王強(qiáng)利 國(guó)海東 王奕 吳心語(yǔ) 趙亮 王瑩

摘要：目的 以CXCR4基因啟動(dòng)子為靶點(diǎn)，建立促干細(xì)胞歸巢藥物篩選細(xì)胞模型，并對(duì)中藥單體進(jìn)行篩選。方法 將人CXCR4基因啟動(dòng)子序列（279 bp）插入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL4.17-Basic中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL4.17-CXCR4，與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)驗(yàn)證CXCR4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性后，單細(xì)胞克隆培養(yǎng)以獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并用于候選中藥單體1～10的篩選，最后應(yīng)用Western blot驗(yàn)證所篩選出的中藥單體促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）中CXCR4表達(dá)的作用。結(jié)果 成功建立藥物篩選細(xì)胞模型，篩選出候選單體6提高CXCR4啟動(dòng)子活性的作用最強(qiáng)，Western blot結(jié)果證實(shí)候選單體6可明顯促進(jìn)MSCs中CXCR4的表達(dá)。結(jié)論 本研究建立的藥物篩選細(xì)胞模型能實(shí)現(xiàn)對(duì)潛在促進(jìn)干細(xì)胞歸巢中藥有效成分的高通量篩選。

關(guān)鍵詞：心肌梗死；干細(xì)胞移植；CXCR4/SDF-1軸；熒光素酶報(bào)告基因；細(xì)胞模型

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.012

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）11-0052-05

Abstract： Objective To establish a cell model targeting the CXCR4 gene promoter to screen of drugs potentially promoting the stem cell homing， and to screen the monomers of traditional Chinese medicine. Methods The human CXCR4 gene promoter sequence （279 bp） was inserted into the luciferase reporter vector pGL4.17-Basic to construct the recombinant plasmid pGL4.17-CXCR4， which was co-transfected with the internal reference plasmid pRL-TK into 293 cells. After verifying transcriptional activity of CXCR4 promoter， single cell clones were cultured to obtain a stable transfectant cell line and used for screening of candidate Chinese herbal monomer （1 to 10）. Finally， Western blot was used to verify the effect of the selected Chinese herbal monomer on the expression of CXCR4 in MSCs. Results The drug screening cell model was successfully established and the candidate monomer 6 was screened out because of the strongest effect on enhancing CXCR4 promoter activity. Western blot results verified that the candidate monomer 6 could promoted the expression of CXCR4 of MSCs. Conclusion The drug screening cell model established in this study was able to achieve high-throughput screening for potentially promoting the stem cell homing Chinese herbal monomer.

Keywords： myocardial infarction； stem cell transplantation； CXCR4/SDF-1 axis； luciferase reporter gene； cell model

心肌梗死（myocardial infarction，MI）后進(jìn)行性心力衰竭是現(xiàn)代心臟病學(xué)的巨大挑戰(zhàn)。通過(guò)移植自體或異體間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell， MSCs）能增強(qiáng)心臟功能，縮小梗死面積，延緩心衰進(jìn)程[1]。然而，移植后MSCs較低的心臟留存率嚴(yán)重影響了其治療效果。研究顯示，靜脈注射后僅有2%的干細(xì)胞歸巢至心臟，冠脈注射為15%，直接注射到心肌內(nèi)僅有11%的留存率，大部分細(xì)胞分散在肺、肝和脾[2]。因此，促進(jìn)移植后更多的干細(xì)胞向MI區(qū)歸巢是增強(qiáng)MSCs治療MI作用的關(guān)鍵。CXC趨化因子受體4[chemokine（C-X-C motif） receptor 4，CXCR4]和其配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）在MSCs歸巢中發(fā)揮主要作用[3]。CXCR4是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，通過(guò)與SDF-1特異性結(jié)合介導(dǎo)MSCs遷移、增殖和分化[4]。研究發(fā)現(xiàn)，提高M(jìn)SCs表達(dá)CXCR4水平能增強(qiáng)細(xì)胞遷移和向MI區(qū)域歸巢的能力[5]，使用CXCR4阻斷劑AMD3100可明顯抑制干細(xì)胞向MI區(qū)域歸巢，使歸巢的細(xì)胞數(shù)量顯著減少[6]。因此，以CXCR4表達(dá)水平為考察對(duì)象，篩選能促進(jìn)MSCs歸巢中藥單體，對(duì)于增強(qiáng)MSCs的治療作用和闡明中藥治療心血管疾病的機(jī)制都具有十分重要的意義。據(jù)此，本研究構(gòu)建了含CXCR4啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的藥物高通量篩選模型，并驗(yàn)證該細(xì)胞模型的可靠性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（滬）2014-0008。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，自由攝食飲水。

1.2 細(xì)胞株

293人胚腎上皮細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.3 藥物

人參皂苷Rb1和10種候選中藥單體均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。

1.4 主要試劑與儀器

熒光素酶報(bào)告載體pGL4.17、海腎熒光素質(zhì)粒pRL-TK，優(yōu)寶生物；限制性內(nèi)切酶Xhol、Hind Ⅲ和T4 DNA連接酶，東洋紡（上海）生物科技有限公司；SuperFectin Ⅱ脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，上海普飛生物技術(shù)有限公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、普通質(zhì)粒小提試劑盒、胰蛋白胨、瓊脂糖及酵母提取物，天根生化試劑有限公司；G418、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1），上海翊圣生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，Promega公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素、細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板，Corning公司；兔抗人多克隆、抗體GAPDH、CXCR4和HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，Proteintech公司。酶標(biāo)儀（Synergy 2，BioTek公司），熒光活體成像系統(tǒng)（Lumina XR，PerkinElmer公司），化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（Tanon 5200，天能）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CXCR4啟動(dòng)子的合成

參考Wegner S A等[7]報(bào)道CXCR4啟動(dòng)子DNA，設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)序列，標(biāo)記為CXCR4-F/R，5'端引入酶切位點(diǎn)Xhol，3'端引入酶切位點(diǎn)Hind Ⅲ。委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA序列如下。CXCR4-F：5'-CTCGAGTACCGACCACCCGCAAAC AGCAGGGTCCCCTGGGCTTCCCAAGCCGCGCACCTCTCCGCCCCGCCCCTGCGCCCTCCTTCCTCGCGTCTGCCCCTCTCCCCCACCCCGCCTTCTCCCTCCCCGCCCCAGCGGCGCATGCGCCGCGCTCGGAG

CGTGTTTTTATAAAAGTCCGGCCGCGGCCAGAAACTTCAGTTTGTTGGCTGCGGCAGCAGGTAGCAAAGTGACGCCGAGGGCCTGAGTGCTCCAGTAGCCACCGCATCTGGAGAACCAGCGGTTACCAAGCTT-3'；CXCR4-R：5'-AAGCTTGGTAACCGCTGGTTC TCCAGATGCGGTGGCTACTGGAGCACTCAGGCCCTCGGCGTCACTTTGCTACCTGCTGCCGCAGCCA ACAAACTGAAGTTTCTGGCCGCGGCCGGACTTTTATAAAAACACGCTCCGAGCGCGGCGCATGCGCCGCTGGGGCGGGGAGGGAGAAGGCGGGGTGGG

GGAGAGGGGCAGACGCGAGGAAGGAGGGCGCAGGGGCGGGGCGGAGAGGTGCGCGGCTTGGGAAGCCCAGGGGACCCTGCTGTTTGCGGGTGGTCG

GTACTCGAG-3'。

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

將合成的CXCR4啟動(dòng)子DNA和熒光素酶報(bào)告載體pGL4.17進(jìn)行Xhol和Hind Ⅲ雙酶切后，用T4 DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，雙酶切鑒定后獲得重組質(zhì)粒pGL4.17-CXCR4P，送至生工生物工程（上海）股份有限公司基因測(cè)序鑒定。將質(zhì)粒擴(kuò)增后，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無(wú)內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒，備用。見(jiàn)圖1。

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基37 ℃、5%CO2培養(yǎng)293細(xì)胞。將293細(xì)胞以5×105/mL密度接種于24孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合80%，按SuperFectin Ⅱ脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)，將重組質(zhì)粒pGL4.17- CXCR4P（200 ng/孔）和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK（60 ng/孔）共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞。同時(shí)，將質(zhì)粒pGL4.17和pRL-TK共轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照組。

2.4 啟動(dòng)子活性評(píng)價(jià)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)基，加入TGF-β1（2 ng/mL）誘導(dǎo)細(xì)胞24 h，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各孔熒光強(qiáng)度：PBS清洗細(xì)胞2次，各孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，室溫振搖裂解20 min徹底裂解細(xì)胞。取20 μL細(xì)胞裂解液上清，加入100 μL熒光素酶檢測(cè)試劑Ⅱ，酶標(biāo)儀設(shè)置為檢測(cè)化學(xué)發(fā)光，檢測(cè)方式為延遲2 s后讀取10 s內(nèi)熒光值，再加入海腎熒光素酶檢測(cè)試劑（Stop and Glo?），猝滅熒光后檢測(cè)海腎熒光素酶活性。熒光素酶活性=每組螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。將所測(cè)數(shù)值與陰性對(duì)照組熒光素酶活性值相比，轉(zhuǎn)染pGL4.17-CXCR4P組熒光素酶活性值為比較后的相對(duì)值。

2.5 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGL4.17-CXCR4P單克隆細(xì)胞株

將293細(xì)胞種植于6孔板，達(dá)到匯合90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后換液，加入終濃度為1 mg/mL的G418繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)處理10 d后，PBS清洗死亡細(xì)胞，胰酶消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞后吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞以1個(gè)/孔密度種植于96孔板。待細(xì)胞克隆形成后，將各個(gè)克隆的細(xì)胞以相同密度接種于96孔板，24 h后，加入D-luciferin至終質(zhì)量濃度60 μg/mL， 熒光活體成像系統(tǒng)拍攝，選擇信號(hào)最強(qiáng)的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并命名為293-CXCR4單克隆細(xì)胞。

2.6 藥物篩選

293-CXCR4單克隆細(xì)胞以1×104/mL鋪于96孔板，待細(xì)胞匯合度約90%～95%后無(wú)血清培養(yǎng)，加入候選中藥單體（8 μg/mL），參考Lan T H等[8]報(bào)道，將人參皂苷Rb1作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，不加入任何藥物作為陰性對(duì)照組。作用24 h 后，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性值。將所測(cè)得數(shù)值與陰性對(duì)照組的熒光素酶活性值相比，陽(yáng)性對(duì)照組和候選藥物組熒光素酶活性值為比較后的相對(duì)值。

2.7 異體間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)

應(yīng)用差速貼壁法分離骨髓中MSCs。將SD大鼠拉頸處死，用75%乙醇浸泡消毒8 min，分離雙側(cè)股骨和脛骨。剔除骨組織周?chē)M織后，暴露骨髓腔，用10 mL注射器抽取PBS沖洗骨髓腔，將帶有骨髓細(xì)胞的PBS收集于10 mL離心管，1000 r/min離心10 min。棄上清液，用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以5×105個(gè)/mL密度均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3日更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合70%～80%時(shí)傳代。取3～5代MSCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.8 Western blot檢測(cè)

將MSCs接種于6孔板，24 h后加入篩選出的中藥單體，處理24 h后收集MSCs，PBS清洗2遍，加RIPA裂解液，4 ℃裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，按Bradford法測(cè)定蛋白含量。加入5×loading buffer，于100 ℃變性5 min。將樣品加入10%SDS-PAGE膠樣品槽中，150 mV電泳50 min后，100 mV 轉(zhuǎn)膜1 h至硝酸纖維素膜。一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST反復(fù)洗膜后，HRP標(biāo)記二抗孵育1 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光試劑顯色，用凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖片。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒

瓊脂糖凝膠電泳成像顯示，Xhol和HindⅢ雙酶切產(chǎn)物在291 bp和5567 bp處有特異性條帶（見(jiàn)圖2），與理論值相一致。重組質(zhì)粒經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司基因測(cè)序鑒定后與CXCR4基因序列完全一致。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建pGL4.17-CXCR4P重組質(zhì)粒。

4.2 檢測(cè)CXCR4啟動(dòng)子活性

TGF-β1誘導(dǎo)24 h后，轉(zhuǎn)染pGL4.17-CXCR4P的熒光素酶活性相對(duì)值為19.7±0.32，見(jiàn)圖3。表明TGF-β1能增強(qiáng)CXCR4啟動(dòng)子活性，提示該細(xì)胞模型可用于篩選增強(qiáng)CXCR4表達(dá)的中藥單體。

4.3 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株

為了保證雙熒光素酶反應(yīng)靈敏，篩選結(jié)果均一，將轉(zhuǎn)染pGL4.17-CXCR4P的293細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，即293-CXCR4單克隆細(xì)胞株?；铙w成像熒光系統(tǒng)篩選結(jié)果顯示，3號(hào)單克隆細(xì)胞株光通量最強(qiáng)（見(jiàn)圖4），將其擴(kuò)增后液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

4.4 篩選中藥單體

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組比較，候選單體2、5、6、10組熒光素酶活性相對(duì)值明顯升高，候選單體3組CXCR4熒光素酶活性相對(duì)值明顯降低；候選單體6組熒光素酶活性相對(duì)值高于陽(yáng)性對(duì)照組。以上結(jié)果說(shuō)明，候選單體2、5、6、10能增強(qiáng)CXCR4啟動(dòng)子活性，其中候選單體6作用最強(qiáng)，見(jiàn)圖5。

4.5 促進(jìn)CXCR4表達(dá)初步驗(yàn)證

為驗(yàn)證本細(xì)胞模型的可靠性，本研究采用Western blot驗(yàn)證篩選出的單體6促進(jìn)MSCs表達(dá)CXCR4的作用。結(jié)果顯示，候選單體6能明顯增強(qiáng)MSCs中CXCR4表達(dá)，且具有劑量依賴性，見(jiàn)圖6。此結(jié)果證明該細(xì)胞篩選模型成功篩選出具有促進(jìn)干細(xì)胞CXCR4表達(dá)作用的中藥單體。

5 討論

CXCR4/SDF-1軸在干細(xì)胞歸巢中發(fā)揮重要作用。CXCR4表達(dá)于多種干細(xì)胞膜，能與SDF-1特異性結(jié)合，介導(dǎo)干細(xì)胞向SDF-1表達(dá)區(qū)域遷移和黏附[4]。急性MI后，缺血部位的心肌組織分泌SDF-1，募集干細(xì)胞歸巢以修復(fù)受損組織。用體外培養(yǎng)的MSCs移植治療MI是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，然而隨著傳代次數(shù)的增多，MSCs中CXCR4的表達(dá)水平顯著降低[9]，削弱其向受損心肌遷移的能力，嚴(yán)重降低了干細(xì)胞移植的治療效果，而通過(guò)基因修飾[10]等手段使MSCs過(guò)表達(dá)CXCR4則能明顯促進(jìn)其向SDF-1分布區(qū)域的遷移。因此，以CXCR4為靶點(diǎn)，篩選出具有上調(diào)干細(xì)胞CXCR4表達(dá)水平的中藥單體，可能具有促進(jìn)移植后干細(xì)胞歸巢的作用。

本研究將CXCR4啟動(dòng)子基因片段和帶有熒光素酶基因的報(bào)告載體重組得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)反映CXCR4啟動(dòng)子的活性強(qiáng)弱。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)單克隆培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達(dá)CXCR4啟動(dòng)子的單克隆細(xì)胞株，利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)篩選中藥單體。最后采用Western blot技術(shù)，初步證明篩選出的中藥單體對(duì)體外培養(yǎng)MSCs的CXCR4表達(dá)有顯著促進(jìn)作用，驗(yàn)證了該細(xì)胞篩選模型的可靠性。與傳統(tǒng)的篩選方法相比，應(yīng)用細(xì)胞模型篩選中藥單體，更接近體內(nèi)真實(shí)的生理環(huán)境，結(jié)果可靠性較高；同時(shí)，利用單克隆細(xì)胞株篩選具有結(jié)果均一性好、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)；此外，利用雙熒光素酶報(bào)告基因，檢測(cè)CXCR4啟動(dòng)子的活性，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)周期短，非常適用于中藥單體的高通量篩選。

CXCR4不僅介導(dǎo)干細(xì)胞歸巢，在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和艾滋病病毒感染T細(xì)胞的過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[11]。因此，本研究建立的細(xì)胞篩選平臺(tái)不僅可用于干細(xì)胞治療MI中藥單體的篩選，也可用于抗腫瘤和抗艾滋病中藥單體的篩選，為傳統(tǒng)中藥的現(xiàn)代研究提供方法學(xué)參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] SUZUKI E， FUJITA D， TAKAHASHI M， et al. Therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes in cardiovascular disease[J]. Adv Exp Med Biol，2017，998：179-185.

[2] FUKUSHIMA S， SAWA Y， SUZUKI K. Choice of cell-delivery route for successful cell transplantation therapy for the heart[J]. Future Cardiol，2013，9（2）：215-227.

[3] MARQUEZ-CURTIS L A， JANOWSKA-WIECZOREK A. Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis[J]. Biomed Res Int，2013，2013：561098.

[4] D?RING Y， PAWIG L， WEBER C， et al. The CXCL12/CXCR4 chemokine ligand/receptor axis in cardiovascular disease[J]. Front Physiol，2014，5：212.

[5] LI N， YANG Y， QIAN H Y， et al. Intravenous administration of atorvastatin-pretreated mesenchymal stem cells improves cardiac performance after acute myocardial infarction：role of CXCR4[J]. Am J Transl Res，2015，7（6）：1058-1070.

[6] ABBOTT J D， HUANG Y， LIU D， et al. Stromal cell-derived factor-1alpha plays a critical role in stem cell recruitment to the heart after myocardial infarction but is not sufficient to induce homing in the absence of injury[J]. Circulation，2004， 110（21）：3300-3305.

[7] WEGNER S A， EHRENBERG P K， CHANG G， et al. Genomic organization and functional characterization of the chemokine receptor CXCR4， a major entry co-receptor for human immunodeficiency virus type 1[J]. J Biol Chem，1998，273（8）：4754-4760.

[8] LAN T H， XU D P， HUANG M T， et al. Ginsenoside Rb1 prevents homocysteine-induced EPC dysfunction via VEGF/p38MAPK and SDF-1/CXCR4 activation[J]. Sci Rep，2017，7（1）：13061.

[9] LI Q， ZHANG A， TAO C， et al. The role of SDF-1-CXCR4/CXCR7 axis in biological behaviors of adipose tissue-derived mesenchymal stemcells in vitro[J]. Biochem Biophys Res Commun，2013，441（3）：675-680.

[10] NADERI-MESHKIN H， MATIN M M， HEIRANI-TABASI A， et al. Injectable hydrogel delivery plus preconditioning of mesenchymal stem cells：exploitation of SDF-1/CXCR4 axis towards enhancing the efficacyof stem cells' homing[J]. Cell Biol Int，2016，40（7）：730-741.

[11] PENG D， CAO B， ZHOU Y J， et al. The chemical diversity and structure-based evolution of non-peptide CXCR4 antagonists with diverse therapeutic potential[J]. Eur J Med Chem，2018，149：148- 169.