牛 樂，王延軍，岳江濤，梅江濤，賈曉康，戴先文

(1.西安市大興醫(yī)院骨科 710016；2.西安市長安醫(yī)院骨科 710016)

腰椎間盤突出癥坐骨神經(jīng)痛(lumbar disc herniation sciatica，LDHS)是腰椎間盤突出癥最常見的并發(fā)癥，LDHS表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)下肢放射痛，逐漸加重的放射痛長期折磨患者，部分患者甚至合并有焦慮和抑郁等精神、心理障礙。傳統(tǒng)的外科治療手段存在創(chuàng)傷大、費(fèi)用高及風(fēng)險(xiǎn)高等缺點(diǎn)[1-2]。LDHS患者的生活質(zhì)量受到了極大影響，因此進(jìn)一步揭示其發(fā)病機(jī)制，研制新型鎮(zhèn)痛藥物及探尋更有效的治療方法刻不容緩[3]。內(nèi)嗎啡肽(endomorphin，EM)包括內(nèi)嗎啡肽2 (endomorphin-2，EM2)和內(nèi)嗎啡肽1 (endomorphin-1，EM1)是嗎啡的內(nèi)源性相似物，其主要作用于μ型阿片受體(mu-opioid receptor，MOR)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，與相同量的嗎啡比能產(chǎn)生更強(qiáng)的止痛效果，而極少產(chǎn)生不良反應(yīng)[4-5]。以往有學(xué)者建立坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(spared nerve injury，SNI)神經(jīng)病理性痛小鼠模型，經(jīng)中樞側(cè)腦室或外周腳趾給藥后發(fā)現(xiàn)EM2和EM1能產(chǎn)生比嗎啡更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用[6]。脊髓背角是痛覺信號(hào)傳遞的初級(jí)中樞和第一道閘門，脊髓背角富含EM2，其來源于背根節(jié)神經(jīng)元的初級(jí)傳入纖維。脊髓背角EM2在神經(jīng)病理性痛狀態(tài)下痛覺信號(hào)傳遞的調(diào)控中扮演著極為重要的角色[7-8]。LDHS本身就是神經(jīng)病理性痛，但既往并無文獻(xiàn)報(bào)道脊髓EM2與LDHS的相關(guān)性。本研究以LDHS大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，綜合利用痛覺行為學(xué)、藥理行為學(xué)、生物化學(xué)及形態(tài)學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法探尋脊髓背角EM2表達(dá)量的變化及其與LDHS痛覺閾值的關(guān)聯(lián)性，從一個(gè)嶄新的角度解釋LDHS的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵循善待動(dòng)物的國際倫理準(zhǔn)則[9]。成年雄性SD大鼠(體重200 g左右)，來源于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物使用合格證號(hào):SYXK陜2021-008,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK陜2021-006)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組

大鼠隨機(jī)分為LDHS組、假處理組和對(duì)照組，LDHS組采用自體髓核移植法造模，假處理組采用相同的手術(shù)過程而未移植髓核,對(duì)照組為空白對(duì)照，未經(jīng)任何處理。

1.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

大鼠共計(jì)220只用于本實(shí)驗(yàn)。首先，對(duì)照組、假處理組和LDHS組每組各10只，共計(jì)30只用于痛覺行為學(xué)實(shí)驗(yàn)；然后LDHS組大鼠共計(jì)10只，在造模后15 d進(jìn)行行為藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，即經(jīng)脊柱鞘內(nèi)置管后注射不等劑量MOR拮抗劑——β-富納曲胺(β-funaltrexamine，β-FNA)、EM2、EM1或嗎啡，然后記錄痛覺閾值的變化；最后，180只用于生化實(shí)驗(yàn)和形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)，LDHS組、假處理組和對(duì)照組在造模前和造模后5、10、15、20、25 d共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(每組各10只/時(shí)間點(diǎn))，大鼠被處死后取出脊髓組織，利用免疫熒光組織化學(xué)染色和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測脊髓EM2表達(dá)水平的變化。

1.2.3建立動(dòng)物模型

LDHS模型的建立遵照既往造模方法[10-11]，即經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)淺麻醉大鼠，取俯臥位，以L4～L6為中心用聚維酮碘消毒皮膚3遍，取后正中縱行1.5 cm切口，逐層分離筋膜層和椎旁肌，顯露L5～L6關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)，咬除部分關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)及部分L5椎板，顯露L5背根神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)根。距肛門1 cm處斷尾并縫合傷口。依次切開尾椎髓核環(huán)，取出直徑3 mm髓核3個(gè)，將取出的髓核壓迫于L5神經(jīng)根側(cè)方，用無菌生理鹽水及稀釋聚維酮碘液反復(fù)沖洗傷口3遍，逐層縫合切口，最后外用紅霉素軟膏預(yù)防感染。

1.2.4行為藥理學(xué)

行為藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)只在LDHS組進(jìn)行，不在對(duì)照組和假處理組進(jìn)行。鞘內(nèi)置管：將2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)注射入腹腔淺麻醉大鼠，用聚維酮碘消毒局部皮膚3遍，于L4棘突取后正中縱形切口0.5 cm，鈍性分離淺筋膜及椎旁肌，顯露椎骨，用咬骨鉗咬除小部分黃韌帶及椎板，剪開硬脊膜，將PE-10細(xì)導(dǎo)管置入蛛網(wǎng)膜下腔，導(dǎo)管遠(yuǎn)端直達(dá)腰膨大處，見有腦脊液不斷流出即封閉導(dǎo)管外口，用無菌生理鹽水及稀釋聚維酮碘液反復(fù)沖洗傷口3遍，逐層縫合，最后外用紅霉素軟膏預(yù)防感染。若大鼠麻醉清醒后雙下肢無運(yùn)動(dòng)障礙，且鞘內(nèi)注入2%利多卡因后雙下肢5 s內(nèi)癱軟，即為鞘內(nèi)置管成功[12-13]。鞘內(nèi)給藥：LDHS組，鞘內(nèi)給予嗎啡(0.3、1.0、3.0 μg)、EM1(0.3、1.0、3.0 μg)、EM2 (0.3、1.0、3.0 μg)或β-FNA(3.0、10.0 μg)；溶劑對(duì)照組給予等量無菌生理鹽水，然后檢測痛覺閾值變化，同時(shí)計(jì)算不同劑量嗎啡、EM1或EM2的最大鎮(zhèn)痛百分比(%) =(給藥后最高閾值-給藥前閾值)/(造模前閾值-造模后最低閾值)×100%。

1.2.5痛覺閾值檢測

von Frey纖維絲是國際公認(rèn)的檢測痛覺閾值的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)儀器，本研究所使用von Frey纖維絲購自美國Stoelting公司，將大鼠放置于鐵絲網(wǎng)上，用有機(jī)玻璃透明罩約束其活動(dòng)范圍。大鼠先適應(yīng)15 min，然后用von Frey纖維絲刺戳足底，刺激的力量強(qiáng)度由小至大，以“g”表示。若出現(xiàn)縮足反射，則該強(qiáng)度被及時(shí)記錄，該強(qiáng)度重復(fù)測量10次，若出現(xiàn)5次以上縮足反射即認(rèn)為陽性反應(yīng)，出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最小強(qiáng)度即為痛覺閾值[14-15]。痛覺閾值單位為“g”。

1.2.6免疫熒光染色

將2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg) 注射入腹腔深麻醉大鼠，開胸顯露心臟，剪破右心耳徹底放血，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，先用PBS快速?zèng)_洗掉機(jī)體內(nèi)殘存的血液，再用4%多聚甲醛緩慢灌注固定，時(shí)長30 min。隨后取出脊髓腰膨大，將組織塊浸入含30%蔗糖的PBS，時(shí)長12 h。恒冷箱切片機(jī)切取25 μm厚的脊髓組織片，組織片被PBS漂洗3次后，用兔抗EM2 IgG(美國Chemicon公司,貨號(hào)AB5104,濃度為1∶200)室溫下孵育組織片12 h；組織片被PBS徹底漂洗后，紅色熒光素Cy5標(biāo)記的二抗室溫孵育組織片6 h；再次被PBS徹底漂洗后利用熒光顯微鏡攝片觀察。

1.2.7HPLC定量分析EM2表達(dá)水平

將2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg) 注射入腹腔深麻醉大鼠，迅速取出脊髓腰膨大，液氮凍存;將組織塊與裂解液混合，超聲裂解后超高速離心取上清液;Hypersil ODS 填料色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國Termo Electron公司);柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL;流動(dòng)相∶甲醇-0.1%三乙胺溶液(65∶35);流速為1.0 mL/min;檢測波長為570 nm[16]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1LDHS大鼠痛覺閾值顯著降低，形成了機(jī)械性異常疼痛

與對(duì)照組[(27.0±2.6)g]和假處理組[(27.1±1.5)g]比較，LDHS組在大鼠自體髓核移植后5 d痛覺閾值顯著降低[(11.2±2.5)g]，15 d時(shí)達(dá)到最低值[(5.0±1.8)g]，即機(jī)械性異常疼痛已顯著形成，并且15 d后機(jī)械性異常疼痛穩(wěn)固維持(n=10,P<0.05)；在造模前3組之間痛覺閾值無差異；對(duì)照組和假處理組痛覺閾值在造模后也無差異，見圖1、表1。

a:P<0.05,b:P<0.01，與對(duì)照組比較。

表1 各組造模前及造模后痛覺閾值比較

續(xù)表1 各組造模前及造模后痛覺閾值比較

2.2LDHS大鼠拮抗內(nèi)源性EM2加深疼痛，給予外源性EM2鎮(zhèn)痛作用明顯

在LDHS組痛覺閾值的最低點(diǎn)，即造模后15 d經(jīng)鞘內(nèi)給予β-FNA能夠明顯加深疼痛(圖2A);而鞘內(nèi)給予EM2能劑量依賴地產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用(圖2B)；EM1或嗎啡經(jīng)鞘內(nèi)給藥后均能劑量依賴性地鎮(zhèn)痛(圖2C、D);但在相同劑量情況下，EM2鎮(zhèn)痛作用比EM1和嗎啡強(qiáng)(圖2E)。

A:鞘內(nèi)給予β-FNA;B:鞘內(nèi)給予EM2;C:鞘內(nèi)給予EM1;D:鞘內(nèi)給予嗎啡;E:EM2、EM1、嗎啡鎮(zhèn)痛作用比較;a:P<0.05,b:P<0.01，與生理鹽水比較;c：P<0.05，與嗎啡比較；d：P<0.05，與EM1比較(E)。

2.3LDHS大鼠脊髓EM2顯著減少，與痛覺閾值的降低呈正相關(guān)

與假處理組[(77.6 ± 3.8)ng/mg]和對(duì)照組[(78.8 ± 4.6)ng/mg]比較，LDHS組脊髓EM2的表達(dá)在造模后5 d顯著減少[(47.8±5.3) ng/mg]，15 d時(shí)減少至最低水平[(18.9±3.6) ng/mg]，并在15 d一直維持此水平(n=10,P<0.05，圖3A)。LDHS組EM2的表達(dá)與痛覺閾值呈顯著正相關(guān) (r=0.966,P<0.001,圖3B)。與假處理組和對(duì)照組比較，LDHS組脊髓背角EM2染色密度顯著減低，EM2免疫熒光陽性結(jié)構(gòu)集中在脊髓背角淺層(圖3C)。

A:脊髓組織EM2表達(dá)量;B:LDHS組痛覺閾值與脊髓EM2表達(dá)水平的相關(guān)性;C:脊髓背角EM2免疫熒光染色標(biāo)尺=200 μm(×200);a：P<0.05,b:P<0.01，與對(duì)照組比較。

3 討 論

隨著現(xiàn)代社會(huì)久坐及彎腰負(fù)重工作方式的增多，腰椎間盤突出癥呈年輕化態(tài)勢(shì)且發(fā)病率逐年攀升。LDHS是腰椎間盤突出癥最常見和棘手的并發(fā)癥，其表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)下肢放射痛，逐漸加重的放射痛長期折磨患者，部分患者甚至伴隨有下肢肌力減退及大小便障礙[1-3]。盡管外科治療手段日益成熟，但相當(dāng)多的患者考慮到風(fēng)險(xiǎn)高及費(fèi)用昂貴，仍要求保守治療。針對(duì)LDHS的內(nèi)科鎮(zhèn)痛藥為弱阿片類或非甾體類藥物，這些藥物長期使用極易產(chǎn)生成癮性和耐受性，并且造成各種不良反應(yīng)[17-18]。LDHS患者的生活質(zhì)量受到了極大影響，因此進(jìn)一步揭示其發(fā)病機(jī)制，研制新型鎮(zhèn)痛藥物及探尋更有效的治療方法刻不容緩[19]。既往腰部脊髓神經(jīng)根的病變是LDHS研究的焦點(diǎn)，而本研究從新的角度提出脊髓EM2的低表達(dá)導(dǎo)致了LDHS的產(chǎn)生，為LDHS的預(yù)防和治療提供了新的理論意義。

既往研究表明，腰部神經(jīng)根的機(jī)械性受壓和炎性變是LDHS發(fā)病的根本原因，然而近期諸多學(xué)者堅(jiān)信脊髓和大腦的功能異?；虿±砀淖?cè)贚DHS的發(fā)病過程中扮演著至關(guān)重要的角色[20]。脊髓背角是痛覺信號(hào)傳遞的第一道閘門和初級(jí)中樞，大腦中的前扣帶回皮質(zhì)和島葉也與痛覺調(diào)控密切相關(guān)。有研究在功能性核磁共振檢查中發(fā)現(xiàn)LDHS患者脊髓背角、前扣帶回皮質(zhì)及島葉處于過度激活和代謝活躍狀態(tài)[21]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)LDHS大鼠脊髓背角神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率顯著增加[22]，表明LDHS狀況下痛覺信號(hào)在脊髓背角的傳遞出現(xiàn)了強(qiáng)化和擴(kuò)大。EM是最新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性阿片肽，包括EM2和EM1。EM作為內(nèi)源性物質(zhì)，與相同量的嗎啡比較能產(chǎn)生更強(qiáng)的止痛效果，而極少產(chǎn)生不良反應(yīng)[4-8]。脊髓背角富含EM2，其在神經(jīng)病理性痛的誘發(fā)和維持中扮演著極為重要的角色，外周神經(jīng)結(jié)扎或切斷可導(dǎo)致脊髓EM2的表達(dá)顯著下調(diào)[23]，全身或脊柱鞘內(nèi)注射EM2可對(duì)神經(jīng)病理性痛起到顯著的鎮(zhèn)痛作用[24]。鑒于既往無LDHS與脊髓EM2關(guān)聯(lián)性的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究從新的切入點(diǎn)，即脊髓水平探索LDHS的發(fā)病機(jī)制。本研究建立的LDHS大鼠模型其下肢機(jī)械性異常疼痛穩(wěn)定存在，本研究發(fā)現(xiàn)LDHS大鼠脊髓背角EM2的免疫熒光染色強(qiáng)度和脊髓EM2的表達(dá)水平均顯著減低。既往研究表明，在外周神經(jīng)損傷性痛[23]、糖尿病性痛[16]及化療性痛[25]等動(dòng)物模型脊髓背角EM2的表達(dá)水平顯著減少，本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果具有一致性。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)LDHS大鼠脊髓EM2的表達(dá)水平與痛覺閾值呈顯著正相關(guān)，而鞘內(nèi)給予β-FNA可使疼痛進(jìn)一步加深，這就完全印證了本研究的結(jié)論，即LDHS大鼠脊髓背角EM2的表達(dá)水平下調(diào)導(dǎo)致內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用的減小，最終強(qiáng)化痛覺信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致LDHS大鼠痛覺閾值的減低。

楊代軍[6]研究表明，在坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(SNI)神經(jīng)病理性痛小鼠模型，經(jīng)中樞側(cè)腦室或外周腳趾給藥后EM2和EM1能產(chǎn)生比嗎啡更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，但EM2和EM1的鎮(zhèn)痛持續(xù)時(shí)間比嗎啡短。本研究在LDHS大鼠經(jīng)脊髓鞘內(nèi)注射EM2能產(chǎn)生比EM1或嗎啡更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，同樣EM2和EM1的鎮(zhèn)痛持續(xù)時(shí)間比嗎啡短。楊代軍[6]研究與本研究的相似之處：均為建立動(dòng)物疼痛模型，給藥EM2、EM1或嗎啡進(jìn)行鎮(zhèn)痛研究，并且在鎮(zhèn)痛效能和鎮(zhèn)痛持續(xù)時(shí)間方面分析了EM2、EM1與嗎啡之間的區(qū)別。楊代軍[6]研究與本研究的區(qū)別之處：(1)楊代軍[6]在實(shí)驗(yàn)中使用各種阿片受體拮抗劑進(jìn)一步分析了EM鎮(zhèn)痛的阿片機(jī)制，其研究更加深入；而本研究未探索EM鎮(zhèn)痛的阿片機(jī)制。(2)兩種動(dòng)物模型所代表的臨床實(shí)際意義不同。楊代軍[6]在實(shí)驗(yàn)中建立SNI神經(jīng)病理性痛模型，該模型主要模擬急性創(chuàng)傷患者，這些患者由于車禍、高處墜落、戰(zhàn)爭中槍擊或爆炸等原因?qū)е孪轮窠?jīng)出現(xiàn)挫傷或離斷，引起下肢劇烈疼痛，疼痛程度較重；而本研究建立了LDHS模型，該模型主要模擬中老年腰椎間盤突出癥患者，這些患者由于久坐或長期彎腰負(fù)重導(dǎo)致腰部勞損和退變，突出之腰椎間盤壓迫坐骨神經(jīng)，引起下肢疼痛，疼痛程度屬中等。

綜上所述，本研究結(jié)果不僅對(duì)闡明LDHS的中樞機(jī)制、了解EM在病理狀態(tài)下的作用具有重要的理論意義，而且對(duì)開發(fā)新一代鎮(zhèn)痛藥、造福LDHS患者均具有重要的理論意義。本研究的局限性：(1)在LDHS大鼠模型未觀察EM2所起鎮(zhèn)痛作用的具體阿片機(jī)制，需進(jìn)一步利用各種阿片受體拮抗劑分析EM2作用于哪種阿片受體起到鎮(zhèn)痛機(jī)制；(2)未探索EM2所起鎮(zhèn)痛作用的具體胞內(nèi)分子機(jī)制，需進(jìn)一步利用分子生物學(xué)及神經(jīng)電生理膜片鉗技術(shù)分析EM2作用于阿片類受體后產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制。