陳萌萌 范志宇 胡波 宋艷華 魏后軍 仇汝龍 朱偉峰 徐為中 王芳

摘要：通過(guò)家兔體內(nèi)感染兔出血癥病毒（RHDV）后發(fā)現(xiàn)體內(nèi)干擾素-β（Interferon-β，IFN-β）基因表達(dá)水平明顯降低。為體外研究RHDV感染宿主后IFN-β啟動(dòng)子的調(diào)控機(jī)制，首先以家兔肝細(xì)胞總cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增IFN-β基因啟動(dòng)子區(qū)的序列，經(jīng)測(cè)序確定全長(zhǎng)為550 bp;預(yù)測(cè)軟件分析，與人源IFN-β基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄上調(diào)區(qū)域（positive regulation domain，PRD）高度同源;隨后將啟動(dòng)子全長(zhǎng)和一系列轉(zhuǎn)錄元件克隆至pGL6-Basic熒光素酶表達(dá)載體中，成功構(gòu)建重組體報(bào)告基因質(zhì)粒后，瞬轉(zhuǎn)RK-13細(xì)胞，利用試劑盒檢測(cè)熒光素酶的相對(duì)活性。結(jié)果顯示，克隆的IFN-β基因啟動(dòng)子區(qū)和AP-1、IRF3、NF-κB和IRF7等轉(zhuǎn)錄元件具有顯著的活性，為研究兔出血癥病毒對(duì)宿主 IFN-β 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了有效的工具。

關(guān)鍵詞：家兔;兔出血癥病毒;IFN-β基因;啟動(dòng)子;熒光素酶;轉(zhuǎn)錄調(diào)控

中圖分類號(hào)： S858.291 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0078-03

干擾素是一類在機(jī)體內(nèi)廣泛存在的糖蛋白，可分為Ⅰ型（IFN-α、IFN-β和ω）和Ⅱ型（IFN-γ）干擾素[1-2]。干擾素-β （interferon-β，IFN-β）是由干擾素誘生劑（微生物和病毒等）刺激生物成纖維細(xì)胞和白細(xì)胞等產(chǎn)生的高活性多功能蛋白，具有多種生物活性，如抗病毒和免疫調(diào)節(jié)[1-4]等。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，多種病毒感染機(jī)體后能夠采取不同的措施顯著改變IFN-β的表達(dá)水平，從而逃避早期由IFN-β介導(dǎo)的抗病毒天然免疫反應(yīng)，如在豬偽狂犬病毒[5]、圓環(huán)病毒[6]和豬繁殖與呼吸綜合征病毒[7]的感染導(dǎo)致的疾病中。目前，對(duì)兔天然免疫系統(tǒng)了解很少，而且缺乏有效的檢測(cè)天然免疫分子的工具，這嚴(yán)重阻礙了病毒與兔宿主相互作用的深入研究。

筆者發(fā)現(xiàn)RHDV感染家兔能夠顯著下調(diào)兔體內(nèi)IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄水平，推測(cè)IFN-β基因水平的降低可能與該病毒的致病性相關(guān)。為了分析兔源IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，筆者所在課題組以家兔IFN-β為研究對(duì)象，通過(guò)制備一系列含有IFN-β基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄元件的重組體報(bào)告基因質(zhì)粒，采用雙報(bào)告基因系統(tǒng)鑒定IFN-β和轉(zhuǎn)錄元件的轉(zhuǎn)錄活性，為深入揭示啟動(dòng)子功能研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究RHDV調(diào)控IFN-β基因的表達(dá)提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

兔腎RK-13細(xì)胞株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。胎牛血清（FBS）和青鏈霉素溶液均購(gòu)自美國(guó)GIBCO BRL公司。Lip3000脂質(zhì)體以及無(wú)血清培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司。真核表達(dá)載體pcDNA3.1-6his購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。pGL6-Basic螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告載體以及pTL-TK海參熒光素酶的內(nèi)參載體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RHDV攻毒 選用3月齡健康易感新西蘭兔，分攻毒組和對(duì)照組，每組5只。攻毒用毒種為兔出血癥病毒皖阜株肝毒，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。1 mL病毒（含量 105 LD50/mL，LD50為半數(shù)致死劑量）為攻毒劑量;等量的PBS（磷酸緩沖鹽溶液）作為對(duì)照。

1.2.2 IFN-β和病毒基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)兔IFN-β基因啟動(dòng)子和RHDV基因的引物（表1），送上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。稱取 0.5 g 肝臟組織勻漿提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。體系：SYBR Mix 10 μL，PCR上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL，共 20 μL。程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 IFN-β基因啟動(dòng)子的克隆 采用苯酚-氯仿法提取健康兔肝臟組織DNA，用超微量核酸分析儀檢測(cè)DNA的完整性、純度和濃度。以IFNb-F：5′-ATGATCAACAGGTGTATCCTTCAA-3′和IFNb-R：5′-TTAGAGGTAATCTATGAGCATGATGAT-3′為引物，以兔肝組織基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增兔IFN-β啟動(dòng)子區(qū)550 bp序列，體系：50 μL反應(yīng)體系含模板2 ng，上、下游引物（10 μmol）各1 μL，其他試劑按使用說(shuō)明加入。程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的片段，與pMD18-T載體4 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌，液體LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 IFN-β基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué) 利用NCBI中的Blast同源性比對(duì)兔和人IFN-β基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄上調(diào)區(qū)域PRD序列;通過(guò)Promoter 2.0 Prediction軟件分析 IFN-β 基因的啟動(dòng)子序列。

1.2.5 IFN-β啟動(dòng)子和順式作用元件報(bào)告基因重組體的構(gòu)建 以重組IFN-β啟動(dòng)子載體為模板，采用PCR方法克隆IFN-β基因啟動(dòng)子，雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切片段后連接到pGL6-Basic載體內(nèi)，構(gòu)建含IFN-β基因啟動(dòng)子序列的重組質(zhì)粒pIFN-β-Luc并進(jìn)一步雙酶切和測(cè)序鑒定。另外，由公司合成了IRF-3和NF-κB結(jié)合位點(diǎn)序列，并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pIRF-3-Luc和pNF-κB-Luc。

1.2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 在試驗(yàn)前24 h，將兔腎細(xì)胞RK-13接種于24孔板，待細(xì)胞達(dá)80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑lip3000按試劑說(shuō)明書(shū)操作，轉(zhuǎn)染 RK-13 細(xì)胞。試驗(yàn)設(shè)轉(zhuǎn)染pGL6-Basic載體組（對(duì)照組）和pGL6-IFN-β啟動(dòng)子等陽(yáng)性載體組（試驗(yàn)組），每組3個(gè)重復(fù)，在24孔板中共轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒（pRL-TK）與報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞。

1.2.7 熒光素酶活性測(cè)定 在轉(zhuǎn)染24 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗3次。每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞20 min后，取25 μL裂解液加入96孔白板，然后按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒上的說(shuō)明書(shū)操作，在微孔板發(fā)光分析儀上檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性（pGL6）和海參熒光素酶活性（pRL-TK）。以螢火蟲(chóng)和海參熒光素酶活性的比值即為相對(duì)熒光強(qiáng)度（relative luciferase activity，簡(jiǎn)稱RAL）來(lái)指示試驗(yàn)各組的轉(zhuǎn)錄活性。計(jì)算各組熒光素酶的相對(duì)熒光強(qiáng)度RAL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法t檢驗(yàn)（α=0.05），數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織病毒和IFN-β mRNA水平測(cè)定

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，兔出血癥病毒感染兔體肝臟組織中病毒基因相對(duì)表達(dá)量快速上升（圖1-A）;同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在病毒感染48 h以后IFN-β mRNA水平明顯降低（圖1-B）。

2.2 PCR擴(kuò)增IFN-β基因啟動(dòng)子序列

設(shè)計(jì)合成引物以兔肝組織提取的DNA為模板擴(kuò)增兔IFN-β基因5′UTR區(qū)，PCR擴(kuò)增出約550 bp特異性目的片段（圖2），將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒后經(jīng)雙酶切鑒定，最后進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序表明，PCR擴(kuò)增兔IFN-β基因啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度為550 bp。

2.3 IFN-β基因啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

在線預(yù)測(cè)軟件分析表明，IFN-β基因啟動(dòng)子的ISRE包含4個(gè)轉(zhuǎn)錄上調(diào)區(qū)域（positive regulation domain，PRD）分別是Ⅰ～Ⅳ區(qū)（圖3-A）;此序列包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（+1）上游500 bp，具有典型的真核生物啟動(dòng)IFN-β基因啟動(dòng)子具有AP-1、IRF3、IRF7、NF-κB和TATA-box等典型的真核生物啟動(dòng)子元件[10]（圖3-A）。Blast序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增得到的IFN-β基因PRD與人源IFN-β基因啟動(dòng)子PRD序列相似性達(dá)98%以上（圖3-B）。

2.4 重組報(bào)告質(zhì)粒的的構(gòu)建和活性鑒定

以攜帶有IFN-β啟動(dòng)子序列的pMD18-T載體為模板，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，經(jīng)雙酶切后與酶切的pGL6-Basic載體4 ℃連接，成功構(gòu)建啟動(dòng)子報(bào)告基因載體（pIFN-β-Luc），另外構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的熒光素酶報(bào)告基因載體（pIRF3-Luc和pNF-κB-Luc），經(jīng)測(cè)序正確。

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pIFN-β-Luc、pIRF3-Luc和 pNF-κB-Luc分別轉(zhuǎn)染至RK-13細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒（pRL-TK），通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的相對(duì)活性來(lái)反映啟動(dòng)子和順式作用元件的活性，分別設(shè)陰性和陽(yáng)性polyI：C處理組。熒光素酶活性分析表明，與轉(zhuǎn)染pGL6-Basic對(duì)照組相比，polyI：C能明顯誘導(dǎo)兔IFN-β基因啟動(dòng)子和順式作用元件IRF3和NF-κB相對(duì)熒光素酶活性（圖4）， 由此說(shuō)明成功構(gòu)建了報(bào)告基因重組體。

3 討論

Ⅰ型干擾素是由病毒直接刺激被感染細(xì)胞所轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的抵御病毒感染的第一防線，為了逃避宿主的免疫反應(yīng)，人類乳頭狀病毒[5]、EB病毒[8]、埃博拉病毒[9]、丙肝病毒[10]等病毒均可通過(guò)其編碼的病毒蛋白抑制干擾素順式作用元件的活性從而抑制IFN-β的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，在兔體感染兔出血癥病毒后，會(huì)顯著下調(diào)IFN-β基因的表達(dá)量，這也許與兔出血癥病毒的致病性密切相關(guān)。然而目前對(duì)兔天然免疫系統(tǒng)的研究很少，缺乏有效的研究工具。

本研究成功獲得了IFN-β的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游550 bp啟動(dòng)子序列，將兔IFN-β啟動(dòng)子及IRF3等順式作用元件亞克隆進(jìn)pGL6-Basic中，通過(guò)熒光素酶的表達(dá)活性來(lái)間接表明兔IFN-β基因啟動(dòng)子和順式作用元件在RK13細(xì)胞中的活性，為研究IFN-β轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游啟動(dòng)子的生物學(xué)活性提供了依據(jù)。預(yù)測(cè)軟件分析出IFN-β的啟動(dòng)子含AP-1、IRF3、IRF7和NF-κB等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，暗示IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。同時(shí)，同源性分析發(fā)現(xiàn)兔IFN-β基因啟動(dòng)子與人源IFN-β基因啟動(dòng)子[11]序列高度相似，尤其是IRF3和NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，這進(jìn)一步說(shuō)明本試驗(yàn)克隆序列的正確性。然而，具體哪些轉(zhuǎn)錄因子影響IFN-β的轉(zhuǎn)錄活性，還需要對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行序列的缺失等試驗(yàn)來(lái)證實(shí)[12]。總之，本研究構(gòu)建了IFN-β啟動(dòng)子和順式作用元件的重組報(bào)告質(zhì)粒，并分析了IFN-β啟動(dòng)子區(qū)域含有的AP-1、IRF3、IRF7和NF-κB等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，為研究IFN-β轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及其啟動(dòng)子功能提供了有效工具，也為進(jìn)一步探究兔出血癥病毒的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2019-09-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31702274）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（編號(hào)：CARS-43-C-1）。

作者簡(jiǎn)介：陳萌萌（1987—），女，江蘇連云港人，博士，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。E-mail：moonchen2010@yeah.net。

通信作者：王 芳，博士，研究員，主要從事畜禽疫病防控及免疫機(jī)理研究。E-mail：rwangfang@126.com。