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上。將PVDF膜與RAB18(1∶300)、GAPDH(1∶300)一抗在4 ℃下孵育過夜，隨后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1∶400)，并室溫下孵育1 h。目標蛋白條帶的測定采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，掃描條帶灰度，采用Quantity One軟件計算灰度值。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.7miR-455-5p靶基因預(yù)測和驗證

miR-455-5p靶基因的預(yù)測采用Target scan軟件。miR-455-5p靶基因的驗證使用雙熒光素酶實驗，采用LipofectamineTM3000 試劑盒將 PmirGLO-RAB18-3′ UTR 野生型質(zhì)粒(Wt)、miR-455-5p mimics、pmirGLO-RAB18-3′ UTR突變型質(zhì)粒(Mut)共轉(zhuǎn)移至HEK293T 細胞中。熒光素酶活性用螢火蟲熒光素酶活性檢測試劑盒進行檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1miR-455-5p低表達于腎癌細胞系及RCC組織

miR-455-5p在正常腎上皮細胞系HREpiC中相對表達水平為1.08±0.06，在Caki-2、A498、786-O及Caki-1腎癌細胞系的相對表達水平分別為0.36±0.02、0.51±0.04、0.60±0.06及0.52±0.08。miR-455-5p在腎癌細胞系中的表達水平均明顯低于正常腎上皮細胞系HREpiC，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在RCC組織中表達水平為1.85±1.03，miR-455-5p在癌旁組織中表達水平為6.12±1.56。miR-455-5p在RCC組織中表達水平明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A：miR-455-5p在腎癌細胞系及正常腎上皮細胞系中的表達；B：miR-455-5p在RCC組織及癌旁組織中的表達；a:P<0.05。

2.2轉(zhuǎn)染miR-455-5p抑制Caki-2細胞增殖

miR-455-5p mimics組miR-455-5p相對表達水平為5.53±0.04，Scramble組miR-455-5p相對表達水平為1.03±0.02。miR-455-5p mimics組miR-455-5p相對表達水平明顯高于Scramble組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A。

miR-455-5p mimics組轉(zhuǎn)染24 h后A490 nm值(0.46±0.03)與Scramble組(0.45±0.02)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；miR-455-5p mimics組轉(zhuǎn)染48、72、93 h后A490 nm值(分別為0.63±0.13、0.92±0.21、1.32±0.17)均明顯小于Scramble組(分別為1.18±0.19、1.62±0.34、2.30±0.25)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2B。

A：miR-455-5p轉(zhuǎn)染效率測定；B：細胞增殖曲線；a:P<0.05。

2.3轉(zhuǎn)染miR-455-5p促進Caki-2細胞凋亡

miR-455-5p mimics組細胞凋亡率(13.2±1.6)%明顯高于Scramble組(3.7±0.3)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

A：流式細胞術(shù)檢測；B：細胞凋亡率；a:P<0.05。

2.4轉(zhuǎn)染miR-455-5p抑制Caki-2細胞侵襲

miR-455-5p mimics組侵襲細胞數(shù)[(92±17)個]明顯少于Scramble組[(377±23)個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

A：Transwell實驗(×200)；B：侵襲細胞數(shù);a:P<0.05。

2.5miR-455-5p靶向調(diào)控RAB18蛋白表達

miR-455-5p與RAB18 3′-UTR區(qū)序列可靶向結(jié)合，見圖5A。在Caki-2細胞系中轉(zhuǎn)染miR-455-5p mimics序列上調(diào)miR-455-5p表達，miR-455-5p mimics組RAB18蛋白表達水平明顯低于Scramble組，見圖5B。在RAB18野生型質(zhì)粒(RAB18-WT)中miR-455-5p mimics組熒光素酶活性明顯低于Scramble組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而在RAB18突變型質(zhì)粒(RAB18-MUT)中miR-455-5p mimics組與Scramble組熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5C。

A：miR-455-5p與RAB18 3′UTR5′區(qū)存在靶向結(jié)合序列；B：miR-455-5p轉(zhuǎn)染后對RAB18蛋白表達的影響；C：miR-455-5p與RAB18的靶向關(guān)系;a:P<0.05。

3 討 論

miRNA是腫瘤研究的熱點，依據(jù)與miRNA結(jié)合的靶基因功能不同，miRNA在不同的腫瘤中發(fā)揮抑癌或促癌的功能。在RCC中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個miRNA發(fā)揮著重要的作用，包括miR-141、miR-34a、miR-155等[13]。

miR-455家族編碼基因位于染色體9q32上，該區(qū)域是個脆性位點，容易發(fā)生雜合性缺失，這種情況多見于多種上皮鱗癌，如宮頸癌、肺癌和食管癌[14]。miR-455家族包括miR-455-3p與miR-455-5p成員。miR-455-3p與多種腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)。在結(jié)腸癌細胞系HCT116中miR-455-3p抑制細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[8]。在三陰性乳腺癌中miR-455-3p通過靶向調(diào)控EI24表達，促進細胞遷移和侵襲[9]。相比之下，miR-455-5p 的生物學(xué)功能與腫瘤組織類型有關(guān)，存在異質(zhì)性[10]。miR-455-5p在胃癌組織和細胞系中下調(diào)表達，且miR-455-5p可靶向RAB18抑制胃癌細胞增殖和遷移，扮演著抑癌基因的角色[11]。miR-455-5p在宮頸癌組織中呈低表達，并與患者預(yù)后不良相關(guān)，miR-455-5p可靶向調(diào)節(jié)S1PR1表達，進而抑制宮頸癌細胞系增殖和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌基因功能[15]。在食管鱗癌組織中miR-455-5p呈低表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化程度相關(guān)，過表達miR-455-5p可抑制食管癌細胞系Eca109細胞增殖、遷移及侵襲[16]。在膽管癌組織中miR-455-5p呈低表達，過表達miR-455-5p可抑制膽管癌細胞增殖、遷移及侵襲，并誘導(dǎo)凋亡，機制與調(diào)控MAPK、PI3K/AKT信號通路有關(guān)[17]。在前列腺癌中miR-455-5p過表達抑制前列腺癌細胞增殖，并通過靶向C-C基序趨化因子受體5抑制細胞增殖和腫瘤生長[18]。與此相反，miR-455-5p在惡性黑色素瘤及基底細胞癌中發(fā)揮促癌功能。如SHOSHAN等[19]報道m(xù)iR-455-5p在惡性黑色素瘤中高表達，且可下調(diào)細胞質(zhì)多聚體腺苷酸化元件結(jié)合蛋白1的表達，進而促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移。同樣，SAND等[20]報道m(xù)iR-455-5p在基底細胞癌中高表達，可能起促癌基因的作用。在口腔鱗狀細胞癌中轉(zhuǎn)化生長因子-β-SMAD 信號通路上調(diào)miR-455-5p表達并通過靶向重組人泛素結(jié)合酶E2-B(UBE2B)促進腫瘤細胞增殖[12]。

本研究在RCC組織及細胞系中進行研究發(fā)現(xiàn)，miR-455-5p在RCC組織及細胞系中呈低表達，與結(jié)腸癌[8]、三陰乳腺癌[9]、胃癌[11]、食管癌[16]、膽管癌[17]、前列腺癌[18]中的結(jié)果一致，但與惡性黑色素瘤[19]、基底細胞癌[20]、口腔鱗癌[12]結(jié)果相反，提示miR-455-5p可能在RCC中起抑癌基因的功能。本研究進一步分析了Caki-2細胞系轉(zhuǎn)染miR-455-5p mimics上調(diào)miR-455-5p的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-455-5p mimics組細胞增殖能力低于Scramble組，侵襲細胞數(shù)少于對照組Scramble，表明miR-455-5p可抑制RCC細胞增殖和侵襲，發(fā)揮抑癌基因的功能。

RAB18 是 RAB GTPase 家族成員之一，在胞吐和分泌過程中調(diào)節(jié)囊泡的轉(zhuǎn)運過程[21]。最近文獻報道RAB家族蛋白與腫瘤發(fā)生聯(lián)系密切[22-23]。在頭頸部鱗癌中作為促癌因子，RAB18高表達，并且通過STAT3 信號通路促進細胞增殖、侵襲及順鉑耐藥[24]。在肝細胞癌中RAB18的表達與患者預(yù)后不良相關(guān)，且RAB18可通過促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[25]。在胃癌中RAB18 通過調(diào)節(jié)線粒體功能和存活蛋白表達，促進胃癌細胞增殖和產(chǎn)生化療耐藥性[26]。在非小細胞癌中miR-30b/c通過靶向沉默RAB18表達可抑制細胞增殖,反之，上調(diào)RAB18促進細胞增殖[27]。表明RAB18在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起促癌基因功能。本研究通過雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn),miR-455-5p的靶基因為RAB18分子，且在細胞系中上調(diào)miR-455-5p表達后細胞增殖和侵襲受抑制,并促進細胞凋亡。其機制可能與miR-455-5p靶向下調(diào)促癌基因RAB18表達有關(guān)，即miR-455-5p通過靶向下調(diào)RAB18表達，進而抑制細胞增殖和侵襲，并促進細胞凋亡。

綜上所述，本研究主要在腎癌細胞系中探討了miR-455-5p對細胞增殖、侵襲及凋亡的影響，并初步探討了其可能的機制。miR-455-5p在RCC組織及細胞系中均呈低表達，且上調(diào)miR-455-5p表達可抑制RCC細胞增殖和侵襲，并促進凋亡，機制可能與miR-455-5p靶向下調(diào)RAB18蛋白表達有關(guān)。但本研究不可避免存在一定的不足：(1)miR-455-5p的表達與患者臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系尚未研究；(2)miR-455-5p與RCC術(shù)后患者預(yù)后的關(guān)系也未研究；(3)miR-455-5p在實驗動物體內(nèi)所扮演的功能也值得進一步研究，也是本研究后續(xù)的研究計劃。