王君明 高家樂 杜宇 鄭妍 梁靜靜 史佩欣

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心)

肺喜潤(rùn)惡燥，風(fēng)熱或肺熱郁肺日久，常可誘發(fā)燥咳、干咳少痰甚或痰中帶血。而且，燥咳干咳患者多經(jīng)久難愈，若能做到未病先防，臨床意義重大。當(dāng)前缺乏適合未病先防的保健茶飲?；诖?，本研究在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，選取藥性甘涼、清熱滋陰潤(rùn)燥的中藥枇杷果〔1〕和羅漢果〔2〕為主要原料，研發(fā)滋陰潤(rùn)燥茶飲，以滿足未病先防的保健需求和潤(rùn)燥茶的飲茶需求。本研究采用常規(guī)濃氨水引咳法和酚紅祛痰法考察枇杷果與羅漢果配伍前后茶飲的止咳祛痰作用，并結(jié)合枇杷果和羅漢果的清熱功效，進(jìn)一步采用二甲苯致耳廓腫脹法和醋酸扭體法考察了二者配伍前后茶飲的抗炎鎮(zhèn)痛作用，旨在為枇杷果和羅漢果作為未病先防的保健茶飲的推廣應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 昆明(KM)小鼠，SPF級(jí)，雄性，體重(20±2)g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(豫)2015-0004。

1.2試藥 枇杷果購(gòu)自花果山生態(tài)農(nóng)業(yè)淘寶網(wǎng)店，產(chǎn)地云南蒙自；羅漢果購(gòu)自漓鄉(xiāng)韻桂林土特產(chǎn)淘寶網(wǎng)店，產(chǎn)地廣西永福。枇杷果和羅漢果均經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳隨清教授鑒定，分別為薔薇科植物枇杷〔Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.〕的新鮮果實(shí)和葫蘆科植物羅漢果〔Siraitiagrosvenorii(Swingle) C.Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang〕的干燥果實(shí)。二甲苯：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)20161020。布洛芬片：上海華源安徽仁濟(jì)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)151101。冰乙酸：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20160910。復(fù)方桔梗止咳片：廣西慧寶源制藥有限公司，批號(hào)140801。氯化銨：天津大茂化學(xué)試劑廠，分析純，批號(hào)20141015。碳酸氫鈉：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，分析純，批號(hào)20170209。氨水：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司，分析純，批號(hào)20160601。

1.3主要儀器設(shè)備 EpochTM型微孔板分光光度計(jì)(美國(guó)BioTek公司)，IVC-Ⅱ型小鼠獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具系統(tǒng)(江蘇蘇州馮氏動(dòng)物籠具廠)，EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海比朗儀器有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)，YLS-Q4型8 mm打孔器(北京市平谷北張岱五金廠)。

1.4茶飲制備 取適量的枇杷果、羅漢果或不同質(zhì)量配比(1/4、1/2、1/1、2/1、4/1)的枇杷果與羅漢果配方，每1 g生藥加20 ml蒸餾水，先浸泡30 min,水煮兩次，沸騰后保持微沸，每次30 min,合并濾液，過濾，減壓濃縮至以生藥計(jì)濃度為0.5 g/ml的茶飲。

1.5枇杷果與羅漢果配伍前后的茶飲對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽的影響 采用常規(guī)濃氨水引咳咳嗽模型研究受試藥物的止咳作用。小鼠按體重隨機(jī)分為9組，即濃氨水致咳嗽模型組(濃氨水組)、陽(yáng)性藥復(fù)方桔梗止咳片(復(fù)方桔梗止咳片)組、枇杷果單用茶飲(枇杷果)組、羅漢果單用茶飲(羅漢果)組、枇杷果與羅漢果不同配比(1/4、1/2、1/1、2/1、4/1組)配伍茶飲組，復(fù)方桔梗止咳片劑量0.35 g/kg，各茶飲劑量均為10 g/kg，各組連續(xù)灌胃給藥3 d，末次給藥后1 h進(jìn)行濃氨水引咳，記錄小鼠咳嗽潛伏期及2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.6枇杷果與羅漢果配伍前后的茶飲對(duì)小鼠器官段酚紅排泄量的影響 采用常規(guī)酚紅祛痰法研究受試藥物的祛痰作用。小鼠按體重隨機(jī)分為9組，即對(duì)照組、陽(yáng)性藥10%氯化銨(氯化銨)組、枇杷果單用茶飲(枇杷果)組、羅漢果單用茶飲(羅漢果)組、枇杷果與羅漢果不同配比(1/4、1/2、1/1、2/1、4/1組)配伍茶飲組，10%氯化銨劑量為2 g/kg，各茶飲劑量均為10 g/kg，各組連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥后30 min，每只小鼠腹腔注射含 2.5% 酚紅的 5%碳酸氫鈉溶液，0.2 ml/10 g，30 min后脫椎處死小鼠，仰位固定，頸部拉直，解剖分離出氣管，將各氣管段放入預(yù)先盛有1.5 ml的5%碳酸氫鈉溶液的離心管中，超聲波清洗，使氣管段中的酚紅完全釋放，離心，取上清液，微孔板分光光度計(jì)測(cè)546 nm處吸光度(A)值，與酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算酚紅含量，根據(jù)酚紅含量和動(dòng)物體質(zhì)量得校正酚紅含量。酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.084 2x + 0.041 2，相關(guān)系數(shù)r=0.997，其中x為酚紅溶液濃度(μg/ml)，y為A值。

1.7枇杷果與羅漢果配伍前后的茶飲對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 采用常規(guī)二甲苯致小鼠耳廓腫脹炎癥模型研究受試藥物的抗炎作用。小鼠按體重隨機(jī)分為9組，即二甲苯組、布洛芬組、枇杷果組、羅漢果組、枇杷果與羅漢果不同配比(1/4、1/2、1/1、2/1、4/1組)配伍的茶飲組，復(fù)方桔梗止咳片劑量0.1 g/kg，各茶飲劑量均為10 g/kg，各組連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥后1 h，用移液槍吸取二甲苯10 μl，均勻涂布至小鼠的右耳背腹兩側(cè)以致炎，1 h后立即將小鼠頸椎脫臼處死，立刻剪下小鼠的左右耳，用直徑為8 mm打孔器在小鼠的左右耳同一位置打孔，以小鼠左右耳片的質(zhì)量差為腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率。腫脹度=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量，腫脹抑制率(%)=(二甲苯組腫脹度-給藥組腫脹度)/二甲苯組腫脹度×100%。

1.8枇杷果與羅漢果茶飲配伍前后的對(duì)醋酸所致小鼠扭體的影響 采用常規(guī)小鼠冰醋酸扭體疼痛模型研究受試藥物的鎮(zhèn)痛作用。小鼠按體重隨機(jī)分為9組，即醋酸組、布洛芬組、枇杷果組、羅漢果組、枇杷果與羅漢果不同配比(1/4、1/2、1/1、2/1、4/1組)配伍茶飲組，復(fù)方桔梗止咳片劑量0.1 g/kg，各茶飲劑量均為10 g/kg，各組連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥后1 h，各組小鼠均腹腔注射0.6%冰乙酸，0.1 ml/10 g，記錄出現(xiàn)第1次扭體反應(yīng)的時(shí)間(即潛伏期)及15 min內(nèi)的扭體次數(shù)。鎮(zhèn)痛率(%)=(醋酸組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù))/醋酸組平均扭體次數(shù)×100%。

1.9統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1枇杷果與羅漢果配伍前后的茶飲對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽的影響 枇杷果組、1/2組、1/1組和4/1組及復(fù)方桔梗止組咳片均顯著延長(zhǎng)了濃氨水致咳嗽小鼠的咳嗽潛伏期(P<0.05，P<0.01)，并顯著減少了咳嗽次數(shù)(P<0.01)；2/1組盡管沒有顯著延長(zhǎng)濃氨水致咳嗽小鼠的咳嗽潛伏期(P>0.05)，卻顯著減少了咳嗽次數(shù)(P<0.01)。見表1。

表1 枇杷果與羅漢果茶飲對(duì)濃氨水所致小鼠咳嗽的影響

2.2枇杷果與羅漢果配伍前后的茶飲對(duì)小鼠器官段酚紅排泄量的影響 與對(duì)照組比較，枇杷果組、1/1組及氯化銨組均顯著提高了小鼠器官段的酚紅排泄量(P<0.05)，且祛痰率均較高。見表2。

表2 枇杷果與羅漢果茶飲對(duì)小鼠器官段酚紅排泄量的影響

2.3枇杷果與羅漢果配伍前后的茶飲對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 枇杷果組、羅漢果組、1/4組、1/2組、1/1組、2/1組和4/1組及布洛芬組均顯著降低了二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹度(P<0.01)，對(duì)耳廓腫脹的抑制率在50.0%～68.3%。見表3。

表3 枇杷果與羅漢果茶飲對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

2.4枇杷果與羅漢果茶飲配伍前后對(duì)醋酸所致小鼠扭體的影響 1/2組和4/1組及布洛芬組均顯著減少了醋酸所致小鼠的扭體次數(shù)(P<0.05，P<0.01)；4/1組顯著延長(zhǎng)了醋酸所致小鼠的扭體潛伏期(P<0.01)。見表4。

表4 枇杷果與羅漢果茶飲對(duì)醋酸所致小鼠扭體的影響

3 討 論

枇杷為薔薇科蘋果亞科枇杷屬植物,含有多種化學(xué)成分，其中包括富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分及三萜酸、黃酮、酚類等重要藥效成分，具有止咳、祛痰、抗炎、抗癌、抗病毒、抑菌、抗氧化、抗疲勞、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等廣泛的藥理作用〔2～6〕；羅漢果為葫蘆科植物羅漢果的干燥果實(shí)，含有多糖、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分及苷類、黃酮、油脂等多種生物活性成分，具有止咳、祛痰、抗炎、抑菌、降糖、抗氧化、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保肝、調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞等廣泛的藥理作用〔7～10〕。此外，枇杷果肉鮮美，羅漢果因其濃郁的甜味而聞名于世，是一種非熱量的天然甜味劑，枇杷果和羅漢果口感好且均有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值〔2～4,8〕。因此，本研究以枇杷果和羅漢果為主要原料，考察二者單用及不同配比下配伍前后對(duì)常見生物活性(如止咳、祛痰、抗炎等)的影響，旨在為開發(fā)以二者為主要組成原料的滋陰潤(rùn)燥茶飲的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

濃氨水引咳法、酚紅祛痰法、二甲苯致耳廓腫脹法、醋酸扭體法分別為考察藥物止咳、祛痰、抗炎、鎮(zhèn)痛作用方面常用的研究方法〔11～18〕。本研究采用小鼠常規(guī)濃氨水引咳法、酚紅祛痰法、二甲苯致耳廓腫脹法、醋酸扭體法考察了枇杷果與羅漢果配伍前后茶飲的止咳、祛痰、抗炎、鎮(zhèn)痛作用。研究結(jié)果表明，就配伍前的單用茶飲而言，枇杷果具有止咳、祛痰和抗炎作用，這與枇杷具有止咳、祛痰、抗炎等生物活性的報(bào)道基本一致〔2～6〕；羅漢果具有抗炎作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道羅漢果(含其活性組分)具有抗炎活性的研究報(bào)道基本一致〔7～10〕；就二者配伍后的茶飲而言，枇杷果與羅漢果分別以1/2和4/1配比下的茶飲均具有止咳、抗炎和鎮(zhèn)痛作用，枇杷果與羅漢果以1/1配比下茶飲具有止咳、祛痰和抗炎作用，枇杷果與羅漢果以1/4配比下茶飲具有抗炎作用，枇杷果與羅漢果以2/1配比下茶飲具有止咳和抗炎作用。就配伍前后的比較而言，枇杷果單用茶飲有止咳、祛痰和抗炎三種作用，這僅與枇杷果與羅漢果以1/1比例下茶飲的作用一致，但卻與其他四個(gè)配比下茶飲的作用不完全一致，例如以1/2和4/1比例下茶飲均比枇杷果單用茶飲新增了鎮(zhèn)痛作用卻未見祛痰作用，以2/1比例下茶飲有止咳和抗炎作用但卻未見祛痰作用，以1/4比例下茶飲僅見抗炎作用卻未見止咳和祛痰作用。同樣，羅漢果單用茶飲在本研究中僅見抗炎作用，這僅與枇杷果與羅漢果以1/4比例下茶飲的作用一致，但卻與其他四個(gè)配比下茶飲的作用不完全一致。此外，枇杷果和羅漢果兩個(gè)單用的茶飲，在本研究中均未見到鎮(zhèn)痛作用，然而，枇杷果與羅漢果分別以1/2和4/1比例下茶飲均產(chǎn)生了鎮(zhèn)痛作用。之所以產(chǎn)生以上現(xiàn)象，究其原因，主要與枇杷果與羅漢果配伍前后煎煮制茶過程中引起生物活性成分(諸如三萜酸、黃酮、酚類、皂苷、甜苷、油脂等)的種類和數(shù)量的差異變化有關(guān)。至于主要是哪些化學(xué)成分的變化引起了這些差異進(jìn)而誘發(fā)了以上諸多現(xiàn)象的發(fā)生，尚需要進(jìn)一步研究。