李建偉 田文靜 劉民

(1滄州市中心醫(yī)院泌尿外二科，河北 滄州 061001；2滄州醫(yī)學高等?？茖W校)

膀胱癌屬于泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其主要生物學特性為侵襲性強、易轉移及復發(fā)等，但胰腺癌發(fā)病機制尚未完全闡明〔1〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)可通過調(diào)控基因轉錄或轉錄后水平進而參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明長鏈非編碼RNA Linc00152(LncRNA Linc00152)在惡性腫瘤中高表達，并可在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用〔2〕。Linc00152可通過調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡等生物行為進而促進腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔3〕。研究報道指出Linc00152過表達可促進肝癌、血管瘤細胞的增殖、遷移〔4～6〕。但Linc00152對膀胱癌生物行為及放射敏感性的影響尚未見報道。研究表明微小RNA-103a-3p(miR-103a-3p)在膀胱癌組織中的表達顯著降低，同時TCF25可通過miR-103a-3p/miR-107調(diào)控CDK6的表達進而促進膀胱癌的增殖遷移〔7〕。通過對Linc00152下游靶基因進行預測發(fā)現(xiàn)miR-103a-3p可能為Linc00152作用靶點，但Linc00152是否通過調(diào)控miR-103a-3p表達進而參與膀胱癌細胞增殖、凋亡過程及其對細胞放射敏感性的關系尚未可知。因此，本研究通過觀察Linc00152表達變化對膀胱癌細胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響，并探討其是否通過調(diào)控miR-103a-3p表達而發(fā)揮作用，為深入研究膀胱癌發(fā)病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2016年3～12月滄州市中心醫(yī)院收治的膀胱癌患者41例為研究對象，所有患者進行手術且經(jīng)病理證實為膀胱癌，男21例，女20例，年齡55～70〔平均(65.32±6.58)〕歲，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者知情且簽署同意書。于術中切除膀胱癌組織及癌旁組織標本(>5 cm)，放入液氮中保存，術后轉移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2實驗細胞與主要試劑 膀胱癌BIU-87細胞購自美國ATCC細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑與Lipofectamine2000轉染試劑均購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒與實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；siRNA、miR-103a-3p mimcs、miR-103a-3p抑制劑(anti-miR-103a-3p)及其各自陰性對照均購自上海吉瑪生物科技有限公司；WT-Linc00152、MUT-Linc00152載體均購自上海吉瑪制藥有限公司；CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax抗體均購自美國CST公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；Annexin V-FITC雙染細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1細胞轉染與處理 膀胱癌BIU-87細胞放入含有10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素混合溶液的RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶進行傳代，取對數(shù)生長期膀胱癌BIU-87細胞，胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整細胞密度，以每孔5×105個細胞的密度接種于6孔板，放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，細胞生長融合度達到50%～80%時進行轉染，實驗將膀胱癌BIU-87細胞分為si-NC組(轉染Linc00152的陰性對照)、si-Linc00152組(轉染Linc00152-siRNA)、miR-NC(轉染miR-103a-3p陰性對照)組、miR-103a-3p(轉染miR-103a-3p mimics)組、si-Linc00152+anti-miR-NC組(共轉染Linc00152-siRNA與anti-miR-NC)、si-Linc00152+anti-miR-103a-3p組(共轉染Linc00152-siRNA與anti-miR-103a-3p)，轉染48 h后采用qRT-PCR檢測膀胱癌BIU-87細胞中Linc00152與miR-103a-3p的表達水平鑒定轉染效果。

1.3.2qRT-PCR檢測Linc00152、miR-103a-3p表達 分別取各組膀胱癌BIU-87細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，應用NanoDrop檢測RNA濃度，參照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行qRT-PCR，反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O補足體系至20 μl。反應條件：95℃預變性5 min循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。Linc00152以GAPDH為內(nèi)參，miR-103a-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算Linc00152、miR-103a-3p相對表達量。

1.3.3MTT檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期膀胱癌BIU-87細胞，以每孔2×103個細胞的密度接種于96孔板，在接種后24 h、48 h、72 h分別加入MTT溶液(20 μl/孔)，培養(yǎng)4 h后，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻，利用酶標儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度(OD)值。

1.3.4檢測細胞凋亡率 預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌膀胱癌BIU-87細胞，加入100 μl 1×結合緩沖液重懸細胞，取5×105個細胞轉移至離心管，PBS洗滌，加入5 μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min，1 000 r/min轉速離心3 min，離心半徑6 cm，加入5 μl PI，避光孵育15 min，加入400 μl 1×結合緩沖液，充分混勻，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.5Western印跡檢測CyclinD1、Bcl-2 P21、Bax蛋白表達 取對數(shù)生長期膀胱癌BIU-87細胞，加入RIPA蛋白裂解液裂解細胞，蛋白變性后，取30 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，反應結束后轉膜、封閉，加入CyclinD1、Bcl-2 P21、Bax一抗(稀釋比1∶200)，4℃孵育24 h，加入二抗(稀釋比1∶1 000)，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，PBST洗滌，滴加ECL發(fā)光試劑，放入凝膠成像儀并應用Quantity One軟件分析蛋白灰度值。

1.3.6克隆形成實驗 收取生長良好的膀胱癌BIU-87細胞，用0、2、4、6、8 Gy不同照射劑量照射細胞，放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，PBS洗滌3次×10 min，使用甲醇固定20 min，吉姆薩染色40 min，洗滌后置于顯微鏡下觀察形成的集落數(shù)，計算細胞存活分數(shù)與放射增敏比。

1.3.7雙熒光素酶報告基因實驗 生物信息學數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)Linc00152與miR-103a-3p存在靶向結合位點，分別構建含有結合位點序列的野生型WT-Linc00152報告基因載體，將Linc00152與miR-103a-3p結合位點突變序列構建到報告基因載體記為MUT-Linc00152，同時將膀胱癌BIU-87細胞接種于24孔板，待細胞生長融合度達50%～80%時分別將miR-103a-3p mimic或miR-NC與WT-Linc00152、MUT-Linc00152共轉染BIU-87細胞，根據(jù)熒光素酶檢測試劑盒說明書進行操作，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細胞并檢測各細胞相對熒光素酶活性。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1Linc00152在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達 與癌旁組織(0.25±0.02)相比，膀胱癌組織(0.93±0.09)中Linc00152的表達水平顯著升高(t=47.227,P=0.000)。

2.2抑制Linc00152對細胞BIU-87增殖、凋亡的影響 相較于si-NC組，si-Linc00152組膀胱癌 BIU-87細胞中Linc00152的表達水平顯著降低(P<0.05)，提示轉染效果良好。與si-NC組相比，si-Linc00152組膀胱癌 BIU-87細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)，而細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)，而P21、Bax蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)。見圖1，圖2，表1。表明抑制Linc00152表達可能通過調(diào)控細胞增殖及凋亡相關蛋白表達而抑制膀胱癌細胞增殖并促進細胞凋亡。

圖1 抑制Linc00152對細胞BIU-87凋亡的影響

圖2 抑制Linc00152對細胞BIU-87增殖、凋亡蛋白表達的影響

表1 抑制Linc00152對細胞BIU-87增殖和凋亡的影響

2.3抑制Linc00152表達聯(lián)合放射對細胞BIU-87存活率的影響 用不同照射劑量照射膀胱癌細胞后，si-Linc00152組膀胱癌細胞存活率與si-NC組比較顯著下降(P<0.05)，增敏比(SER)為1.879，見表2、表3。表明抑制Linc00152表達可明顯增強膀胱癌細胞放射敏感性。

表2 抑制Linc00152對細胞BIU-87存活分數(shù)的影響

表3 單擊多靶模型參數(shù)

2.4Linc00152靶向、調(diào)控miR-103a-3p 靶基因預測結果顯示Linc00152的3′UTR中含有與miR-103a-3p互補的核苷酸序列，見圖3。雙熒光素酶報告實驗檢測結果顯示，與轉染miR-NC組比較，共轉染W(wǎng)T-Linc00152與miR-103a-3p mimics后可顯著降低膀胱癌細胞的熒光素酶活性(P<0.05)；而共轉染MUT-Linc00152與miR-103a-3p mimics后膀胱癌細胞的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見表4。qRT-PCR實驗進一步檢測結果顯示，與pcDNA3.1組(0.22±0.02)相比，pcDNA3.1-Linc00152組(0.09±0.01)膀胱癌細胞中miR-103a-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組(0.23±0.02)相比，si-Linc00152組(0.67±0.06)膀胱癌細胞中miR-103a-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖3 Linc00152靶向miR-103a-3p

2.5過表達miR-103a-3p對細胞BIU-87增殖、凋

亡及放射敏感性的影響 與miR-NC組相比，miR-103a-3p組膀胱癌細胞中miR-103a-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)。提示轉染效果良好。相對于miR-NC組，miR-103a-3p組膀胱癌細胞增殖活性及細胞存活分數(shù)均顯著降低(P<0.05)，而細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，而P21、Bax白表達量顯著增加(P<0.05)，見圖4、表5～表7。

表7 單擊多靶模型參數(shù)

圖4 過表達miR-103a-3p對細胞BIU-87增殖、凋亡蛋白表達的影響

表5 過表達miR-103a-3p對細胞BIU-87增殖及凋亡的影響

表6 miR-103a-3p對細胞BIU-87存活分數(shù)的影響

2.6抑制細胞miR-103a-3p表達能逆轉抑制Linc00152對細胞BIU-87增殖、凋亡及放射敏感性的影響 si-Linc00152+anti-miR-103a-3p組膀胱癌細胞存活分數(shù)較si-Linc00152+anti-miR-NC組顯著增加(P<0.05)，細胞活性與細胞存活分數(shù)均明顯升高(P<0.05)，而細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，增敏比(SER)明顯降低，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達量明顯升高(P<0.05)，而P21、Bax蛋白表達量明顯降低

(P<0.05)，見圖5、表8～10。

1～2：si-Linc00152+anti-miR-NC組，si-Linc00152+anti-miR-103a-3p組圖5 抑制細胞miR-103a-3p表達能逆轉抑制Linc00152對細胞BIU-87增殖、凋亡蛋白表達的影響

表8 抑制 miR-103a-3p對抑制Linc00152處理的細胞BIU-87存活分數(shù)的影響

表9 抑制細胞miR-103a-3p表達能逆轉抑制Linc00152對細胞BIU-87增殖及凋亡的影響

表10 單擊多靶模型參數(shù)

3 討 論

隨著膀胱癌致病機制研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)尋找高度可靠性的生物標志物對膀胱癌診斷及治療均具有重要意義，部分LncRNA可作為多種惡性腫瘤診斷及治療的重要標志物〔8〕。目前臨床采用放射、手術及化療等方式治療膀胱癌，但部分患者對放射治療具有一定抵抗性導致患者5年生存率較低〔9〕。因而深入探討膀胱癌發(fā)病機制對增強放射敏感性具有一定現(xiàn)實意義。LncRNA常通過誘導細胞DNA損傷、沉默miRNA、或調(diào)控細胞遷移及侵襲等過程參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔10〕。因此，本研究尋找新型LncRNA分子并分析其與miRNA在膀胱癌發(fā)生及發(fā)展過程中的調(diào)控網(wǎng)絡，為提高治療效果及治療方案的制定提供指導依據(jù)。

Linc00152在胃癌細胞系中的表達水平明顯升高，通過下調(diào)Linc00152表達可明顯降低胃癌細胞增殖速度并誘導細胞凋亡，同時可降低細胞遷移及侵襲能力，進一步研究〔11，12〕表明Linc00152可通過調(diào)控miR-17-5p表達而促進胃癌細胞增殖及遷移。Yang等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)Linc00152在食管鱗癌細胞中呈高表達，并可促進細胞增殖及遷移。Li等〔14〕研究表明Linc00152可通過調(diào)控miR-139-5p表達進而促進口腔鱗狀細胞癌增殖及侵襲。研究〔15，16〕表明P21可抑制CyclinD1與CDK復合物活性而誘導細胞周期停滯于G1期進而抑制細胞生長，細胞凋亡對細胞存活及穩(wěn)態(tài)至關重要，Bcl-2與Bax是調(diào)控細胞凋亡的關鍵因子，Bcl-2屬于凋亡抑制因子，而Bax是凋亡促進因子。說明抑制Linc00152表達可能通過下調(diào)CyclinD1、Bcl-2及上調(diào)P21、Bax表達進而抑制膀胱癌細胞增殖并誘導其凋亡。提示抑制Linc00152表達可抑制膀胱癌細胞增殖及促進其凋亡，增強細胞放射敏感性。

miR-103a-3p在肝癌、肺癌中等低表達并可發(fā)揮抑癌基因作用，研究〔17，18〕表明miR-103a-3p過表達可能通過靶向調(diào)控FEZF1/CDC25A表達進而抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡。miR-103a-3p在卵巢癌、結腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤組織及細胞系中均呈低表達，并可能作為患者預后的獨立預測因子，研究〔19,20〕表明miR-103a-3p可通過靶向調(diào)控PDK4表達而減弱乳腺癌細胞糖酵解活動進而抑制細胞增殖。本研究通過靶基因預測顯示miR-103a-3p可能是Linc00152的靶基因，采用雙熒光素酶報告實驗證實Linc00152可作為miR-103a-3p競爭性吸附cRNA分子，并負向調(diào)控miR-103a-3p表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-103a-3p過表達可明顯抑制膀胱癌細胞增殖并誘導其凋亡，并可增強細胞放射敏感性，提示miR-103a-3p過表達可通過調(diào)控膀胱癌細胞增殖及凋亡過程進而參與膀胱癌發(fā)生及發(fā)展過程。

綜上所述，Linc00152在膀胱癌中呈高表達，抑制其表達后可通過調(diào)控miR-103a-3p表達進而影響膀胱癌細胞增殖、凋亡及其放射敏感性，可為膀胱癌診斷及治療提供新方向。但關于Linc00152在體內(nèi)實驗及其在臨床診斷中的應用仍需深入研究。