李莉華 鄭凝

(天津市北辰醫(yī)院，天津 300400)

毒性彌漫性甲狀腺腫(GD)是一種自身抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，可導(dǎo)致甲狀腺激素過度產(chǎn)生并因此引起全身代謝級(jí)聯(lián)功能異常。女性GD發(fā)病率更高，每年的發(fā)病率約為14/10萬(wàn)〔1，2〕，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。目前GD的發(fā)病機(jī)制仍不明確。有學(xué)者提出T淋巴細(xì)胞，主要為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在疾病發(fā)生發(fā)展起作用，也有研究發(fā)現(xiàn)Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)體內(nèi)平衡在多種自身免疫性疾病中被破壞〔3〕。Treg細(xì)胞是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T細(xì)胞亞群，有研究報(bào)道Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子與多種免疫性疾病的發(fā)生關(guān)系密切，其異常表達(dá)可導(dǎo)致自身免疫性疾病〔4，5〕。GD目前常見的治療方式包括抗甲狀腺藥物、放射性碘(RAI)治療、手術(shù)治療等。131I治療其療效好，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，在中國(guó)有超過半數(shù)的醫(yī)師選擇131I治療，因此如何提高131I治療有效率在中國(guó)臨床實(shí)踐中意義重大，本研究探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞缺陷程度對(duì)GD療效及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016～2018年于天津市北辰醫(yī)院門診行131I治療的GD患者40例，男19例，女21例，年齡61～75歲，患者一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。分別在第3、6、12個(gè)月進(jìn)行治療隨訪，收集患者基本信息及臨床數(shù)據(jù)，停藥后所有入組患者進(jìn)行18個(gè)月隨訪記錄患者復(fù)發(fā)情況，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署了知情同意書。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 符合GD診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕：①臨床甲亢癥狀和體征。②甲狀腺?gòu)浡阅[大(觸診和B超證實(shí))，少數(shù)病例可以無(wú)甲狀腺腫大。③血清促甲狀腺激素(TSH)濃度降低，甲狀腺激素濃度升高。④眼球突出和其他浸潤(rùn)性眼征。⑤脛前黏液性水腫。⑥甲狀腺TSH受體抗體(TRAb或TSAb)陽(yáng)性。以上標(biāo)準(zhǔn)中，①②③項(xiàng)為診斷必備條件，④⑤⑥項(xiàng)為診斷輔助條件；排除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤；②炎癥性疾??；③長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑者。

1.3方法

1.3.1治療方法 所有入組患者選擇針對(duì)性治療方案，由專業(yè)醫(yī)師先通過B超測(cè)量甲狀腺各徑線，對(duì)體積進(jìn)行估算，甲狀腺質(zhì)量(g)的計(jì)算公式：0.479×甲狀腺體積〔V(cm3)=a×b×c，a、b、c分別代表長(zhǎng)寬厚，雙葉甲狀腺之和為體積〕。依據(jù)患者的甲狀腺吸碘率及甲狀腺質(zhì)量計(jì)算劑量，131I治療劑量(Bq或mCi)=計(jì)劃量(Bq或mCi/g甲狀腺組織)×甲狀腺質(zhì)量(g)×100/甲狀腺最高(或24 h)攝131I率(%)，同時(shí)在治療過程中隨時(shí)根據(jù)患者年齡、甲狀腺大小、軟硬度、是否有結(jié)節(jié)等因素調(diào)整劑量，治療方式除特殊情況一般為單次空腹口服，本研究的131I治療劑量均值為在(2.71±2.53)mCi。

1.3.2療效評(píng)價(jià) 本研究中治療結(jié)局符合中國(guó)131I治療格雷夫斯甲亢指南(2013版)〔7,8〕，131I治療GD療效的標(biāo)準(zhǔn)〔9〕。①完全緩解：恢復(fù)正常，無(wú)甲亢癥狀和血清游離三碘甲腺原氨酸(FT3)，血清游離甲狀腺素(FT4)正常；②部分緩解：甲亢癥狀和體征減輕，F(xiàn)T3、FT4明顯降低，未降至正常；③無(wú)效：患者癥狀和體征無(wú)改善或加重，F(xiàn)T3、FT4無(wú)明顯降低；④復(fù)發(fā)：131I治療后完全緩解，再次出現(xiàn)甲亢癥狀及體征，血清甲狀腺素水平再次升高；⑤甲狀腺功能減退癥(甲減)：甲減的癥狀和體征，甲狀腺激素水平低于正常。治療有效為完全緩解和部分緩解之和。

1.3.3外周血FT3、FT4、TSH、TRAb檢測(cè) 空腹抽取靜脈血后離心，吸取血清后用放射免疫法測(cè)定(醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科采用美國(guó)Diasorin公司檢測(cè)盒檢測(cè))。判定標(biāo)準(zhǔn)：FT3正常值范圍：3.18～9.22 pmol/L；FT4正常值范圍：8.56～25.60 pmo/L；TSH正常值范圍：0.3～5.0 IU/ml；TRAb正常值范圍<9 U/L，陽(yáng)性>14 U/L，兩者之間為可疑需要進(jìn)行定期復(fù)查。

1.3.4外周血淋巴細(xì)胞亞群分析 流式細(xì)胞儀抗體和試劑均購(gòu)自美國(guó)加利福尼亞州圣地亞哥的BioLegend。Ficoll-Paque密度梯度離心分離獲得單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)約為1×106/ml，用僵尸紅可固定活細(xì)胞試劑盒(BioLegend77475)清除死細(xì)胞后，用APCCY7-CD49b(103116)、PEC5.5-CD4(100434)、PECY7-CD8(100722)、染色20 min，固定通透性(421402)后用FITC-GZMB(372206)，Treg細(xì)胞需要FOXP3破膜，抗體染色細(xì)胞內(nèi)GZMB用facs-dxp-athenatm(Cytek，美國(guó))分析染色細(xì)胞，其中PEC5.5-CD4水平代表CD4+T細(xì)胞水平，PECY7-CD8水平代表CD8+T細(xì)胞水平，APCCY7-CD49b-FOXP3水平代表Treg細(xì)胞水平。數(shù)據(jù)用Flow Jo10.0軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.3.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β，白細(xì)胞介素(IL)-10濃度 檢測(cè)ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，使用方法是標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣，隨后加樣：分別設(shè)空白孔(不加樣品)及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測(cè)樣品孔。然后溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。最后洗滌加酶后運(yùn)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算樣品中細(xì)胞因子TGF-β，IL-10的濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1GD患者治療前后甲狀腺功能比較 治療后，GD患者FT3、FT4水平及TRAb陽(yáng)性率均明顯低于治療前，且隨著治療時(shí)間不斷下降；TSH水平明顯高于治療前，且隨著治療時(shí)間不斷升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 GD患者治療前后甲狀腺功能比較

2.2131I治療療效隨訪 治療3個(gè)月隨訪，治療有效31例(77.50%)；治療6個(gè)月隨訪，治療有效33例(82.50%)；治療12個(gè)月隨訪，治療有效37例(92.50%)，隨著131I治療時(shí)間的延長(zhǎng)，治療有效率也隨之增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3治療前后淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平比較 經(jīng)131I治療后，淋巴細(xì)胞亞群CD4+和CD8+上升，CD4+/CD8+的比例也呈上升趨勢(shì)，慢慢接近正常比值，Treg細(xì)胞的水平也隨著治療逐漸升高，治療3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月后的檢測(cè)與治療前比較明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGF-β隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)而上升，而IL-10降低，在治療3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月后的檢測(cè)與治療前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 GD治療前后淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平比較

2.4治療后隨訪復(fù)發(fā)情況 治療后經(jīng)過隨訪18個(gè)月，復(fù)發(fā)率為5%，相較于未復(fù)發(fā)患者，復(fù)發(fā)患者群體Treg細(xì)胞呈低水平狀態(tài)，IL-10水平更高，TGF-β水平更低(P<0.05)。見表3。

表3 治療后隨訪復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子水平比較

3 討 論

GD疾病的發(fā)病機(jī)制可能與免疫功能T淋巴細(xì)胞的失衡有關(guān)，當(dāng)CD4+T細(xì)胞受到某些炎性因子的刺激后，從而分化為Th0細(xì)胞，此后可進(jìn)一步分化為Th1和Th2，分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫。CD8+T細(xì)胞代表著T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞亞群，CD4+T/CD8+T細(xì)胞比例可以作為疾病一個(gè)重要觀測(cè)指標(biāo)〔10〕，國(guó)外學(xué)者報(bào)道通過采用流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞亞群參與了甲狀腺免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展〔10〕，其他研究也報(bào)道了甲狀腺疾病中存在淋巴細(xì)胞特別是Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用減弱〔11〕。Treg細(xì)胞是調(diào)節(jié)型淋巴細(xì)胞，主要通過釋放IL-10等在疾病免疫中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔12〕，已有研究報(bào)道Treg在不同免疫介導(dǎo)和感染性疾病的發(fā)病機(jī)制起作用如糖尿病、食物過敏、多發(fā)性硬化、惡性疾病等，在Treg發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)細(xì)胞因子IL-10，TGF-β也認(rèn)為與其功能發(fā)揮密切相關(guān)〔13〕。GD患者的特征是產(chǎn)生自身抗體TRAb。隨著長(zhǎng)期治療，血清TRAb濃度下降，但在一些患者，盡管臨床穩(wěn)定，TRAb持續(xù)多年是否構(gòu)成一個(gè)可通過循環(huán)淋巴細(xì)胞表型分析識(shí)別的患者淋巴細(xì)胞亞群，一直待探索〔14，15〕，IL-10及TGF-β的水平高低及活躍程度一直被認(rèn)為與GD疾病活動(dòng)度正相關(guān)〔16，17〕。

131I治療療效可能是通過治療產(chǎn)生的射線從而破壞組織，壞死的組織同時(shí)會(huì)造成相關(guān)的抗原耗竭，與此同時(shí)組織中活化的T細(xì)胞與相關(guān)細(xì)胞因子也受到清除〔18〕；療效的改善可能與系統(tǒng)免疫功能受到抑制被迅速糾正，從而免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)能夠重新建立，Treg細(xì)胞抑制狀態(tài)改善后將重新恢復(fù)其維持免疫系統(tǒng)〔19〕。但與甲狀腺功能恢復(fù)完全正常相比，免疫系統(tǒng)重新達(dá)到平衡過程較慢，所需時(shí)間較長(zhǎng)，在停止治療后仍有5%患者復(fù)發(fā)，本研究通過流式檢測(cè)觀察到復(fù)發(fā)的患者Treg細(xì)胞水平仍受到抑制，ELISA示相關(guān)細(xì)胞因子復(fù)發(fā)患者仍偏離正常。