呂威力 邢雪松

(沈陽醫(yī)學院 1病理學教研室，遼寧 沈陽 110034；2解剖學教研室)

缺血性腦損傷具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點，是嚴重危害人類健康的疾病〔1～3〕。研究已經(jīng)證實腦缺血能促進成年動物腦內(nèi)神經(jīng)干細胞(NSCs) 的增殖、遷移和分化，部分受損的神經(jīng)元可被分化的新生神經(jīng)元代替，從而在一定程度上改善神經(jīng)功能缺損〔4〕。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類可對神經(jīng)元起調(diào)節(jié)作用的多肽分子。它不止能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞的增殖分化，并且在腦組織缺血之后，保護受到再灌注損傷神經(jīng)元，對神經(jīng)元損傷后的修復及再生發(fā)揮重要作用〔5～7〕。腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)屬于神經(jīng)生長因子家族。研究發(fā)現(xiàn)，大腦中BDNF和GDNF的釋放對缺血性和缺氧性腦損傷具有修復作用。本研究采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法制作大鼠血管性癡呆模型，研究缺血后海馬CXCR4和β-catenin的變化及氣味穿梭訓練的干預效果，探討氣味穿梭訓練干預對血管性癡呆大鼠腦組織保護及CXCR4、β-catenin表達的影響。

1 材料和方法

1.1血管性癡呆模型的制備 54只健康雄性wistar大鼠，8周齡，體重(230±10)g，購于沈陽醫(yī)學院實驗動物中心。將大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組(n=6)，模型組(3、7、14、21 d，n=6)，訓練組(3、7、14、21 d，n=6)。采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法建立血管性癡呆大鼠模型。術(shù)前12 h禁食、4 h禁水。術(shù)前麻醉采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射，取仰臥位固定實驗動物，常規(guī)消毒，頸正中切口2～3 cm，分離雙側(cè)頸總動脈(CCA)，夾閉10 min后再通10 min，需重復上述過程2次，分離時應小心避免拉扯大鼠的迷走神經(jīng)，模型組大鼠在夾閉頸總前腹腔注射硝普鈉(2.5 mg/kg)。術(shù)后放回籠中保溫飼養(yǎng)，應用慶大霉素防止大鼠局部感染。實驗過程中應用多導生物記錄儀在測量并記錄血壓數(shù)值，大鼠在注射硝普鈉前動脈壓平均約為100 mmHg，注射硝普鈉后血壓平均值迅速下降至50～55 mmHg左右約持續(xù)2 min，后血壓平均值緩慢上升至70 mmHg持續(xù)1 h。在建立血管性癡呆模型過程中保持大鼠肛溫維持在(37±1)℃，目的防止溫度降低對腦缺血損傷產(chǎn)生保護。假手術(shù)組分離雙側(cè)頸總動脈后不夾閉血管，也不應用硝普鈉降壓，余同模型組。造模1 d后訓練組開始進行氣味訓練，此后分別于3、7、14、21 d處死取材。

1.2氣味穿梭訓練 建模成功1 d后開始進行氣味穿梭訓練，實驗條件刺激為乙酸異戊酯氣味，非條件刺激為電擊。造模成功的大鼠需要在穿梭箱內(nèi)進行暗適應，適應10 min后開始氣味刺激，刺激氣味使大鼠聞到后逃向穿梭箱另一側(cè)，如果未逃向穿梭箱另一側(cè)則在箱底給予電刺激，電流為5～10 mA，大鼠逃離到穿梭箱底另一側(cè)后電流停止，否則箱底持續(xù)受通電5 s。等待刺激氣味散去后開始下一輪訓練，每次穿梭訓練進行20次上述訓練。

1.3行為學評分 大鼠造模完成后先進行模型篩選，按照Zea Longa評分標準進行神經(jīng)行為學評分，0分：無神經(jīng)功能損傷；1分：大鼠前爪不能完全伸展；2分：大鼠行走時向兩側(cè)晃動；3分：大鼠行走時身體向兩側(cè)傾倒；4分：不能行走，存在意識喪失。0分和4分為建模失敗被剔除，實驗過程中保持各亞組均為6只大鼠。

1.4BNDF和NGF含量的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測 取各組大鼠腦組織進行ELISA檢測，先應用1%戊巴比妥鈉過量麻醉，快速斷頭冰上取腦，剝離大鼠大腦雙側(cè)皮質(zhì)，冰生理鹽水沖洗，用濾紙吸干后稱重，保存在-80度。每組取缺血腦組織，加入生理鹽水制成10%的大鼠腦組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液待用?？杀４嬗?80℃冰箱內(nèi)待測。按照說明書進行ELISA法檢測各組大鼠腦組織BNDF和GDNF的含量。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 造模3 d后，取各組大鼠海馬組織，HE染色法鏡下觀察大鼠海馬組織學改變。

1.6CXCR4和β-catenin的Western印跡法檢測 首先取各組大鼠海馬組織，20 mg海馬組織加入200 μl裂解液，快速剪碎組織，冰上裂解半小時，充分裂解后4℃離心12 000 r/min,10 min，取上清液。先測定蛋白濃度確定上樣量。電泳分離蛋白恒壓80 V 1.5～2.0 h，轉(zhuǎn)膜恒壓70 V轉(zhuǎn) 2 h，牛奶室溫封閉40 min，一抗(CXCR4 1∶200或β-catenin 1∶200)4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3～4次，每次10～15 min，二抗25℃孵育2 h，1×TBST洗膜3～4次，每次10～15 min，采用超敏化學發(fā)光試劑。曝光2～5 min后保存圖片，應用Image J軟件對目的蛋白條帶進行灰度值測定，檢測各組大鼠腦組織CXCR4和β-catenin的表達情況。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HE染色評估組織學改變 假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元排列整齊、數(shù)量密集；模型組的細胞腫脹，分布不均，細胞周圍的間隙變寬，神經(jīng)元變性；相較于模型組，通過氣味穿梭箱訓練后海馬組織神經(jīng)元存活的數(shù)量增多，神經(jīng)元的腫脹減少，細胞形態(tài)有顯著改善(圖1)。

圖1 HE染色檢測各組缺血再灌注3 d海馬組織學改變(×400)

2.2BNDF和NGF含量 與假手術(shù)組比較，其余兩組腦組織中BNDF和NGF含量明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，訓練組腦組織BNDF和NGF含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組腦缺血后腦組織中BNDF和NGF含量

2.3氣味訓練對CXCR4的影響 假手術(shù)組海馬組織僅見CXCR4微量表達。模型組7 d時，缺血海馬CXCR4表達較前明顯增多，之后隨著缺血再灌注后時間延長CXCR4表達呈減少趨勢。 訓練組與模型組比較，3、7、14、21 d CXCR4表達均明顯增多(P<0.05)。見圖2，表2。

2.4氣味訓練對β-catenin的影響 假手術(shù)組海馬組織β-catenin有微量表達。模型組7 d、14 d β-catenin含量較3 d顯著增加，21 d β-catenin較14 d顯著下降(P<0.05)。訓練組3、7、14、21 d β-catenin表達均較模型組顯著增加(P<0.05)。模型組3、7、14、21 d β-catenin表達較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 Western印跡法檢測缺血再灌注海馬CXCR4和β-catenin的表達

表2 各組腦缺血后不同時間海馬組織CXCR4及β-actenin表達的光密度值

3 討 論

血管性癡呆VD是由一系列腦組織缺血和缺氧引起的癡呆綜合征，以智力減退、表情冷漠、性格和情緒轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)〔8，9〕。本研究表明，氣味穿梭箱訓練可以降低訓練組大鼠的神經(jīng)行為學評分，可以提高BNDF和GDNF在腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中的含量。由此可以推測，氣味穿梭訓練可以通過提高BDNF的表達從而發(fā)揮對于缺血腦組織保護的作用。

CXCR4是基質(zhì)細胞衍生因子(SDF)-1的唯一受體，是由352個氨基酸構(gòu)成的具有七跨膜 G 蛋白耦聯(lián)受體。主要表達于外周血淋巴細胞、樹突細胞、神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細胞等。CXCR4參與體內(nèi)多種生理和病理機制，包括參與胚胎發(fā)育、造血功能、人類免疫缺陷病毒(HIV)-1 侵染和腫瘤增殖侵襲等。研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠SDF-1 或 CXCR4 基因后，在個體發(fā)育過程中顆粒細胞分布在小腦的異位位置和海馬齒狀回的形態(tài)發(fā)生改變；SDF-1/CXCR4 軸是形成大腦皮層的γ-氨基丁酸(GABA)中間神經(jīng)元的募集者〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)CXCR4 的表達在體外和體內(nèi)均可被微小RNA-9抑制，通過調(diào)控CXCR4表達抑制 Wnt/β-catenin 信號通路進而抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖，說明SDF-1/CXCR4信號通路影響Wnt/β-catenin通路并起重要作用〔11〕。

Wnt/β-catenin 信號通路在神經(jīng)再生領(lǐng)域里起重要作用。在干細胞表面Wnt 蛋白信號和Frizzled受體及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRPs)的結(jié)合，通過召集基因轉(zhuǎn)移酶(KAT3)的活化因子環(huán)磷腺苷應答元件結(jié)合蛋白(CREB)錨定蛋白(CBP)激活轉(zhuǎn)錄因子 β-catenin 的轉(zhuǎn)錄，從而促進干細胞分化相關(guān)基因的表達〔12，13〕。

研究表明〔14〕，模型組大鼠缺血再灌注后第3 d海馬神經(jīng)干細胞數(shù)開始增加，隨著再灌注后時間的延長逐漸增多，在缺血再灌注后的第7天時神經(jīng)干達到高峰，隨后又慢慢減少，表明血管性癡呆大鼠海馬可以新生神經(jīng)元。大鼠腦缺血再灌注后時間的增加，CXCR4 7 d持續(xù)高表達水平，β-catenin的表達逐漸增加，在14 d時表達水平最高。CXCR4和β-catenin的表達具有時間依賴性，分析內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖進程，說明這兩種蛋白在神經(jīng)干細胞增殖中都起到了調(diào)控作用。另外，本次實驗還觀察氣味穿梭箱訓練對于大鼠腦缺血再灌注后CXCR4和β-catenin表達的影響。從實驗數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，與模型組相比，訓練組大鼠海馬CXCR4和β-catenin表達明顯增加，從另一方面探討氣味訓練對神經(jīng)干細胞增殖分化的作用機制。