何小燕，廖 林，孫 俊，賈毅敏△

(1.重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部中藥房 400030;2.重慶市人民醫(yī)院藥學(xué)部 401147)

肺癌是全球最常見(jiàn)的癌癥之一，也是發(fā)病率和病死率最高的癌癥[1-3]。肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要類(lèi)型，約占肺癌的85%，包括鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和腺癌。遺傳易感性、不良飲食、職業(yè)暴露和吸煙是非小細(xì)胞肺癌的主要危險(xiǎn)因素[4]。非小細(xì)胞肺癌早期治愈率較高，但多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后較差[5]。近年來(lái)，手術(shù)、放療、化療和靶向治療等方面均取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但非小細(xì)胞肺癌患者，尤其是轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)患者的整體生存時(shí)間遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的水平[6]。因此，亟待研究非小細(xì)胞肺癌的致病機(jī)制和新的治療策略。有研究發(fā)現(xiàn)天然藥物提取物具有抗炎、抗腫瘤等作用。葫蘆素E是一種天然的三萜類(lèi)化合物，具有較強(qiáng)的抗炎和抗癌活性[7]。葫蘆素E可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞caspase依賴性凋亡和活性氧(ROS)介導(dǎo)的保護(hù)性自噬[8]。在小鼠模型中，葫蘆素E可通過(guò)抑制Yes相關(guān)蛋白信號(hào)通路抑制人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌的腦轉(zhuǎn)移[9]。但葫蘆素E的抗肺癌分子機(jī)制尚未闡明。白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)是Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子，參與炎癥、自身免疫和癌癥。IRAK1在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，其與肺癌臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)[10]。但葫蘆素E是否可通過(guò)調(diào)控IRAK1表達(dá)發(fā)揮抗肺癌作用尚未可知。因此，本研究主要分析了葫蘆素E對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡和自噬的影響，探究了其對(duì)IRAK1的調(diào)控作用，旨在為肺癌的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1材料

肺癌細(xì)胞系H1299購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，葫蘆素E購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)購(gòu)自上海微科生物技術(shù)有限公司，胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司，Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海瓦蘭生物科技有限公司，RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒均購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，si-NC、si-IRAK1均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司，pcDNA、pcDNA-IRAK1均購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將H1299細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H1299細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H1299細(xì)胞接種于6孔板(5×104個(gè)/孔)，分別加入含0、0.01、0.10、1.00、2.00、5.00 μmol/L葫蘆素E的培養(yǎng)基孵育24 h，0 μmol/L葫蘆素E處理的H1299細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組，檢測(cè)H1299細(xì)胞活力。后續(xù)實(shí)驗(yàn)的葫蘆素E質(zhì)量濃度選擇2.00 μmol/L，將2 μmol/L葫蘆素E處理的H1299細(xì)胞設(shè)為葫蘆素E組。將si-NC、si-IRAK1分別轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞中，設(shè)為si-NC組和si-IRAK1組；用2.00 μmol/L葫蘆素E處理并分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-IRAK1至H1299細(xì)胞中24 h，設(shè)為葫蘆素E+pcDNA組和葫蘆素E+pcDNA-IRAK1組。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞活力

取各組H1299細(xì)胞(2.5×104個(gè)/mL)接種于96孔板(100 μL/孔)，培養(yǎng)48 h后加入MTT溶液20 μL/孔，培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μL/孔，室溫震蕩孵育5 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度(A)值，并計(jì)算H1299細(xì)胞活力。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)H1299細(xì)胞凋亡，收集各組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，結(jié)合緩沖液重懸后分別加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，37 ℃孵育15 min后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取各組H1299細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒進(jìn)行定量。以每孔60 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，用PBS洗滌3次，加入二抗室溫孵育2 h，用PBS洗滌3次，顯影，定影，以GAPDH作為內(nèi)參，用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參檢測(cè)IRAK1 mRNA表達(dá)水平，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。IRAK1 mRNA上游引物序列：5′-GCA CCC ACA ACT TCT CGG AG-3′，下游引物序列：5′- CAC CGT GTT CCT CAT CAC CG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′，下游引物序列：5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1不同質(zhì)量濃度葫蘆素E對(duì)肺癌H1299細(xì)胞活力的影響

0.10、1.00、2.00、5.00 μmol/L葫蘆素E組肺癌H1299細(xì)胞活力分別為78.58±4.76、62.19±3.26、45.41±2.34、28.76±1.78均明顯低于對(duì)照組(100.00±5.14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.718，P=0.000)；0.01 μmol/L葫蘆素E組細(xì)胞活力(93.69±3.71)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)葫蘆素E質(zhì)量濃度為2.00 μmol/L。

2.2葫蘆素E對(duì)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和自噬的影響

與對(duì)照組比較，葫蘆素E組肺癌H1299細(xì)胞凋亡率和自噬水平均顯著升高，Bcl-2、p62表達(dá)水平均顯著降低，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、自噬相關(guān)基因Beclin 1(Beclin 1)、自噬相關(guān)基因(ATG5)表達(dá)水平，以及輕鏈3(LC3)Ⅱ/Ⅰ顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

A：H1299細(xì)胞凋亡流式圖；B：凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。

表1 葫蘆素E對(duì)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和自噬的影響

2.3葫蘆素E對(duì)肺癌H1299細(xì)胞中IRAK1表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，葫蘆素E組肺癌H1299細(xì)胞IRAK1表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

圖2 葫蘆素E對(duì)肺癌H1299細(xì)胞中IRAK1蛋白表達(dá)的影響

表2 葫蘆素E對(duì)肺癌H1299細(xì)胞中IRAK1表達(dá)的影響

2.4干擾IRAK1對(duì)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和自噬的影響

與si-NC組比較，si-IRAK1組肺癌H1299細(xì)胞凋亡率和自噬水平均顯著升高，IRAK1、Bcl-2、p62表達(dá)水平均顯著降低，Bax、Beclin 1、ATG5表達(dá)水平，以及LC3Ⅱ/Ⅰ均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表3。

A：H1299細(xì)胞凋亡流式圖；B：凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。

表3 干擾IRAK1對(duì)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和自噬的影響

2.5葫蘆素E聯(lián)合IRAK1對(duì)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和自噬的影響

與葫蘆素E+pcDNA組比較，葫蘆素E+pcDNA-IRAK1組肺癌H1299細(xì)胞凋亡率和自噬水平均顯著降低，IRAK1、Bcl-2、p62表達(dá)水平均顯著升高，Bax、Beclin 1、ATG5表達(dá)水平，以及LC3Ⅱ/Ⅰ顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表4。

A：H1299細(xì)胞凋亡流式圖；B：凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。

表4 葫蘆素E聯(lián)合IRAK1對(duì)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和自噬的影響

3 討 論

目前，非小細(xì)胞肺癌的治療方法包括手術(shù)、免疫治療、放療、靶向治療等?；?、靶向治療等雖可提高療效，但也會(huì)損傷正常組織器官，因此，急需尋找高效且低毒的藥物。中醫(yī)藥已有3 000多年的歷史，可用于預(yù)防和治療多種肺相關(guān)疾病。傳統(tǒng)中藥可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制增殖、抑制轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥和調(diào)節(jié)免疫功能發(fā)揮抗癌作用，并改善患者的生活質(zhì)量[11-12]。傳統(tǒng)中草藥在癌癥的輔助治療中由來(lái)已久，近年來(lái)，傳統(tǒng)中草藥對(duì)肺癌的治療作用已經(jīng)被廣泛篩選和評(píng)估，如姜黃素、白花丹素、人參皂苷、紫草素、雷公藤紅醇等均顯示出一定的抗肺癌活性。葫蘆素E具有較強(qiáng)的抗癌活性，可通過(guò)降低轉(zhuǎn)錄因子激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4(TFAP4)/Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)通路增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的化療敏感性[13]。葫蘆素E可通過(guò)調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3等多種藥理信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和遷移[14]。葫蘆素E通過(guò)抑制蛋白激酶B(AKt)活化降低其在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯和凋亡，抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]。葫蘆素E對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。葫蘆素E通過(guò)抑制磷酸肌醇-3激酶/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)(OS)腫瘤的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。葫蘆素E可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞周期G2/M期阻滯，下調(diào)Cyclinb1和細(xì)胞分裂周期2(CDC2)的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖[18]。葫蘆素E可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯和凋亡而顯著抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，葫蘆素E可促進(jìn)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和自噬，降低Bcl-2、p62表達(dá)水平，提高Bax、Beclin 1、ATG5表達(dá)水平，以及LC3Ⅱ/Ⅰ。提示葫蘆素E可能通過(guò)調(diào)控凋亡和自噬發(fā)揮抗肺癌作用。

有研究表明，IRAK1促進(jìn)多種癌癥的進(jìn)展，如在肝癌組織和細(xì)胞中IRAK1高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[20]。微RNA-146a可能通過(guò)下調(diào)IRAK1表達(dá)提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性[21]。S100A14可通過(guò)促進(jìn)IRAK1降解抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移[22]。本研究結(jié)果顯示，干擾IRAK1可促進(jìn)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和自噬，降低Bcl-2、p62表達(dá)水平，提高Bax、Beclin 1、ATG5表達(dá)水平，以及LC3Ⅱ/Ⅰ。提示干擾IRAK1可能通過(guò)調(diào)控凋亡和自噬發(fā)揮抗肺癌作用。近年來(lái)，傳統(tǒng)中藥聯(lián)合靶向基因的腫瘤治療方式越來(lái)越受到人們的關(guān)注。龍葵堿聯(lián)合KLF16基因可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。過(guò)表達(dá)IGFBP1可逆轉(zhuǎn)黃芪甲苷對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用[24]。葫蘆素E通過(guò)上調(diào)DR5表達(dá)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡[25]。與上述研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示，葫蘆素E可顯著下調(diào)IRAK1表達(dá)，且上調(diào)IRAK1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)葫蘆素E對(duì)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和自噬的影響，降低了肺癌H1299細(xì)胞的凋亡和自噬，提高了Bcl-2、p62表達(dá)水平，降低了Bax、Beclin 1、ATG5表達(dá)水平，以及LC3Ⅱ/Ⅰ。提示下調(diào)IRAK1可能是葫蘆素E在肺癌中發(fā)揮抗癌作用的重要途徑。

綜上所述，葫蘆素E可能通過(guò)下調(diào)IRAK1表達(dá)促進(jìn)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和自噬，這豐富了中藥化合物靶向基因的調(diào)控關(guān)系，有助于了解肺癌生理病理過(guò)程，為葫蘆素E治療肺癌提供了新的理論思路。