趙文懿，楊中玉，孫曉涵，宋培軍，徐 靜△

(1.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院整形外科，安徽蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學院組織移植實驗室，安徽蚌埠 233000)

脂肪來源干細胞基質(zhì)膠(ECM/SVF-gel)是一種對脂肪進行簡單的物理機械處理后獲得的凝膠狀物質(zhì)，制作過程中無外源性物質(zhì)的添加，同時，含有高濃度的具有生物活性的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和血管基質(zhì)組分(stromal vascular fraction，SVF)[1]?；贑oleman脂肪的制作過程，ECM/SVF-gel只需在Coleman脂肪的基礎(chǔ)上再進行簡單的破碎和離心即可獲得，其制備過程中的破碎與離心步驟使脂肪組織中的成熟脂肪細胞被最大限度地破壞，從而獲得了富含脂肪來源干細胞(adipose derived stem cells，ADSCs)和ECM的混合物質(zhì)[2-3]。已有研究證實，ECM/SVF-gel可上調(diào)組織中生長因子——堿性或纖維生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達水平，促進大鼠缺血性皮瓣中血管再生[4]。本研究對ECM/SVF-gel與Coleman脂肪治療糖尿病大鼠創(chuàng)面的療效進行了對比，并對ECM/SVF-gel的作用機制進行了初步探討，旨在為臨床應用ECM/SVF-gel治療糖尿病導致的創(chuàng)面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物來源

糖尿病造模選用14只300～350 g的SD大鼠，雄性，8～9周齡；脂肪供體鼠選用5只350～400 g的SD大鼠，雌性，6～8周齡；實驗用鼠均購于山東省實驗動物中心。實驗過程中對動物的處置均符合動物倫理學標準。

1.1.2主要試劑

特級胎牛血清(FBS)購自澳洲CLARK公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/F12培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國HyClone公司；4%多聚甲醛、青霉素-鏈霉素雙抗均購自北京Biosharp公司，鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸、檸檬酸鈉均購自上海Yeason公司，4%多聚甲醛、石蠟、中性樹脂均購自北京Solarbio公司；無水乙醇、二甲苯、水合氯醛均購自上海Macklin公司，大鼠表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、bFGF、VEGF和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.3儀器及耗材

100、40 μm濾網(wǎng)，0.22 μm濾芯均購自美國Biologix公司，2.4 mm魯爾連接器購自黑龍江四海醫(yī)療，10 mL注射器購自上海KDL公司，超凈工作臺購自蚌埠新科凈化設(shè)備廠，手術(shù)器械購自河南美邦醫(yī)療器械，石蠟包埋機購自孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器公司，切片機(RM2245)購自德國LEICA公司，移液槍購自德國Eppendorf公司，高速離心機(Multifuge X1R)、細胞培養(yǎng)箱均購自美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1Coleman脂肪和ECM/SVF-gel的制備

將體重350～400 g的SD大鼠麻醉后脫毛，用聚維酮碘消毒；無菌手術(shù)器械取大鼠腹股溝處脂肪，用無菌PBS反復沖洗，去除血液；移入無菌培養(yǎng)皿中，反復用剪刀剪切脂肪組織約3 min；加入適量無菌PBS，672 r/min離心3 min，將位于底層的水及結(jié)締組織去除，位于中層的脂肪組織即為所需的Coleman脂肪。離心去水的脂肪組織按密度大小分為高、低密度脂肪組織，位于離心管中上2/3的組織為低密度脂肪組織，位于下1/3的組織為高密度脂肪組織。以內(nèi)徑為2.4 mm的魯爾連接器連接2個10 mL注射器，將低密度脂肪組織置入，推注速度保持恒定(10 mL/s)，反復推注約2 min，通過機械方式使脂肪乳糜化；推注完成后脂肪呈乳糜狀；將高密度脂肪與推注完成后的低密度脂肪混合均勻，置于以內(nèi)徑為2.4 mm的魯爾連接器連接的2個10 mL注射器中，再次互相推注約30 s后1 120 r/min離心3 min，可見上層有大量的油，底層則可見有少量的水，以上二者皆棄去，離心管中余下的位于油層之下的凝膠樣物質(zhì)即為所需的ECM/SVF-gel[5-6]，見圖1。

左：Coleman脂肪；右：ECM/SVF-gel；肉眼觀察，與Coleman脂肪比較，ECM/SVF-gel質(zhì)地更加細膩、光滑。

1.2.2生長因子的收集

SVF細胞數(shù)以5×105為基線，準備相應質(zhì)量的ECM/SVF-gel及Coleman脂肪。將計算好相應質(zhì)量的2種不同的脂肪組織制品分別移入T25培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶中各添加5 mL完全培養(yǎng)基(含10% FBS)，將培養(yǎng)瓶置于含有5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h后為獲得條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)以DMEM/F12培養(yǎng)基(無FBS)將培養(yǎng)瓶中的完全培養(yǎng)基全部替換，培養(yǎng)24 h；24 h后分別收集培養(yǎng)瓶中的上清液，依次通過100、40 μm濾網(wǎng)，去除細胞及組織碎片；收集濾液，168 r/min離心5 min，離心后的上清液通過0.22 μm濾芯過濾除菌；移入凍存管中，置于-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3建立糖尿病大鼠模型

選取體重300～350 g的SD雄性大鼠14只，適應性飼養(yǎng)1周后禁食不禁飲，12 h后按55 mg/kg一次性腹腔注射1%的STZ溶液。注射1周后檢測大鼠血糖變化?？崭寡浅^16.8 mmol/L，發(fā)生多飲、多尿、多食、體重減輕等即可確定為建模成功。

1.2.4建立大鼠創(chuàng)面模型及條件培養(yǎng)基的干預

取建模成功的糖尿病大鼠(14只)采用戊巴比妥腹腔麻醉，以直徑10 mm的組織活檢器在大鼠背部制作直徑10 mm的全層皮膚缺損創(chuàng)面，每只大鼠2個創(chuàng)面；預先制備直徑1 cm的環(huán)形硅膠片置于創(chuàng)面，再使用4-0尼龍線縫合4～6針，以防止創(chuàng)周皮膚在早期便嚴重皺縮，影響觀察，見圖2。

左：術(shù)后即刻；右：術(shù)后14 d，可見位于右側(cè)的注射ECM/SVF-gel-CM的創(chuàng)面，相比位于左側(cè)的注射Coleman-CM的創(chuàng)面，愈合情況更為良好，已近乎完全愈合。

將14只大鼠分為A組(Coleman-CM)和B組(ECM/SVF-gel-CM)，將每只大鼠背部的2個創(chuàng)面按隨機法進行隨機分配，做好標記，2個創(chuàng)面分別注射A組(Coleman-CM)與B組(ECM/SVF-gel-CM)，每個創(chuàng)面注射100 μL，其中20 μL注射在創(chuàng)面基底，80 μL注射在創(chuàng)面周圍(4個點，每個點20 μL)；注射完畢后以無菌敷貼包裹創(chuàng)面，單籠喂養(yǎng)。術(shù)后連續(xù)2 d給予青霉素皮下注射，預防感染。

1.2.5觀察指標

1.2.5.1大體觀察

對14只大鼠術(shù)后即刻，3、7 d,以及10只大鼠術(shù)后10、14 d進行創(chuàng)面觀察和拍照，對比觀察創(chuàng)面愈合情況。

1.2.5.2創(chuàng)面愈合率

通過Image J軟件測量14只大鼠背部創(chuàng)面術(shù)后即刻，3、7 d,以及10只大鼠術(shù)后10、14 d創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合率=(創(chuàng)面初始面積-剩余創(chuàng)面面積)/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.2.5.3免疫組織化學染色觀察

術(shù)后7 d隨機挑選4只大鼠處死，術(shù)后14 d處死剩余10只大鼠，取創(chuàng)面皮膚組織制作切片，進行CD34免疫組織化學染色，鏡下觀察新生血管形成情況，陽性染色顯示為棕色，通過Image J軟件將各組樣本的陽性染色結(jié)果進行分離，并分析比較各組陽性染色比例。

1.2.5.4生長因子檢測

按照ELISA試劑盒的實驗步驟，檢測2種條件培養(yǎng)基(CMs)中的4種生長因子——EGF、bFGF、VEGF、TGF-β1表達水平。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1創(chuàng)面愈合率

B組創(chuàng)面愈合率均明顯高于A組，A組術(shù)后14 d創(chuàng)面愈合率為(82.04±3.84)%，B組創(chuàng)面愈合率則達到了(95.54±3.57)%，創(chuàng)面基本已全部上皮化。兩組術(shù)后3、7、10、14 d創(chuàng)面愈合率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3、表1。

圖3 兩組糖尿病鼠的創(chuàng)面各個時間點的代表照片

表1 不同時間點各組創(chuàng)面愈合率比較

2.2CD34免疫組織化學染色結(jié)果

兩組術(shù)后7 d創(chuàng)面內(nèi)均出現(xiàn)了新生血管，B組陽性染色比例為19.304%，A組為14.276%，B組新生血管生成較A組多；兩組術(shù)后14 d新生血管數(shù)量均有不同程度增長，B組陽性染色比例為32.726%，A組為26.155%，B組術(shù)后7、14 d新生血管生成均較A組多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 創(chuàng)面組織CD34免疫組織化學染色圖(×20)

2.3生長因子表達水平

A組EGF、bFGF、VEGF、TGF-β1表達水平均低于B組。其中EGF、bFGF、VEGF表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TGF-β1表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 ELISA檢測2組CMs中生長因子水平

3 討 論

以Coleman脂肪的制作過程為基礎(chǔ)，ECM/SVF-gel是在經(jīng)過后續(xù)的機械破碎和離心后獲得的含有高度濃縮的、具生物活性且近似于生理狀態(tài)下的ECM、SVF和ADSCs的凝膠狀的可注射材料，相比于含有相同SVF細胞數(shù)的Coleman脂肪，ECM/SVF-gel中濃縮的ECM(膠原蛋白、纖維蛋白和彈性蛋白等)更多，從而起到了為ADSCs提供適宜生存的微環(huán)境的作用，同時，通過調(diào)節(jié)細胞行為，促進細胞增殖，激活細胞的分化潛能，促進更多的生長因子分泌，并免于巨噬細胞的吞噬[1-3]。

在本研究進行ELISA檢測的4種生長因子中，EGF可促進上皮細胞、成纖維細胞增殖；bFGF可促進血管生成；VEGF可促進血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖，并促進新生血管形成；TGF-β1在促進各類ECM(如膠原蛋白、纖粘連蛋白等)表達的同時，也能夠抑制降解[7-11]。

本研究應用的條件培養(yǎng)基(CM)本質(zhì)即為干細胞的旁分泌產(chǎn)物，其中包括各種生長因子、免疫因子和外泌體。經(jīng)檢測上述4種生長因子在Coleman-CM和ECM/SVF-gel-CM中均有不同程度的表達，ECM/SVF-gel-CM中EGF、bFGF、VEGF水平均明顯高于Coleman-CM，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，證實了相較于Coleman脂肪，ECM/SVF-gel能分泌更多的生長因子——EGF、bFGF和VEGF，并以旁分泌的途徑作用于創(chuàng)面；雖然ECM/SVF-gel-CM中TGF-β1水平仍高于Coleman-CM，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造成該生長因子水平差異無統(tǒng)計學意義的原因可能為檢測時樣品在低溫冷凍中儲存時間過長，造成了一定數(shù)量的生長因子失活或是多次檢測過程中反復的冷凍和復蘇導致樣品中生長因子的失活[12]。

本研究將等量的2種CM分別注射至糖尿病大鼠背部創(chuàng)面，B組術(shù)后3、7、10、14 d創(chuàng)面愈合率均明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A組術(shù)后14 d，創(chuàng)面愈合率為(82.04±3.84)%，B組創(chuàng)面愈合率則達到了(95.54±3.57)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，符合ELISA檢測的結(jié)果。同時，CD34免疫組織化學染色結(jié)果顯示，與A組比較，B組術(shù)后7、14 d陽性染色結(jié)果更多，即B組新生血管數(shù)量在術(shù)后7、14 d均比A組更多，同樣符合ELISA檢測的結(jié)果。

綜上所述，與Coleman脂肪比較，ECM/SVF-gel促進糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的效果更突出，其作用機制為通過旁分泌途徑分泌更高濃度的生長因子(EGF、bFGF、VEGF等)作用于創(chuàng)面，促進創(chuàng)面部位生成新生血管，加速創(chuàng)面愈合；ECM/SVF-gel作為一種經(jīng)機械破碎、濃縮自Coleman脂肪的制品具有局部注射用于修復慢性創(chuàng)面的潛力，為今后臨床應用ECM/SVF-gel治療各類創(chuàng)面，尤其是糖尿病患者肢體創(chuàng)面等難愈性創(chuàng)面提供了新的思路。